Nobel Ödülü'nü aldı.

Yöntemi kullanmaya başlarken, her ısıtma-soğutma döngüsünden sonra reaksiyon karışımına DNA polimeraz ilave edilmesi gerekmiştir, çünkü reaksiyon sırasında inaktive olmuştur. Yüksek sıcaklık DNA sarmalının ipliklerini ayırmak için gereklidir. Reaksiyon prosedürü nispeten verimsizdi, çok fazla zaman ve enzim gerektiriyordu. 1986'da polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi önemli ölçüde geliştirildi. Termofilik bakterilerden elde edilen DNA polimerazlarının kullanılması önerilmiştir. Bu enzimlerin termostabil olduğu kanıtlandı ve birçok reaksiyon döngüsüne dayanabildi. Kullanımları, PCR'yi basitleştirmeyi ve otomatikleştirmeyi mümkün kıldı. İlk termostabil DNA polimerazlardan biri bakterilerden izole edildi. termos aquaticus ve adlandırılmış tak-polimeraz. Bu polimerazın dezavantajı, bu enzimin hata düzeltme mekanizmalarından (3" → 5" eksonükleaz aktivitesi) yoksun olması nedeniyle hatalı bir nükleotidin girme olasılığının oldukça yüksek olmasıdır. polimerazlar pfu ve Pwo, arkelerden izole edilmiş, böyle bir mekanizmaya sahiptir, kullanımları DNA'daki mutasyonların sayısını önemli ölçüde azaltır, ancak çalışmalarının hızı (işlemsellik) daha düşüktür. tak. Şu anda karışımlar kullanılıyor tak ve pfu hem yüksek bir polimerizasyon hızı elde etmek hem de yüksek hassasiyet kopyalama.

Yöntemin icadı sırasında, Cary Mullis, PCR yönteminin patentini alan Cetus Corporation'da sentetik bir kimyager olarak çalıştı (daha sonra genomik DNA ile hibridizasyon yoluyla nokta mutasyonlarını tespit etmek için kullanılan oligonükleotitleri sentezledi). 1992'de Cetus, yöntemin haklarını ve kullanım patentini sattı. tak polimeraz şirketi Hoffman-La Roche'u 300 milyon dolara satın aldı. Ancak, ortaya çıktı ki tak-polimeraz, 1980'de Sovyet biyokimyacıları A. Kaledin, A. Slyusarenko ve S. Gorodetsky tarafından ve ayrıca bu Sovyet yayınından 4 yıl önce, yani 1976'da Amerikalı biyokimyacılar Alice Chien, David B. Edgar ve John M. Trela. Bu bağlamda, Promega (Promega) şirketi mahkemede Roche'u bu enzimin münhasır haklarından vazgeçmeye zorlamaya çalıştı. PCR yöntemi için Amerikan patenti Mart 2005'te sona erdi.

PCR yürütmek

Yöntem, DNA'nın belirli bir bölümünün, DNA'daki enzimler yardımıyla tekrarlanan seçici kopyalanmasına dayanmaktadır. yapay koşullar (laboratuvar ortamında). Bu durumda, yalnızca belirtilen koşulları sağlayan alan ve yalnızca incelenen örnekte mevcutsa kopyalanır. Canlı organizmalardaki DNA amplifikasyonunun (replikasyon) aksine, DNA'nın nispeten kısa bölümleri PCR kullanılarak amplifiye edilir. Geleneksel bir PCR işleminde, kopyalanmış DNA bölgelerinin uzunluğu 3000 baz çiftinden (3 kbp) fazla değildir. Farklı polimerazların bir karışımı yardımıyla, katkı maddeleri kullanılarak ve belirli koşullar altında PCR fragmanının uzunluğu 20-40 bin baz çiftine ulaşabilir. Bu hala ökaryotik bir hücrenin kromozomal DNA'sının uzunluğundan çok daha azdır. Örneğin, insan genomu yaklaşık 3 milyar baz çifti uzunluğundadır.

Reaksiyon bileşenleri

PCR için en basit durumda aşağıdaki bileşenler gereklidir:

DNA şablonu, amplifiye edilmesi gereken DNA bölümünü içerir.
İki primer, istenen DNA parçasının farklı ipliklerinin zıt uçlarına tamamlayıcı.
termostabil DNA polimeraz DNA'nın polimerizasyonunu katalize eden bir enzimdir. PCR'de kullanım için polimeraz yüksek sıcaklıkta aktif kalmalıdır uzun zaman, bu nedenle, termofillerden izole edilen enzimler kullanılır - termos aquaticus(Taq polimeraz), pirokok furiosus(Pfu polimeraz), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeraz) ve diğerleri.
deoksiribonükleosit trifosfatlar(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Polimerazın çalışması için gerekli Mg2+ iyonları.
tampon çözelti, gerekli reaksiyon koşullarının sağlanması - pH, çözeltinin iyonik gücü. Tuzlar, sığır serum albümini içerir.

Reaksiyon karışımının buharlaşmasını önlemek için, test tüpüne vazelin gibi yüksek kaynama noktalı bir yağ eklenir. Isıtmalı bir kapak döngüleyici kullanılıyorsa bu gerekli değildir.

Pirofosfataz ilavesi, PCR reaksiyonunun verimini artırabilir. Bu enzim, büyüyen DNA zincirine nükleotid trifosfatların eklenmesinin bir yan ürünü olan pirofosfatın ortofosfata hidrolizini katalize eder. Pirofosfat, PCR reaksiyonunu engelleyebilir.

Primerler

PCR'nin özgüllüğü, şablon ve primerler arasında 18-30 baz uzunluğunda kısa sentetik oligonükleotidler arasında tamamlayıcı komplekslerin oluşumuna dayanır. Primerlerin her biri, çift sarmallı şablonun zincirlerinden birine tamamlayıcıdır ve amplifiye bölgenin başlangıcını ve sonunu sınırlar.

Şablonun primer ile hibridizasyonundan sonra (tavlama), ikincisi şablonun tamamlayıcı ipliğinin sentezinde DNA polimeraz için bir primer görevi görür (bkz.).

Primerlerin en önemli özelliği primer-matris kompleksinin erime noktasıdır (Tm).

Tm, DNA şablonlarının yarısının oligonükleotid primeri ile bir kompleks oluşturduğu sıcaklıktır. K + iyonlarının ve DMSO'nun konsantrasyonunu dikkate alarak kısa bir oligonükleotit (ve uzun DNA fragmanları için) için Tm'yi hesaplamak için ortalama formül:

burada L primerdeki nükleotid sayısıdır, K+ potasyum iyonlarının molar konsantrasyonudur, G+C tüm guaninlerin ve sitozinlerin toplamıdır.

Primerin uzunluğu ve nükleotid bileşimi veya tavlama sıcaklığı yanlış seçilirse, şablon DNA'nın diğer bölgeleriyle kısmen tamamlayıcı komplekslerin oluşumu mümkündür, bu da spesifik olmayan ürünlerin ortaya çıkmasına neden olabilir. Erime sıcaklığının üst sınırı, aktivitesi 80 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda düşen polimerazın optimum etki sıcaklığı ile sınırlıdır.

Astar seçerken, aşağıdaki kriterlere uyulması arzu edilir:

amplifikatör

Pirinç. bir: PCR döngüleyici

PCR, bir amplifikatörde gerçekleştirilir - genellikle en az 0.1 ° C doğrulukla test tüplerinin periyodik olarak soğutulmasını ve ısıtılmasını sağlayan bir cihaz. Modern döngüleyiciler, "sıcak başlatma", Touchdown PCR (aşağıya bakın) ve ardından amplifiye moleküllerin 4 °C'de depolanması dahil olmak üzere karmaşık programlar ayarlamanıza olanak tanır. Gerçek zamanlı PCR için floresan dedektörlü cihazlar üretilir. Cihazlar ayrıca otomatik kapaklı ve mikroplaka bölmesiyle de mevcuttur ve bu sayede otomatik sistemlere entegre edilebilirler.

Reaksiyon ilerlemesi

Marker DNA (ilk ve son yuvalar) ve PCR ürünleri içeren bir jelin fotoğrafı

Genellikle, PCR sırasında, her biri üç aşamadan oluşan 20-35 döngü gerçekleştirilir (Şekil 2).

denatürasyon

Çift iplikli DNA şablonu, DNA ipliklerinin ayrılmasına izin vermek için 0,5-2 dakika boyunca 94-96°C'ye (veya özellikle termostabil bir polimeraz kullanılıyorsa 98°C'ye) ısıtılır. Bu aşama denir denatürasyonçünkü iki DNA zinciri arasındaki hidrojen bağları kopmuştur. Bazen, ilk döngüden önce (polimeraz eklenmeden önce), şablon ve primerleri tamamen denatüre etmek için reaksiyon karışımı 2-3 dakika önceden ısıtılır. Böyle bir yaklaşım denir sıcak başlangıç, spesifik olmayan reaksiyon ürünlerinin miktarını azaltmaya izin verir.

tavlama

Şeritler ayrıldığında, primerlerin tek şeritli şablona bağlanmasına izin vermek için sıcaklık düşürülür. Bu aşama denir tavlama. Tavlama sıcaklığı, primerlerin bileşimine bağlıdır ve genellikle primerlerin erime sıcaklığına eşit olarak seçilir. Yanlış tavlama sıcaklığı seçimi, ya primerlerin şablona zayıf bağlanmasına (yüksek sıcaklıkta) ya da yanlış yerde bağlanmaya ve spesifik olmayan ürünlerin ortaya çıkmasına (düşük sıcaklıkta) yol açar. Tavlama aşamasının süresi 30 saniyedir, aynı zamanda, bu süre zarfında polimerazın birkaç yüz nükleotidi sentezlemek için zaten zamanı vardır. Bu nedenle, erime noktası 60 °C'nin üzerinde olan primerlerin seçilmesi ve aynı anda 60-72 °C'de tavlama ve uzama yapılması önerilir.

Uzama

DNA polimeraz, primeri bir primer olarak kullanarak şablon zinciri kopyalar. bu sahne uzama. Polimeraz, şablona bağlanan primerin 3" ucundan ikinci ipliğin sentezini başlatır ve şablon boyunca hareket ederek 5"den 3" ucuna doğru yeni bir iplik sentezler. 72°C. Uzama süresi, hem DNA polimerazın tipine hem de amplifiye edilen parçanın uzunluğuna bağlıdır. Tipik olarak, uzama süresi her bin baz çifti için bir dakika olarak alınır. Tüm döngülerden sonra, genellikle ek bir adım gerçekleştirilir. son uzama tüm tek sarmallı parçaları tamamlamak için. Bu aşama 7-10 dakika sürer.

Pirinç. 2: İlk PCR döngüsünün şematik gösterimi. (1) 94-96°C'de denatürasyon. (2) 68°C'de tavlama (örneğin). (3) 72°C'de uzama (P=polimeraz). (4) İlk döngü tamamlandı. Ortaya çıkan iki DNA dizisi bir sonraki döngü için bir şablon görevi görür, bu nedenle şablon DNA miktarı her döngü sırasında iki katına çıkar.

Spesifik reaksiyon ürününün miktarı (primerlerle sınırlı) teorik olarak 2n - 2n ile orantılı olarak artar, burada n reaksiyon döngülerinin sayısıdır. Aslında, her çevrimin verimliliği %100'den az olabilir, bu nedenle gerçekte P ~ (1+E) n , burada P ürün miktarıdır, E çevrimin ortalama verimliliğidir.

"Uzun" DNA kopyalarının sayısı da artar, ancak doğrusal olarak, bu nedenle reaksiyon ürünlerinde belirli bir parça baskındır.

Gerekli ürünün büyümesi, reaktiflerin miktarı, inhibitörlerin varlığı ve yan ürünlerin oluşumu ile katlanarak sınırlıdır. Reaksiyonun son döngülerinde büyüme yavaşlar, buna "plato etkisi" denir.

PCR çeşitleri

iç içe PCR(Nested PCR (eng.) ) - reaksiyonun yan ürünlerinin sayısını azaltmak için kullanılır. İki çift primer kullanın ve iki ardışık reaksiyon gerçekleştirin. İkinci primer çifti, birinci reaksiyonun ürünü içindeki DNA bölgesini büyütür.
ters PCR(Ters PCR (İngilizce) ) - istenen dizilimde yalnızca küçük bir alan biliniyorsa kullanılır. Bu yöntem, DNA genoma eklendikten sonra komşu dizilerin belirlenmesi gerektiğinde özellikle yararlıdır. Ters PCR'nin uygulanması için, kısıtlama enzimleri ile bir dizi DNA kesimi gerçekleştirilir, ardından fragmanların bağlanması (ligasyon) yapılır. Sonuç olarak, bilinen fragmanlar bilinmeyen bölgenin her iki ucundadır, bundan sonra PCR her zamanki gibi gerçekleştirilebilir.
ters transkripsiyon PCR(Ters Transkripsiyon PCR, RT-PCR (İngilizce) ) - bir RNA kitaplığından bilinen bir diziyi amplifiye etmek, izole etmek veya tanımlamak için kullanılır. Geleneksel PCR'den önce, terstaz kullanılarak mRNA şablonu üzerinde tek iplikli bir DNA molekülü sentezlenir ve PCR için şablon olarak kullanılan tek iplikli bir cDNA elde edilir. Bu yöntem genellikle bu genlerin nerede ve ne zaman ifade edildiğini belirler.
asimetrik PCR(İngilizce) asimetrik PCR) - esas olarak orijinal DNA'nın zincirlerinden birinin amplifiye edilmesi gerektiğinde gerçekleştirilir. Bazı dizileme ve hibridizasyon analiz tekniklerinde kullanılır. Primerlerden birinin çok fazla alınması dışında PCR her zamanki gibi gerçekleştirilir. Bu yöntemin modifikasyonları İngilizce'dir. L kulakta- A sonrasında- T o- E xponential-PCR (LATE-PCR), farklı konsantrasyonlarda primerler kullanır ve düşük konsantrasyonlu primer, yüksek konsantrasyonlu primerden daha yüksek (erime noktası) ile seçilir. PCR, yüksek bir tavlama sıcaklığında gerçekleştirilir, böylece tüm döngüler boyunca reaksiyonun verimliliği korunur.
kantitatif PCR(Kantitatif PCR, Q-PCR) veya gerçek zamanlı PCR- her reaksiyon döngüsünde belirli bir PCR ürününün miktarının ölçümünü doğrudan izlemek için kullanılır. Bu yöntem, biriken reaksiyon ürününün miktarını doğru bir şekilde ölçmek için floresan etiketli primerler veya DNA probları kullanır; veya bir floresan interkalasyon boyası kullanılır sybr yeşil ben yani çift sarmallı DNA'ya bağlanır. sybr yeşil ben belirli floresan problara veya primerlere ihtiyaç duymadan gerçek zamanlı PCR tespiti ve PCR ürünlerinin miktar tayini için basit ve uygun maliyetli bir seçenek sunar. Amplifikasyon sırasında, boya SYBR Yeşil I PCR ürünlerinin DNA'sının küçük oluğuna entegre olur ve mavi bir lazerle ışınlandığında bağlanmamış boyadan daha güçlü bir floresan sinyali yayar. SYBR Yeşil I bilinen tüm gerçek zamanlı PCR cihazlarıyla uyumludur. için maksimum absorpsiyon SYBR Yeşil I 494 nm dalga boyundadır. Ana olana ek olarak, boya spektrumunda 290 nm ve 380 nm'de iki küçük ek absorpsiyon maksimumu vardır. için maksimum emisyon SYBR Yeşil I 521 nm (yeşil) dalga boyundadır.
Adım PCR(Touchdown PCR (İngilizce) ) - bu yaklaşımı kullanarak, primerlerin spesifik olmayan bağlanmasının etkisi azaltılır. İlk döngüler, optimum tavlama sıcaklığının üzerindeki bir sıcaklıkta gerçekleştirilir, daha sonra her birkaç döngüde tavlama sıcaklığı kademeli olarak optimuma düşürülür. Bu, primerin uzunluğu boyunca tamamlayıcı sarmal ile hibritleşmesini sağlamak içindir; oysa optimum tavlama sıcaklığında, primer tamamlayıcı sarmal ile kısmen hibritleşir. Primer için yeterli bağlanma bölgesi varsa, primerin genomik DNA üzerinde kısmi hibridizasyonu spesifik olmayan amplifikasyona yol açar. Çoğu durumda, ilk on PCR döngüsü 72-75°C'lik bir tavlama sıcaklığında gerçekleştirilebilir ve ardından hemen optimuma, örneğin 60-65°C'ye düşürülebilir.
Moleküler koloni yöntemi(jel içinde PCR) Koloni-PCR Kolonisi) - Akrilamid jel, yüzeydeki tüm PCR bileşenleri ile polimerize edilir ve PCR gerçekleştirilir. Analiz edilen DNA'yı içeren noktalarda, moleküler kolonilerin oluşumu ile amplifikasyon gerçekleşir.
cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu ile PCR(İngilizce) cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu, RACE-PCR ).
Uzun parçaların PCR'si(İngilizce) Uzun menzilli PCR) - genişletilmiş DNA segmentlerinin amplifikasyonu için PCR modifikasyonu (10 bin veya daha fazla baz). Biri yüksek işlenebilirliğe sahip (yani uzun bir DNA zincirini tek geçişte sentezleyebilen) bir Taq polimeraz ve ikincisi 3 "-5" eksonükleaz aktivitesine sahip bir DNA polimeraz olan iki polimeraz karışımı kullanılır, genellikle Pfu polimeraz. Taq polimeraz, tamamlayıcı olmayan bir nükleotid eklendiğinde DNA sentezini durdurduğundan, birincinin neden olduğu hataları düzeltmek için ikinci polimeraz gereklidir. Bu tamamlayıcı olmayan nükleotit, Pfu polimeraz tarafından çıkarılır. Polimeraz karışımı 50:1 veya 100:1'den daha düşük bir oranda alınır, burada Taq polimeraz Pfu polimeraza göre 25-100 kat daha fazla alınır.
RAPD(İngilizce) Polimorfik DNA'nın Rastgele Amplifikasyonu ), polimorfik DNA'nın rastgele amplifikasyonu ile PCR - genetik dizilimdeki benzer organizmaları, örneğin farklı çeşitleri ayırt etmek gerektiğinde kullanılır. ekili bitkiler, köpek ırkları veya yakından ilişkili mikroorganizmalar. Bu yöntem genellikle bir astar kullanır küçük boy(yaklaşık 10 bp). Bu primer, incelenen organizmaların rastgele DNA bölgelerine kısmen tamamlayıcı olacaktır. Koşulları (primer uzunluğu, primer bileşimi, sıcaklık vb.) seçerek, iki organizma için PCR modelinde tatmin edici bir fark elde etmek mümkündür.
Gruba özel PCR(İngilizce) gruba özgü PCR) - Bu dizilere konservatif primerler kullanarak aynı veya farklı türler arasındaki ilgili diziler için PCR. Örneğin, ribozomal için evrensel primerlerin seçimi 18S ve 26S türe özgü intergenik aralayıcının amplifikasyonu için genler: gen dizisi 18S ve 26S türler arasında muhafazakardır, bu nedenle bu genler arasındaki PCR, çalışılan tüm türler için gerçekleşecektir. Bu yöntemin tersi - benzersiz PCR(İngilizce) benzersiz PCR), burada görev, ilgili diziler arasından yalnızca belirli bir diziyi amplifiye etmek için primerleri seçmektir.
Sıcak başlatma kullanan PCR(İngilizce) Sıcak başlangıç PCR) - DNA polimeraz kullanılarak PCR'nin modifikasyonu, ki burada polimeraz aktivitesi, oda sıcaklığında antikorlar veya Affibody gibi antikorları taklit eden küçük moleküller tarafından bloke edilir, yani PCR'deki ilk denatürasyondan önce reaksiyon sırasında. Tipik olarak, ilk denatürasyon 95°C'de 10 dakika süreyle gerçekleştirilir.
sanal PCR(eng. in silico PCR, dijital PCR, elektronik PCR, e-PCR) - çalışılan genomun potansiyel DNA amplifikasyonunu tahmin etmek için bir primer dizileri (veya DNA probları) listesi kullanarak teorik bir polimeraz zincir reaksiyonunun bilgisayar analizi için matematiksel bir yöntem , kromozom, dairesel DNA veya başka herhangi bir DNA parçası.

Şablonun nükleotid dizisi kısmen biliniyorsa veya hiç bilinmiyorsa, dejenere primerler dizisi, herhangi bir baz içerebilen dejenere pozisyonlar içeren. Örneğin, primer dizisi şöyle olabilir: …ATH…, burada N - A, T veya C.

PCR uygulaması

PCR birçok alanda analiz ve bilimsel deneylerde kullanılmaktadır.

kriminalistik

PCR, sözde "genetik parmak izlerini" karşılaştırmak için kullanılır. Suç mahallinden bir genetik materyal örneği gereklidir - kan, tükürük, meni, saç vb. Şüphelinin genetik materyali ile karşılaştırılır. Teorik olarak çok az miktarda DNA yeterlidir - bir kopya. DNA parçalar halinde kesilir, ardından PCR ile amplifiye edilir. Parçalar, DNA elektroforezi ile ayrılır. DNA bantlarının düzenlenişinin ortaya çıkan resmine denir. genetik parmak izi(İngilizce) genetik parmak izi).

babalık kurmak

Pirinç. 3: PCR ile amplifiye edilmiş DNA fragmanlarının elektroforez sonuçları. (1) baba. (2) Çocuk. (3) Anne. Çocuk, her iki ebeveynin genetik damgasının bazı özelliklerini miras aldı ve bu da yeni, benzersiz bir damga verdi.

"Genetik parmak izleri" benzersiz olsa da (tek yumurta ikizleri hariç), bu tür birkaç parmak izi yapılarak aile bağları kurulabilir (Şekil 3). Aynı yöntem, organizmalar arasında evrimsel ilişkiler kurmak için küçük değişikliklerle uygulanabilir.

Tıbbi teşhis

PCR, kalıtsal ve viral hastalıkların teşhisini önemli ölçüde hızlandırmayı ve kolaylaştırmayı mümkün kılar. Arzu edilen gen, uygun primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir ve daha sonra mutasyonları belirlemek için dizilenir. Viral enfeksiyonlar, enfeksiyondan hemen sonra, hastalığın semptomları ortaya çıkmadan haftalar veya aylar önce tespit edilebilir.

Kişiselleştirilmiş tıp

Bazen ilaçlar bazı hastalar için toksik veya alerjiktir. Bunun nedenleri kısmen, ilaçların ve türevlerinin duyarlılığı ve metabolizmasındaki bireysel farklılıklardır. Bu farklılıklar genetik düzeyde belirlenir. Örneğin, bir hastada belirli bir sitokrom (yabancı maddelerin metabolizmasından sorumlu bir karaciğer proteini) daha aktif, diğerinde daha az olabilir. Belirli bir hastanın ne tür bir sitokroma sahip olduğunu belirlemek için ilacı kullanmadan önce bir PCR analizi yapılması önerilir. Bu analize ön genotipleme denir. olası genotipleme).

gen klonlama

Gen klonlama (organizmaların klonlanmasıyla karıştırılmamalıdır), genlerin izole edilmesi ve genetik mühendisliği manipülasyonlarının bir sonucu olarak belirli bir genin büyük bir ürününün elde edilmesi işlemidir. PCR, genin amplifiye edilmesi için kullanılır ve daha sonra genin genine eklenir. vektör- yabancı bir geni aynı veya büyümeye uygun başka bir organizmaya aktaran bir DNA parçası. Vektörler olarak örneğin plazmitler veya viral DNA kullanılır. Genlerin yabancı bir organizmaya yerleştirilmesi genellikle bu genin bir ürününü - RNA'yı veya çoğu zaman bir proteini elde etmek için kullanılır. Bu şekilde, tarımda, tıpta vb. kullanım için endüstriyel miktarlarda birçok protein elde edilir.

Pirinç. dört: Bir plazmit kullanarak gen klonlama.
(1) A organizmasının kromozomal DNA'sı. (2) PCR. (3) Organizma A'nın geninin çoklu kopyaları. (4) Genin bir plazmide eklenmesi. (5) A organizmasının geni ile plazmit. (6) Plazmitin B organizmasına dahil edilmesi. (7) B organizmasında A organizmasının geninin kopya sayısının çoğaltılması.

DNA dizilimi

Floresan etiket veya radyoaktif izotop ile etiketlenmiş dideoksinükleotitlerin kullanıldığı dizileme yönteminde, PCR ayrılmaz bir parçadır, çünkü polimerizasyon sırasında bir floresan veya radyoaktif etiketle etiketlenmiş nükleotitlerin türevleri DNA zincirine eklenir. Sentezlenen zincire bir dideoksinükleotidin eklenmesi, sentezi sonlandırır ve jelde ayrıldıktan sonra spesifik nükleotitlerin konumunun belirlenmesine izin verir.

mutajenez

Şu anda, PCR, mutajenez (DNA'nın nükleotid dizisindeki değişikliklere neden olan) yürütmek için ana yöntem haline gelmiştir. PCR kullanımı, mutajenez prosedürünü basitleştirmeyi ve hızlandırmayı ve aynı zamanda daha güvenilir ve tekrarlanabilir hale getirmeyi mümkün kıldı.

polimeraz zincirleme tepki(PCR)

PCR yönteminin özü. DNA polimeraz

Polimeraz zincir reaksiyonu, biyolojik bir materyaldeki belirli nükleik asit fragmanlarının küçük konsantrasyonlarında önemli bir artış elde etmeyi sağlayan deneysel bir moleküler biyoloji yöntemidir. DNA'nın kopya sayısını artırma işlemine denir. amplifikasyon. PCR sırasında DNA kopyalama özel bir enzim tarafından gerçekleştirilir - polimeraz. DNA polimeraz (Şekil 3) DNA'nın replikasyonunda (canlı organizmalarda DNA amplifikasyonu) yer alan bir enzimdir. Bu sınıfın enzimleri, enzimin "okuduğu" ve bir şablon olarak kullandığı DNA nükleotid zinciri boyunca deoksiribonükleotitlerin polimerizasyonunu katalize eder. Yeni bir nükleotidin tipi, okumanın gerçekleştirildiği şablonla tamamlayıcılık ilkesine göre belirlenir.

DNA polimeraz, birleştirilmiş zincirin 3" ucuna serbest nükleotidler ekler. Bu, zincirin 5"-3 yönünde uzamasına yol açar. Bilinen DNA polimerazların hiçbiri "sıfırdan" bir zincir oluşturamaz: bunlar sadece zaten var olan 3"-hidroksil grubuna nükleotidler ekleyebilir. Bu nedenle DNA polimerazın ihtiyaç duyduğu astar- incelenen genin uç bölümlerini tamamlayıcı kısa bir nükleotid dizisi (genellikle 20-25) - ilk nükleotidi ekleyebileceği. Primerler her zaman DNA ve RNA bazlarından oluşur, ilk iki baz her zaman RNA bazlarıdır. Primerler başka bir enzim tarafından sentezlenir - primaz. Bir diğer enzim ise sarmal- DNA replikasyonunun yarı muhafazakar modeline göre her iki zincirin replikasyonunu sağlayan tek zincirli bir yapının oluşumu ile DNA çift sarmalının çözülmesi için gereklidir.

Bazı DNA polimerazlar, yeni birleştirilmiş DNA zincirindeki hataları düzeltme yeteneğine de sahiptir. Yanlış bir nükleotid çifti tespit edilirse, DNA polimeraz bir adım geri döner, yanlış nükleotidi zincirden çıkarır, ardından doğru olanı yerine yerleştirir ve ardından replikasyon her zamanki gibi devam eder.

PCR yürütmek

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), belirli bir DNA dizisini birkaç saat içinde milyarlarca kez izole edip çoğaltabilen bir DNA amplifikasyon yöntemidir. elde etme imkanı büyük miktar Genomun kesin olarak tanımlanmış bir bölgesinin kopyaları, mevcut bir DNA örneğinin çalışılmasını büyük ölçüde basitleştirir.

Polimeraz zincir reaksiyonunun gerçekleşmesi için bir takım koşulların karşılanması gerekir. PCR için en basit durumda aşağıdaki bileşenler gereklidir:

Amplifiye edilecek DNA bölümünü içeren bir DNA şablonu.

İstenen parçanın uçlarını tamamlayan iki primer. (Hedef DNA'nın karşılık gelen bölgeleriyle aynı, genellikle 15 ila 30 bp boyutunda, yapay olarak sentezlenmiş bir çift oligonükleotit. Amplifikasyon reaksiyon ürünlerinin oluşumunda önemli bir rol oynarlar. Uygun şekilde seçilen primerler, testin özgüllüğünü ve duyarlılığını sağlar. sistem.)

Termostabil DNA polimeraz. PCR'de kullanılan polimerazın uzun süre yüksek sıcaklıkta aktif kalması gerekir, bu nedenle termofillerden izole edilen enzimler - Thermus aquaticus (Taq polimeraz) ve diğerlerinden kullanılır.

Deoksinükleotit trifosfatlar (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Polimerazın çalışması için gerekli Mg2+ iyonları.

Gerekli reaksiyon koşullarını sağlayan bir tampon çözelti - pH, çözeltinin iyonik gücü. Tuzlar, serum albümini içerir.

Reaksiyon karışımının buharlaşmasını önlemek için, test tüpüne vazelin gibi yüksek kaynama noktalı bir yağ eklenir. Isıtmalı kapaklı bir cihaz kullanılıyorsa bu gerekli değildir.

Orijinal DNA'nın kopya sayısını çoğaltmak için döngüsel bir reaksiyon gereklidir. Kural olarak, ardışık olarak tekrarlanan PCR döngülerinin her biri üç aşamadan oluşur:

1. DNA'nın denatürasyonu veya "erimesi".Çift sarmallı DNA şablonu, DNA zincirlerinin ayrılmasına izin vermek için 0,5 - 2 dakika boyunca 94 - 96°C'ye (veya özellikle termostabil bir polimeraz kullanılıyorsa 98°C'ye) ısıtılır. Bu aşamaya denatürasyon denir, çünkü iki DNA zinciri arasındaki hidrojen bağları kırılır. Bazen, ilk döngüden önce (polimeraz eklenmeden önce), şablon ve primerleri tamamen denatüre etmek için reaksiyon karışımı 2-5 dakika önceden ısıtılır. Bu yaklaşım denir sıcak başlangıç, spesifik olmayan reaksiyon ürünlerinin miktarını azaltmaya izin verir.

2. Tavlama - primerlerin şablon DNA'ya bağlanması. Şeritler ayrıldıktan sonra, primerlerin tek şeritli şablona bağlanmasına izin vermek için sıcaklık yavaşça düşürülür. Tavlama sıcaklığı, astar bileşimine bağlıdır ve genellikle 50–65 °C'de seçilir. Aşama süresi - 20 - 60 saniye. Yanlış tavlama sıcaklığı seçimi, ya primerlerin şablona zayıf bağlanmasına (yüksek sıcaklıkta) ya da yanlış yerde bağlanmaya ve spesifik olmayan ürünlerin ortaya çıkmasına (düşük sıcaklıkta) yol açar.

3. sentez (zincir uzaması). DNA polimeraz, primeri bir "tohum" olarak kullanarak şablon zinciri kopyalar. Polimeraz, şablona bağlanan ve şablon boyunca hareket eden primerin 3" ucundan ikinci ipliğin sentezini başlatır. Uzama sıcaklığı polimeraza bağlıdır. Yaygın olarak kullanılan Taq ve Pfu polimerazları en çok 72'de aktiftir. °C amplifiye edilecek parçanın uzunluğu Tipik olarak, uzama süresi her bin baz çifti için bir dakika olarak alınır Tüm döngüler tamamlandıktan sonra, genellikle ek bir adım gerçekleştirilir son uzama tüm tek sarmallı parçaları tamamlamak için. Bu aşama 7 - 10 dakika sürer.

Ardından denatürasyon, tavlama ve uzama aşamaları birçok kez (30 veya daha fazla) tekrarlanır. Her döngüde, bir DNA parçasının sentezlenen kopyalarının sayısı iki katına çıkar.

Tüm reaksiyonlar, bir termostata batırılmış test tüplerinde gerçekleştirilir. Sıcaklık rejiminin değiştirilmesi ve bakımı otomatik olarak gerçekleştirilir.

PCR sırasında belirli bir DNA segmentinin amplifikasyonunun tam olarak nasıl gerçekleştiğini anlamak için, her turda amplifiye edilebilir zincirlerdeki tüm primerlerin pozisyonunu ve tamamlayıcı dizilerini açıkça anlamak gerekir. İlk turda, yeni sentezlenen zincirlerin her biri, primerinin 3"-hidroksil grubundan ikinci primeri tamamlayan dizinin terminal nükleotidine olan mesafeden çok daha uzundur. Bu tür zincirlere "uzun şablonlar" denir. üzerlerinde daha fazla sentezin gerçekleşeceğidir.

İkinci turda, benzer ve yeni sentezlenmiş (uzun şablon) ipliklerden oluşan çift iplikli DNA tekrar denatüre edilir ve ardından primerlerle tavlanır. Bu turda sentez sırasında, "uzun şablonlar" yeniden sentezlenir, ayrıca bir ucunda bir primer ve diğer ucunda ikinci primeri tamamlayan bir dizi ("kısa şablonlar") olan bir dizi iplik sentezlenir. Üçüncü tur sırasında, daha önce oluşturulan tüm heterodupleksler aynı anda denatüre edilir ve primerlerle tavlanır ve ardından kopyalanır. Sonraki turlarda, giderek daha fazla "kısa matris" vardır ve 30. turda sayıları, ilk zincirlerin veya "uzun matrislerin" sayısından 106 kat daha fazladır.

Spesifik reaksiyon ürününün miktarı (primerler tarafından sınırlandırılmıştır) teorik olarak 2n ile orantılı olarak artar, burada n, reaksiyon döngülerinin sayısıdır. Aslında, her döngünün verimliliği %100'den az olabilir, yani gerçekte:

burada P ürün miktarıdır, E çevrimin ortalama verimidir.

"Uzun" DNA kopyalarının sayısı da artar, ancak doğrusal olarak, bu nedenle reaksiyon ürünlerinde belirli bir parça baskındır. Gerekli ürünün büyümesi, reaktiflerin miktarı, inhibitörlerin varlığı ve yan ürünlerin oluşumu ile katlanarak sınırlıdır.

PCR oldukça hassas bir yöntemdir, bu nedenle test örneğinde yanlışlıkla bir reaksiyon karışımından diğerine geçen önemsiz miktarda DNA varsa bile yanlış pozitif sonuçlar alınabilir. Bu, PCR için kullanılan tüm solüsyonları ve gereçleri dikkatli bir şekilde kontrol etmeyi gerekli kılar.

Primer seçiminin temel prensipleri.

Bir PCR test sistemi oluştururken, ana görevlerden biri, bir dizi kriteri karşılaması gereken doğru primer seçimidir:

1. Primerler spesifik olmalıdır. Primerlerin 3 "ucuna özellikle dikkat edilir, çünkü onlardan Taq polimeraz tamamlayıcı DNA zincirini tamamlamaya başlar. Spesifiklikleri yetersizse, reaksiyon karışımı ile test tüpünde büyük olasılıkla istenmeyen işlemler meydana gelecektir. , yani, spesifik olmayan DNA'nın sentezi (kısa veya uzun parçalar). Elektroforezde ağır veya hafif ek bantlar şeklinde görülebilir. Bu, reaksiyonun sonuçlarını değerlendirmeyi zorlaştırır, çünkü belirli bir şeyi karıştırmak kolaydır. sentezlenmiş yabancı DNA ile amplifikasyon ürünü. Bazı primerler ve dNTP'ler, spesifik olmayan DNA'nın sentezi için tüketilir ve bu da önemli bir duyu kaybına yol açar.

2. Primerler dimer ve döngü oluşturmamalıdır, yani. Primerlerin kendilerine veya birbirlerine tavlanmasıyla stabil çift şerit oluşturulmamalıdır.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)- moleküler biyolojide, belirli bir DNA dizisinin birkaç bin ila milyonlarca kopyasını oluşturmanıza izin veren, bir veya daha fazla DNA parçası kopyasını birkaç derece artırmak amacıyla yürütülen bir biyokimyasal teknoloji yöntemidir.

1983 yılında Cary Mullis tarafından geliştirilen PCR yöntemi, günümüzde tıbbi ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında birçok farklı uygulama için kullanılan yaygın ve çoğu zaman vazgeçilmez bir yöntemdir. Bunlar, dizileme için DNA klonlamayı, DNA tabanlı filogeniyi veya genlerin fonksiyonel analizini; kalıtsal hastalıkların teşhisi; (adli bilim dallarında ve babalık testlerinin yapılmasında kullanılan) genetik parmak izlerinin tespiti ile teşhis ve teşhis bulaşıcı hastalıklar. 1993 yılında Mullis, PCR üzerindeki çalışmaları nedeniyle Michael Smith ile birlikte Nobel Kimya Ödülü'ne layık görüldü.

Yöntem, DNA'yı enzimlerle denatüre etmek ve kopyalamak için tekrarlanan ısıtma ve soğutma reaksiyonlarından oluşan termal döngüye dayanır. DNA polimeraz (yöntemin adını aldığı) ile birlikte hedef bölgeye tamamlayıcı olan dizileri içeren primerler (kısa DNA parçaları), anahtar bileşenler seçici ve yeniden amplifikasyon çalıştırmak için. PCR işleminde, sentezlenen DNA'nın kendisi replikasyon için bir şablon olarak kullanılır ve şablon DNA'nın katlanarak büyütüldüğü bir zincirleme reaksiyonu harekete geçirir. PCR gerçekleştirmek için önemli ölçüde değiştirilebilir geniş bir yelpazede genetik manipülasyon.

Hemen hemen tüm PCR uygulamaları, orijinal olarak bakterilerden izole edilmiş bir enzim olan Taq polimeraz gibi ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz kullanır. termossu kuşu. Bu DNA polimeraz, DNA sentezini başlatmak için gerekli olan tek iplikli DNA'yı ve DNA oligonükleotitlerini (DNA primerleri olarak da adlandırılır) şablon olarak kullanarak DNA'nın yapı taşlarından - nükleotidlerden yeni bir DNA ipliğini enzimatik olarak birleştirir. PCR yöntemlerinin büyük çoğunluğu, termal döngüyü, yani PCR örneğinin belirli bir dizi sıcaklık adımı boyunca alternatif olarak ısıtılmasını ve soğutulmasını kullanır. Bu termal döngü adımları, DNA denatürasyonu adı verilen bir işlemde ilk önce DNA çift sarmalının iki sarmalını yüksek sıcaklıkta fiziksel olarak ayırmak için gereklidir. Daha düşük bir sıcaklıkta, her bir iplikçik, hedef DNA bölgesini seçici olarak büyütmek için DNA polimeraz tarafından DNA sentezinde bir şablon olarak kullanılacaktır. Belirli termal döngü koşulları altında amplifikasyon için hedef DNA bölgesine tamamlayıcı olan primerler kullanılarak PCR sonuçlarının seçiciliği.

PCR teşhisinin ilkeleri

PCR, bir DNA zincirinin (hedef DNA) belirli bir bölümünü amplifiye etmek için kullanılır. Çoğu PCR yöntemi tipik olarak DNA parçalarını ~10.000 baz çiftine (kb) kadar yükseltir, ancak bazı yöntemler parçaların 40 kb boyutuna kadar ölçeklenmesine izin verir. Reaksiyon, reaksiyon ürünlerinin reaksiyon ve geri besleme inhibisyonunda mevcut reaktifler tarafından kontrol edilen sınırlı miktarda nihai amplifiye ürün üretir.

Temel PCR kiti birkaç bileşen ve reaktif gerektirir. Bunlar şunları içerir:

DNA şablonu Amplifiye edilecek hedef DNA bölgesini içeren.
iki primer, hedef DNA'nın duyu ve duyu olmayan ipliklerinin her birinin 3' uçlarına tamamlayıcıdır.
Taq polimeraz veya 70°C civarında bir optimum sıcaklıkta çalışan başka bir DNA polimeraz.
deoksinükleosit trifosfatlar(dNTP'ler; nükleotidler içeren trifosfat grupları), DNA polimerazın yeni bir DNA zincirini sentezlediği yapı taşları.
tampon çözelti uygun sağlamak kimyasal koşullar Optimum DNA polimeraz aktivitesi ve stabilitesi için.
iki değerlikli katyonlar, magnezyum veya manganez iyonları; Mg2+ yaygın olarak kullanılır, ancak daha yüksek Mn2+ konsantrasyonları DNA sentezi sırasında hata oranını arttırdığından, Mn2+ PCR aracılı DNA mutagenezi için de kullanılabilir.
tek değerli katyonlar potasyum iyonları.

PCR genellikle küçük reaksiyon tüplerinde (hacim 0.2-0.5 mi) 10-200 µl'lik bir reaksiyon hacminde bir termal döngüleyici-amplifikatörde gerçekleştirilir. Döngüleyici, reaksiyonun her aşaması için gereken sıcaklıkları elde etmek için reaksiyon tüplerini ısıtır ve soğutur. Birçok modern döngüleyici, elektrik akımının yönünü tersine çevirerek PCR tüp tertibatının ısıtılmasına ve soğutulmasına izin veren Peltier etkisini kullanır. İnce duvarlı reaksiyon tüpleri, hızlı termal denge sağlamak için uygun termal iletkenliği destekler. Isıtılmış kapağı olmayan daha eski döngüleyiciler, reaksiyon karışımının yüzeyinde bir yağ tabakası veya bir şişe içinde bir mum damlası gerektirir.

prosedür sırası

Tipik olarak, PCR, her döngü tipik olarak 2-3 ayrı sıcaklık adımından oluşan, genellikle üç olmak üzere, döngü adı verilen 20-40 tekrarlanan sıcaklık değişiminden oluşur. Bisiklete binme genellikle tek bir sıcaklık adımıyla başlar ve biter. Beklenti) ürünün son genleşmesi veya kısa süreli depolama için yüksek sıcaklıkta (> 90 ° C). Her döngüde kullanılan sıcaklıklar ve uygulama süreleri birçok parametreye bağlıdır. Bunlar, DNA sentezi için kullanılan enzimi, reaksiyondaki iki değerli iyonların ve dNTP'lerin konsantrasyonunu ve primerlerin erime noktasını (Tm) içerir.

Başlatma aşaması: Bu adım, reaksiyonun 1-9 dakika süreyle 94-96°C (veya yüksek derecede ısıya dayanıklı polimerazlar kullanılıyorsa 98°C) sıcaklığa ısıtılmasından oluşur. Adım, yalnızca sıcak başlangıçlı PCR olarak adlandırılan ısı aktivasyonu gerektiren DNA polimerazlar için gereklidir.
Denatürasyon adımı:İlk düzenli termal döngü olayıdır ve reaksiyonun 20-30 saniye boyunca 94-98°C'ye ısıtılmasından oluşur. Bu, tamamlayıcı bazlar arasındaki hidrojen bağlarının yok edilmesi ve tek sarmallı DNA moleküllerinin oluşumu ile DNA şablonunun bölünmesine neden olur.
Tavlama adımı: Reaksiyon sıcaklığı, 20-40 saniye süreyle 50-65°C'ye düşürülür ve bu, primerlerin tek iplikli DNA şablonuna bağlanmasına izin verir. Tipik olarak tavlama sıcaklığı, kullanılan primerlerin Tm'sinin yaklaşık 3-5 santigrat derece altındadır. Stabil DNA-DNA hidrojen bağları, yalnızca primer dizisi dizi şablonuna daha yakın eşleştiğinde oluşur. Polimeraz, primer şablon hibritine bağlanır ve DNA sentezini başlatır.
Genişleme / uzama aşaması: Bu adım sırasındaki sıcaklık, kullanılan DNA polimeraza bağlıdır; Taq polimeraz, optimum aktivite sıcaklığına 75-80°C'de sahiptir; Bu enzim için yaygın olarak 72°C'lik bir sıcaklık kullanılır. Bu aşamada, DNA polimeraz, şablona 5" ila 3" yönünde tamamlayıcı olan dNTP'leri ekleyerek, dNTP'nin 5"-fosfat grubunu 3"-hidroksil grubuna bağlayarak, DNA şablon zincirine tamamlayıcı olan yeni bir DNA zincirini sentezler. elde edilen (genişleyen) DNA'nın sonunda. Genişletme süresi hem kullanılan DNA polimerazına hem de amplifiye edilecek DNA parçasının uzunluğuna bağlıdır. Tipik olarak, optimum sıcaklığında, DNA polimeraz dakikada bin bazı polimerize eder. Optimal koşullar altında, yani. sınırlayıcı substratlar veya reaktifler nedeniyle kısıtlamaların olmaması durumunda, her genişleme adımında hedef DNA miktarı iki katına çıkar ve bir DNA fragmanının üstel (geometrik) amplifikasyonu ile sonuçlanır.
Son uzatma: Bu, kalan tek iplikli DNA'nın tamamen uzadığından emin olmak için, son PCR döngüsünden sonra bazen 70-74°C'de 5-15 dakika gerçekleştirilen tek adımdır.
Nihai beklenti: 4-15 °C'deki bu adım, reaksiyonu kısa tutmak için süresiz olarak kullanılabilir. PCR'nin beklenen DNA fragmanını sentezleyip sentezlemediğini kontrol etmek için (bazen "amplimer" veya "amplikon" olarak da adlandırılır), PCR ürünlerini boyuta göre ayırmak için agaroz jel elektroforezi kullanılır. PCR ürünlerinin boyutu, PCR ürünleri ile birlikte bir jel üzerinde gerçekleştirilen, bilinen boyutta DNA parçalarını içeren bir DNA merdiveni (moleküler ağırlık markörü) ile karşılaştırılarak belirlenir.

Polimeraz zincir reaksiyonunun aşamaları

PCR işlemi üç adıma ayrılabilir:

üstel büyütme: Her döngü sırasında ürün miktarı ikiye katlanır (%100 reaksiyon verimi varsayılarak). Reaksiyon çok hassastır: sadece az miktarda DNA gereklidir.
Tesviye aşaması: DNA polimeraz aktivitesini kaybettiğinden reaksiyon yavaşlar ve dNTP'ler ve primerler gibi reaktiflerin tüketimi bunların sınırlayıcı hale gelmesine neden olur .
Plato: Reaktiflerin ve enzimlerin tükenmesi nedeniyle ürün artık birikmez.

PCR optimizasyonu

Pratikte, PCR başarılı olmayabilir çeşitli sebepler, özellikle DNA yan ürünlerinin amplifikasyonuna neden olan kontaminasyona duyarlılığı nedeniyle. Bu bağlamda, PCR koşullarını optimize etmek için bir dizi teknik ve prosedür geliştirilmiştir. Yabancı DNA kontaminasyonu, potansiyel DNA kontaminantlarının PCR öncesi karışımlarını saflaştıran laboratuvar protokolleri ve prosedürleri ile ele alınır. Bu, tipik olarak, tek kullanımlık plastik gereçler kullanarak PCR ürünlerinin analiz veya saflaştırma alanlarından PCR kitlerini ayırmayı ve reaksiyon adımları arasında çalışma yüzeyini iyice temizlemeyi içerir. Primer tasarım teknikleri, PCR ürünlerinin izolasyonunu geliştirmede ve yan ürünlerin oluşumunu önlemede önemli bir rol oynar ve alternatif tampon bileşenlerinin veya polimeraz enzimlerinin kullanılması, uzun veya başka şekilde sorunlu DNA bölgelerinin büyütülmesine yardımcı olabilir. Tampon sistemlerine formamid gibi reaktiflerin eklenmesi, PCR'nin özgüllüğünü ve geri kazanımını artırabilir. Primer tasarımına yardımcı olmak için teorik PCR sonuçlarının (elektronik PCR) bilgisayar simülasyonu yapılabilir.

PCR uygulaması

seçici DNA izolasyonu

PCR, belirli bir DNA bölgesinin seçici amplifikasyonu ile genomik DNA'dan DNA fragmanlarının izolasyonuna izin verir. Bu PCR uygulaması, Southern veya Northern blot için hibridizasyon problarının oluşturulması ve DNA'nın belirli bir bölgesini temsil eden büyük miktarlarda DNA gerektiren DNA klonlama yöntemleri gibi birçok yöntemi tamamlar. PCR, bu yöntemlere, az miktarda başlangıç materyali ile bile DNA örneklerinin analizine izin veren yüksek miktarda saf DNA sağlar.

PCR'nin diğer uygulamaları arasında, amplifikasyon primerlerinden birinin Sanger dizilemesinde kullanılabileceği, bilinmeyen PCR ile amplifiye edilmiş dizileri tanımlamak için DNA dizilimi, bir DNA dizisinin bir plazmide veya genetik materyale eklenmesini içeren rekombinant DNA teknolojilerini hızlandırmak için DNA dizisi izolasyonu yer alır. başka bir organizmanın Bakteri kolonileri (E. coli), vektör DNA tasarımını düzeltmek için PCR ile hızla taranabilir. PCR, genetik parmak izi için de kullanılabilir; Adli tıpta, çeşitli PCR yöntemlerini kullanarak deneysel DNA'yı karşılaştırarak bir kişiyi veya organizmayı tanımlamak için kullanılan bir teknik.

Bazı "parmak izi" PCR yöntemleri yüksek bir ayrım gücüne sahiptir ve ebeveyn-çocuk veya kardeşler gibi bireyler arasındaki genetik ilişkileri belirlemek için kullanılabilir ve babalık testlerinde kullanılır. Bu teknik, organizmalar arasındaki evrimsel ilişkileri belirlemek için de uygulanabilir.

DNA amplifikasyonu ve kantifikasyonu

PCR, hedef DNA bölgelerinin kopya sayısını arttırdığından, PCR çok küçük miktarlarda bir numuneyi analiz etmek için kullanılabilir. Bu, kanıt olarak yalnızca eser miktarda DNA'nın mevcut olduğu adli araştırmalar için genellikle kritiktir. PCR, on binlerce yıllık eski DNA'yı analiz etmek için de kullanılabilir. Bu PCR yöntemleri, Mısır mumyalarının analizinden bir Rus çarının tanımlanmasına kadar çeşitli uygulamalarda, insan DNA'sının yanı sıra 40.000 yıllık mamut gibi hayvanlar üzerinde de başarıyla kullanılmıştır.

Nicel PCR yöntemleri, bir numunede bulunan belirli bir dizinin miktarını tahmin eder, genellikle gen ekspresyon seviyesini ölçmek için kullanılan bir yöntemdir. Real-time PCR, her PCR amplifikasyon döngüsünden sonra ürün DNA'sının birikimini ölçen yerleşik bir DNA niceleme aracıdır.

Hastalıkların teşhisinde PCR

PCR izin verir erken teşhis kötü huylu hastalıklarŞu anda kanser araştırmalarında oldukça gelişmiş olan ve halihazırda rutin olarak kullanılan lösemi ve lenfoma gibi. PCR, diğer yöntemlerden en az 10.000 kat daha yüksek bir hassasiyetle translokasyona özgü malign hücreleri tespit etmek için doğrudan genomik DNA numuneleri üzerinde gerçekleştirilebilir.

PCR ayrıca doku kültürü ve hayvan modellerinden mikobakteriler, anaerobik bakteriler ve virüsler gibi ekilmemiş veya yavaş büyüyen organizmaların saptanmasına da olanak tanır. Mikrobiyoloji alanındaki PCR tanı uygulamalarının temeli, enfeksiyöz ajanların tanımlanması ve patojenik olmayan suşların spesifik genler sayesinde patojenik olanlardan ayırt edilmesidir.

Viral DNA, PCR ile de tespit edilebilir. Primerler, virüsün hedef DNA dizilerine spesifik olmalıdır ve PCR, tanısal DNA testleri veya viral genomun dizilenmesi için kullanılabilir. PCR'nin yüksek duyarlılığı, virüsleri enfeksiyondan hemen sonra ve hatta hastalığın başlangıcından önce tespit etmeyi mümkün kılar. Virüsün bu erken tespiti, doktorlara önemli tedavi seçenekleri sunabilir. Bir hastadaki virüs ("viral yük") miktarı, kantitatif PCR tabanlı DNA analizi ile de belirlenebilir.

Temel polimeraz zincir reaksiyonu yöntemlerindeki varyasyonlar

Alel-spesifik PCR: tek nükleotid polimorfizmlerine (SNP'ler) dayalı tanı veya klonlama yöntemi (DNA'daki tek baz farklılıkları). Aleller arasındaki farklar da dahil olmak üzere DNA dizisi hakkında önceden bilgi gerektirir ve 3' uçları SNP'leri kapsayan primerleri kullanır.Sıkı PCR amplifikasyonu, şablon ve primer arasında bir uyumsuzluk varlığında çok daha az etkilidir, bu nedenle SNP'ye özgü bir amplifikasyon ile başarılı amplifikasyon primer, dizideki spesifik SNP'lerin varlığı hakkında sinyaller verir.
PCR düzeneği veya polimeraz döngü düzeneği (PCP): Kısa örtüşen segmentlere sahip uzun oligonükleotitlerden oluşan bir havuz üzerinde PCR ile uzun DNA dizilerinin yapay sentezi. Oligonükleotitler, duyu ve duyu olmayan iplik yönleri arasında değişir ve örtüşen bölümler, PCR fragmanlarının sırasını belirler, böylece seçici olarak nihai uzun DNA ürününü üretir.
asimetrik PCR: tercihen çift sarmallı bir DNA şablonundaki bir DNA sarmalını çoğaltır. İki tamamlayıcı diziden yalnızca birinin amplifikasyonunun gerekli olduğu durumlarda dizileme ve hibridizasyon araştırmasında kullanılır. PCR her zamanki gibi gerçekleştirilir, ancak amplifikasyona yönelik zincir için çok fazla primer bulunur. Sınırlayıcı primer kullanımından sonra reaksiyonun sonundaki yavaş (aritmetik ilerleme) amplifikasyon nedeniyle, ek PCR döngüleri gereklidir. "LATE-PCR" (üstel fazdan sonra doğrusallık - PCR) olarak bilinen bu işlemin en son modifikasyonu, sınırlayıcı primerin konsantrasyonu azaldığından reaksiyon verimliliğini korumak için primer fazlalığından daha yüksek bir erime noktasına (Tm) sahip bir sınırlayıcı primer kullanır. reaksiyonun ortasında.
dışarı arama PCR: gen sentezi için kesin DNA molekülleri elde etmek için oldukça paralel bir yöntem. DNA moleküllerinin karmaşık havuzu, benzersiz yan etiketler tarafından büyük paralel dizilemeye dönüştürülür. Etikete yönelik primerler daha sonra PCR ile dizili moleküller sağlar.
Helikaz bağımlı amplifikasyon: geleneksel PCR'ye benzer, ancak denatürasyon ve tavlama/genişleme döngüleri boyunca döngüye girmekten daha sabit sıcaklık gerektirir. DNA'yı çözen bir enzim olan DNA helikaz, ısı denatürasyonu yerine kullanılır.
Sıcak başlangıç PCR: PCR adımlarının ilk kurulumu sırasında spesifik olmayan amplifikasyonu azaltan bir teknik. Polimeraz eklenmeden önce reaksiyon bileşenlerinin denatürasyon sıcaklığına (örn. 95 °C) ısıtılmasıyla manuel olarak yapılabilir. Oda sıcaklığında, ya antikor bağlanmasıyla ya da yalnızca yüksek sıcaklık aktivasyon adımından sonra ayrışan kovalent olarak bağlı inhibitörlerin varlığında polimeraz aktivitesini inhibe eden özel enzim sistemleri geliştirilmiştir. Sıcak başlatma/soğuk bitirme PCR, ortam sıcaklığında etkin olmayan ve uzama sıcaklığında anında etkinleşen yeni hibrit polimerazlarla elde edilir.
Mikrosatellit dizisine özgü PCR (ISSR): Amplifiye edilmiş parça uzunluğundan benzersiz bir parmak izi elde etmek için basit tekrar dizileri arasındaki bölgelerin kopya sayısını artıran PCR DNA parmak izi yöntemi.
ters PCR genomik ekler etrafındaki dizi bölgelerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Bilinmeyen dizinin her iki ucunda da bilinen dizilerle sonuçlanan bir dizi DNA bölünmesi ve kendi kendine ligasyonu içerir.
Ligasyonun aracılık ettiği PCR:İlgili DNA'ya bağlı küçük DNA bağlayıcıları ve DNA bağlayıcılarına bağlı birkaç primer kullanır; DNA dizilimi, genom yürüyüşü ve DNA ayak izi için kullanılır.
Metilasyona özgü PCR(MSP): Johns Hopkins Tıp Okulu'nda Stephen Bailin ve Jim Herman tarafından geliştirilmiştir, genomik DNA'daki CpG adalarının metilasyonunu saptamak için kullanılır. DNA ilk önce metillenmemiş sitozin bazlarını PCR primerleri tarafından timin olarak tanınan urasile dönüştüren sodyum bisülfit ile işlenir. Daha sonra, primer sekansı içindeki herhangi bir CpG adası dışında aynı primer setleri kullanılarak modifiye DNA üzerinde iki PCR gerçekleştirilir. Bu noktalarda, bir dizi primer, metillenmiş DNA'nın kopya sayısını artırmak için sitozinli DNA'yı tanır ve bir grup, metillenmemiş DNA'yı yükseltmek için DNA'yı urasil veya timin ile tanır. qPCR kullanan MSP, metilasyon hakkında nitel bilgiden ziyade nicel bilgi elde etmek için de gerçekleştirilebilir.
Mini astar - PCR: 9 veya 10 nükleotid sayısı ile kısa primerlerden ("smalligos") uzayabilen termostabil polimerazlar (S-Tbr) kullanılır. Bu teknik, PCR'nin daha küçük primerlerle ilişkili bölgeleri hedeflemesine izin verir ve 16S (veya ökaryotik 18S) rRNA geni gibi korunmuş DNA dizilerini büyütmek için kullanılır.
Multipleks ligasyona bağlı prob amplifikasyonu (MLPA): sadece bir çift primer ile birden fazla hedefin amplifikasyonuna izin verir, böylece multipleks PCR'nin çözünürlük sınırlamalarından kaçınır.
Multipleks PCR farklı DNA dizileri için spesifik olan farklı boyutlarda amplikonlar elde etmek için bir PCR karışımında birkaç primer setinden oluşur. Aynı anda birkaç gene odaklanarak, aksi takdirde birkaç kat daha fazla reaktif ve tamamlanması için daha fazla zaman gerektirecek olan tek bir test sırasında ek bilgiler elde etmek mümkündür. Her bir primer seti için tavlama sıcaklıkları, tek bir reaksiyon içinde ve amplikon boyutları ile doğru şekilde çalışmak üzere optimize edilmelidir. Yani, jel elektroforezi ile görselleştirildiğinde, baz çifti uzunlukları farklı bantlar oluşturmak için yeterince farklı olmalıdır.
iç içe PCR: spesifik olmayan DNA amplifikasyonu nedeniyle arka planı azaltarak DNA amplifikasyonunun özgüllüğünü arttırır. Ardışık iki PCR'de iki set primer kullanılır. İlk reaksiyonda, amaçlanan amaca ek olarak, yine de spesifik olarak amplifiye edilmemiş DNA parçalarından oluşabilen DNA ürünlerini sentezlemek için bir çift primer kullanılır. Ürünler daha sonra, bağlanma yerleri, birinci reaksiyonda kullanılan primerlerin her birinin 3' uçlarından tamamen veya kısmen farklı olan bir primer seti ile ikinci bir PCR'de kullanılır, Nested PCR, uzun DNA fragmanlarını spesifik olarak amplifiye etmede genellikle daha başarılıdır. geleneksel PCR, ancak hedef diziler hakkında daha ayrıntılı bilgi gerektirir.
Örtüşen uzantılara sahip PCR veya örtüşen uzantılarla ekleme(SOE): Tamamlayıcı diziler içeren iki veya daha fazla DNA parçasını birleştirmek için kullanılan bir genetik mühendisliği tekniği. Dizileri veya mutasyonları düzenleyen genleri içeren DNA parçalarını bağlamak için kullanılır; teknik, spesifik ve uzun DNA yapılarının oluşturulmasına izin verir.
Kantitatif PCR (QPCR): PCR ürününün miktarını ölçmek için kullanılır (genellikle gerçek zamanlı olarak). DNA, cDNA veya RNA'nın başlangıç miktarlarını ölçer. qPCR, bir numunede bir DNA dizisinin varlığını ve numunedeki kopya numarasını belirlemek için yaygın olarak kullanılır. Gerçek zamanlı kantitatif PCR çok yüksek bir doğruluk derecesine sahiptir. QRT-PCR (veya QF-PCR) yöntemleri, amplifiye edilmiş ürün miktarını gerçek zamanlı olarak ölçmek için Sybr Green, EvaGreen gibi floresan boyalar veya TaqMan gibi florofor içeren DNA probları kullanır. Bazen RT-PCR (gerçek zamanlı PCR) veya RQ-PCR olarak anılır. QRT-PCR veya RTQ-PCR daha uygun kısaltmalardır, çünkü RT-PCR genellikle qPCR ile birlikte kullanılan ters transkripsiyon PCR'sini ifade eder.
Ters transkripsiyon PCR (RT-PCR): RNA'dan DNA kopya sayısını artırmak için. Ters transkriptaz, RNA'yı cDNA'ya kopyalar ve daha sonra PCR ile amplifiye edilir. RT-PCR, gen ekspresyonunu saptamak veya transkripsiyon başlangıç ve bitiş bölgeleri dahil olmak üzere bir RNA transkriptinin dizisini belirlemek için ekspresyon profili oluşturmada yaygın olarak kullanılır. Bir genin genomik DNA dizisi biliniyorsa, gendeki eksonların ve intronların yerini haritalamak için RT-PCR kullanılabilir. Bir genin 5' ucu (transkripsiyon başlangıç bölgesine karşılık gelir) genellikle RACE-PCR (cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu) ile belirlenir.
katı faz PCR: "Polonia Amplification" (örneğin, bir jel matrisi üzerinde PCR kolonilerinin yapıldığı yer), "Bridge PCR" (primerler bir katı destek yüzeyine kovalent olarak bağlanır), geleneksel katı fazlı PCR ("asimetrik PCR" ", sulu primerlerden birine karşılık gelen bir diziye sahip katı bir destek taşıyan primerlerin ve geliştirilmiş katı faz PCR'nin (burada geleneksel katı faz PCR, yüksek Tm ve iç içe katı destek primerleri kullanılarak geliştirilebilir) varlığında kullanılır. sağlam bir destekle primerlerin oluşumunu teşvik etmek için bir termal "adım" uygulama seçeneği).
Termal Asimetrik Interleaved PCR (KUYRUK-PCR): Bilinen bir diziyi takip eden bilinmeyen bir diziyi izole etmek için kullanılır. Bilinen bir dizide, TAIL-PCR, farklı tavlama sıcaklıklarına sahip iç içe bir çift primer kullanır; primer dejenere, bilinmeyen diziden farklı bir yönde amplifiye etmek için kullanılır.
Touchdown PCR (Adım PCR): PCR döngüleri ilerledikçe tavlama sıcaklığını kademeli olarak düşürerek spesifik olmayan arka planı azaltmayı amaçlayan bir PCR varyantı. İlk döngülerdeki tavlama sıcaklığı tipik olarak kullanılan primerlerin Tm'sinin birkaç derece (3-5°C) üzerindeyken, sonraki döngülerde sıcaklık, Tm'nin birkaç derece (3-5°C) altındadır. primerler. Daha yüksek sıcaklıklar, primer bağlama için daha fazla özgüllük sağlar ve daha fazlası Düşük sıcaklık ilk döngüler sırasında oluşan belirli ürünlerden daha verimli amplifikasyonu teşvik eder.
PAN-AC: Amplifikasyon için izotermal koşulları kullanır ve canlı hücrelere uygulanabilir.
Genomda evrensel hızlı yürüyüş: mekanizma nedeniyle geleneksel "tek taraflı" yaklaşımlardan daha spesifik "iki taraflı" PCR kullanan genom yürüyüşü ve genetik parmak izi için (yalnızca bir gene özgü primer ve bir ortak primer kullanarak - bu, yapay "gürültüye" yol açabilir) , bir kement yapısının oluşumu dahil. UFW'nin basitleştirilmiş türevleri "Lane RAGE" (genomik DNA uçlarının hızlı amplifikasyonu için kement yuvalanmış PCR), "5" RACE Lane" ve "3" RACE Lane'dir.
İçindesilikoPCR(dijital PCR, sanal PCR, e-PCR, e-PCR), dizilenmiş bir genom veya transkriptomdan DNA dizilerini amplifiye etmek için belirli bir dizi primer (sonda) kullanarak teorik polimeraz zincir reaksiyonunun sonuçlarını hesaplamak için kullanılan hesaplama araçlarını ifade eder.

PCR'nin Tarihçesi

1971'de Journal of Molecular Biology'deki bir makalede, Kleppe ve ortak yazarları ilk olarak, test tüpü koşulları altında primerlerle kısa bir DNA şablonunu çoğaltmak için enzimatik analiz kullanan bir yöntem tanımladılar. Bununla birlikte, PCR'nin temel ilkesinin bu erken tezahürü fazla ilgi görmedi ve polimeraz zincir reaksiyonunun 1983'teki icadı genellikle Kary Mullis'e atfedilir.

Mullis 1983'te PCR geliştirdiğinde, erken bir biyoteknoloji şirketi olan Cetus Corporation için California, Emeryville'de çalışıyordu. Orada kısa DNA zincirlerinin sentezinden sorumluydu. Mullis, PCR'yi bir gece arabasında Pasifik Kıyısı otoyolu boyunca sürerken tasarladığını yazdı. Bunun yerine DNA polimerazın neden olduğu tekrarlanan çoğaltma döngüleri yoluyla DNA'nın herhangi bir bölümünün kopya sayısını artırmak için bir yöntem icat ettiğini fark ettiğinde, zihninde DNA'daki değişiklikleri (mutasyonları) analiz etmenin yeni bir yolunu oynadı. Mullis Scientific American'da prosedürü özetledi: "Tek bir DNA genetik materyal molekülü ile başlayarak, PCR bir günde 100 milyar bu tür molekül üretebilir. Bu reaksiyonun gerçekleştirilmesi kolaydır. Bir test tüpünden, birkaç basit reaktiften ve bir ısı kaynağından fazlasını gerektirmez.” Yedi yıl sonra, kendisi ve Cetus'taki meslektaşları önerisini ilk kez uygulamaya koyduklarında, 1993 yılında icadı nedeniyle Nobel Kimya Ödülü'ne layık görüldü. Bununla birlikte, diğer bilim adamlarının Mullis'in çalışmalarına entelektüel ve pratik katkıları ve PCR ilkesinin tek mucidi olup olmadığı konusunda bazı tartışmalar devam etmektedir.

PCR yöntemi, her replikasyon döngüsünden sonra DNA çift sarmalındaki iki DNA sarmalını parçalamak için gereken >90°C (194°F) yüksek sıcaklıklara dayanabilen uygun bir DNA polimerazın kullanımına dayanır. Başlangıçta in vitro deneyler için kullanılan ve PCR'nin habercisi olan DNA polimerazlar, bu kadar yüksek sıcaklıklara dayanamadı. Bu nedenle, erken DNA replikasyon prosedürleri çok verimsiz ve zaman alıcıydı ve süreç boyunca büyük miktarlarda DNA polimeraz ve sürekli işlem gerektiriyordu.

1976'da termofilik bir bakteriden izole edilen bir DNA polimeraz olan Taq polimerazın keşfi, termossu kuşu Kaplıcalar gibi sıcak (50 ila 80°C (122 ila 176°F)) ortamlarda doğal olarak yaşayan , PCR yönteminde çarpıcı bir gelişmenin yolunu açtı. izole edilen DNA polimeraz T.sucul, yüksek sıcaklıklarda stabildir ve DNA denatürasyonundan sonra bile aktif kalır, böylece her döngüden sonra yeni DNA polimeraz ekleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu, bir termal döngüleyiciye dayalı DNA amplifikasyon sürecini otomatikleştirmeyi mümkün kıldı.

Patent Savaşları

Önerilen PCR yöntemi Carey Mullis tarafından patentlendi ve Mullis'in 1983'te tekniği icat ettiğinde çalıştığı Cetus Corporation'a yatırıldı. Taq polimeraz enzimi de patentlerle korunmaktadır. DuPont tarafından açılan başarısız bir dava da dahil olmak üzere, metodolojiyle ilgili birkaç yüksek profilli dava olmuştur. ilaç firması Hoffmann-La Roche, 1992 yılında patentlerin haklarını satın aldı ve halen korunanları elinde bulunduruyor.

Taq polimeraz enzimi için benzer bir patent savaşı, Roche ve Promega arasında dünyanın bazı bölgelerinde hala devam ediyor. Yasal argümanlar, 28 Mart 2005'te sona eren orijinal PCR ve Taq polimeraz patentlerinin şartlarının ötesine geçti.

Ancak, o zaman bu fikir sahiplenilmedi. Polimeraz zincir reaksiyonu 1983 yılında Kary Mullis tarafından yeniden keşfedildi. Amacı, DNA polimeraz enzimi kullanılarak orijinal DNA molekülünün ardışık çoklu kopyaları sırasında DNA'nın amplifikasyonuna izin verecek bir yöntem yaratmaktı. Bu fikrin yayınlanmasından 7 yıl sonra, 1993'te Mullis bunun için Nobel Ödülü'nü aldı.

Yöntemin kullanımının başlangıcında, her ısıtma-soğutma döngüsünden sonra, DNA sarmalının ipliklerini ayırmak için gerekli olan yüksek sıcaklıkta hızla inaktive edildiğinden, reaksiyon karışımına DNA polimeraz eklenmesi gerekiyordu. Prosedür çok verimsizdi, çok fazla zaman ve enzim gerektiriyordu. 1986'da önemli ölçüde iyileştirildi. Termofilik bakterilerden elde edilen DNA polimerazlarının kullanılması önerilmiştir. Bu enzimlerin termostabil olduğu kanıtlandı ve birçok reaksiyon döngüsüne dayanabildi. Kullanımları, PCR'yi basitleştirmeyi ve otomatikleştirmeyi mümkün kıldı. İlk termostabil DNA polimerazlardan biri bakterilerden izole edildi. termos aquaticus ve adlandırılmış tak-polimeraz. Bu polimerazın dezavantajı, bu enzimin hata düzeltme mekanizmalarından (3" → 5" eksonükleaz aktivitesi) yoksun olması nedeniyle hatalı bir nükleotidin girme olasılığının oldukça yüksek olmasıdır. polimerazlar pfu ve Pwo, arkelerden izole edilmiş, böyle bir mekanizmaya sahiptir, kullanımları DNA'daki mutasyonların sayısını önemli ölçüde azaltır, ancak çalışmalarının hızı (işlemsellik) daha düşüktür. tak. Şu anda karışımlar kullanılıyor tak ve pfu hem yüksek polimerizasyon hızı hem de yüksek kopyalama doğruluğu elde etmek için.

Yöntemin icadı sırasında Mullis, PCR yönteminin patentini alan Cetus (tr: Cetus Corporation) şirketi için çalıştı. 1992'de Cetus, yöntemin haklarını ve kullanım patentini sattı. tak-polimeraz şirketi Hoffmann-La Roche (tr: Hoffmann-La Roche) 300 milyon dolara. Ancak, ortaya çıktı ki tak-polimeraz, 1980 yılında Rus biyokimyacı Alexei Kaledin tarafından, Promega (Promega) şirketinin Roche'u mahkemede bu enzimin münhasır haklarından vazgeçmeye zorlamaya çalıştığı ile bağlantılı olarak karakterize edildi. PCR yöntemi için Amerikan patenti Mart 2005'te sona erdi.

PCR yürütmek

Yöntem, belirli bir DNA bölgesinin yapay koşullar altında enzimler yardımıyla çoklu seçici kopyalanmasına dayanır ( laboratuvar ortamında). Bu durumda, yalnızca belirtilen koşulları sağlayan alan ve yalnızca incelenen örnekte mevcutsa kopyalanır. Canlı organizmalardaki DNA amplifikasyonunun (replikasyon) aksine, DNA'nın nispeten kısa bölümleri PCR kullanılarak amplifiye edilir. Geleneksel bir PCR işleminde, kopyalanmış DNA bölgelerinin uzunluğu 3000 baz çiftinden (3 kbp) fazla değildir. Farklı polimerazların bir karışımı yardımıyla, katkı maddeleri kullanılarak ve belirli koşullar altında PCR fragmanının uzunluğu 20-40 bin baz çiftine ulaşabilir. Bu hala ökaryotik bir hücrenin kromozomal DNA'sının uzunluğundan çok daha azdır. Örneğin, insan genomu yaklaşık 3 milyar baz çifti uzunluğundadır.

Reaksiyon bileşenleri

PCR için en basit durumda aşağıdaki bileşenler gereklidir:

DNA şablonu, amplifiye edilmesi gereken DNA bölümünü içerir.
İki primer, istenen DNA parçasının farklı ipliklerinin zıt uçlarına tamamlayıcı.
termostabil DNA polimeraz DNA'nın polimerizasyonunu katalize eden bir enzimdir. PCR'de kullanılacak polimeraz, uzun süre yüksek sıcaklıkta aktif kalmalıdır, bu nedenle termofillerden izole edilen enzimler kullanılır - termos aquaticus(Taq polimeraz), pirokok furiosus(Pfu polimeraz), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeraz) ve diğerleri.
deoksinükleosit trifosfatlar(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Polimerazın çalışması için gerekli Mg2+ iyonları.
tampon çözelti, gerekli reaksiyon koşullarının sağlanması - pH, çözeltinin iyonik gücü. Tuzlar, sığır serum albümini içerir.

Primerler

Şablonun primer ile hibridizasyonundan sonra (tavlama), ikincisi şablonun tamamlayıcı ipliğinin sentezinde DNA polimeraz için bir primer görevi görür (bkz.).

Primerlerin en önemli özelliği primer-matris kompleksinin erime noktasıdır (Tm). Tm, şablon DNA'nın yarısının oligonükleotid primeri ile bir kompleks oluşturduğu sıcaklıktır. Erime noktası yaklaşık olarak formül ile belirlenebilir, burada n X, primerdeki X nükleotidlerin sayısıdır. Primerin uzunluğu ve nükleotid bileşimi veya tavlama sıcaklığı yanlış seçilirse, şablon DNA'nın diğer bölgeleriyle kısmen tamamlayıcı komplekslerin oluşumu mümkündür, bu da spesifik olmayan ürünlerin ortaya çıkmasına neden olabilir. Erime sıcaklığının üst sınırı, aktivitesi 80 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda düşen polimerazın optimum etki sıcaklığı ile sınırlıdır.

Astar seçerken, aşağıdaki kriterlere uyulması arzu edilir:

amplifikatör

Pirinç. bir: PCR döngüleyici

Reaksiyon ilerlemesi

Marker DNA (1) ve PCR reaksiyon ürünleri (2,3) içeren bir jelin fotoğrafı. Rakamlar, nükleotid çiftlerindeki DNA parçalarının uzunluğunu gösterir.

Tipik olarak, PCR yapılırken, her biri üç aşamadan oluşan 20-35 döngü gerçekleştirilir (Şekil 2).

denatürasyon

Çift iplikli DNA şablonu, DNA ipliklerinin ayrılmasına izin vermek için 0,5-2 dakika boyunca 94-96°C'ye (veya özellikle termostabil bir polimeraz kullanılıyorsa 98°C'ye) ısıtılır. Bu aşama denir denatürasyonçünkü iki DNA zinciri arasındaki hidrojen bağları kopmuştur. Bazen, ilk döngüden önce (polimeraz eklenmeden önce), reaksiyon karışımı 2-5 dakika önceden ısıtılır. şablon ve primerlerin tam denatürasyonu için. Böyle bir yaklaşım denir sıcak başlangıç, spesifik olmayan reaksiyon ürünlerinin miktarını azaltmaya izin verir.

tavlama

Uzama

PCR çeşitleri

"Nested" PCR (Nested PCR (eng.)) - reaksiyonun yan ürünlerinin sayısını azaltmak için kullanılır. İki çift primer kullanın ve iki ardışık reaksiyon gerçekleştirin. İkinci primer çifti, birinci reaksiyonun ürünü içindeki DNA bölgesini büyütür.
"Ters" PCR (Ters PCR (eng.)) - istenen dizide yalnızca küçük bir alan biliniyorsa kullanılır. Bu yöntem, DNA genoma eklendikten sonra komşu dizilerin belirlenmesi gerektiğinde özellikle yararlıdır. Ters PCR'nin uygulanması için, kısıtlama enzimleri ile bir dizi DNA kesimi gerçekleştirilir, ardından fragmanların bağlanması (ligasyon) yapılır. Sonuç olarak, bilinen fragmanlar bilinmeyen bölgenin her iki ucundadır, bundan sonra PCR her zamanki gibi gerçekleştirilebilir.
Ters Transkripsiyon PCR (RT-PCR), bir RNA kitaplığından bilinen bir diziyi amplifiye etmek, izole etmek veya tanımlamak için kullanılır. Geleneksel PCR'den önce, terstaz kullanılarak mRNA şablonu üzerinde tek iplikli bir DNA molekülü sentezlenir ve PCR için şablon olarak kullanılan tek iplikli bir cDNA elde edilir. Bu yöntem genellikle bu genlerin nerede ve ne zaman ifade edildiğini belirler.
asimetrik PCR. asimetrik PCR) - esas olarak orijinal DNA'nın zincirlerinden birinin amplifiye edilmesi gerektiğinde gerçekleştirilir. Bazı dizileme ve hibridizasyon analiz tekniklerinde kullanılır. Primerlerden birinin çok fazla alınması dışında PCR her zamanki gibi gerçekleştirilir.
Nicel PCR (Q-PCR), bir numunedeki spesifik DNA, cDNA veya RNA miktarını hızlı bir şekilde ölçmek için kullanılır.
Nicel gerçek zamanlı PCR - bu yöntem, biriken reaksiyon ürününün miktarını doğru bir şekilde ölçmek için floresan etiketli reaktifler kullanır.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR(English) ) - bu yöntemi kullanarak, primerlerin spesifik olmayan bağlanmasının ürünün oluşumu üzerindeki etkisi azaltılır. İlk döngüler, tavlama sıcaklığının üzerindeki bir sıcaklıkta gerçekleştirilir, ardından birkaç döngüde bir sıcaklık düşürülür. Belirli bir sıcaklıkta sistem, DNA için optimal primer özgüllük bandından geçecektir.
Moleküler koloni yöntemi (jel içinde PCR) Poloni-PCR Kolonisi) - Akrilamid jel, yüzeydeki tüm PCR bileşenleri ile polimerize edilir ve PCR gerçekleştirilir. Analiz edilen DNA'yı içeren noktalarda, moleküler kolonilerin oluşumu ile amplifikasyon gerçekleşir.
cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu ile PCR cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu, RACE-PCR )
Uzun parçaların PCR'si Uzun menzilli PCR) - genişletilmiş DNA segmentlerinin amplifikasyonu için PCR modifikasyonu (10 bin baz veya daha fazla). İki polimeraz kullanılır, bunlardan biri yüksek işlemselliğe sahip (yani, uzun bir DNA zincirini tek geçişte sentezleyebilen) bir Taq polimerazdır ve ikincisi 3'-5' endonükleaz aktivitesine sahip bir DNA polimerazdır. Birinci polimerazın neden olduğu hataları düzeltmek için ikinci polimeraza ihtiyaç vardır.
RAPD-PCR Polimorfik DNA PCR'nin Rastgele Amplifikasyonu , Polimorfik DNA'nın rastgele amplifikasyonu ile PCR - genetik dizilimde yakın olan organizmaları, örneğin farklı kültür bitki çeşitlerini, köpek ırklarını veya yakından ilişkili mikroorganizmaları ayırt etmek gerektiğinde kullanılır. Bu yöntem genellikle tek bir küçük primer (20-25 bp) kullanır. Bu primer, incelenen organizmaların rastgele DNA bölgelerine kısmen tamamlayıcı olacaktır. Koşulları (primer uzunluğu, primer bileşimi, sıcaklık vb.) seçerek, iki organizma için PCR modelinde tatmin edici bir fark elde etmek mümkündür.

PCR uygulaması

PCR birçok alanda analiz ve bilimsel deneylerde kullanılmaktadır.

kriminalistik

PCR, sözde "genetik parmak izlerini" karşılaştırmak için kullanılır. Suç mahallinden bir genetik materyal örneği gereklidir - kan, tükürük, meni, saç vb. Şüphelinin genetik materyali ile karşılaştırılır. Teorik olarak çok az miktarda DNA yeterlidir - bir kopya. DNA parçalar halinde kesilir, ardından PCR ile amplifiye edilir. Parçalar, DNA elektroforezi kullanılarak ayrılır. DNA bantlarının düzenlenişinin ortaya çıkan resmine denir. genetik parmak izi(İngilizce) genetik parmak izi).

babalık kurmak

Tıbbi teşhis

Kişiselleştirilmiş tıp

Çoğu ilacın, amaçlanan tüm hastalar üzerinde çalışmadığı, ancak sayılarının sadece %30-70'i üzerinde çalıştığı bilinmektedir. Ayrıca birçok ilaç bazı hastalar için toksik veya alerjiktir. Bunun nedenleri kısmen, ilaçların ve türevlerinin duyarlılığı ve metabolizmasındaki bireysel farklılıklardır. Bu farklılıklar genetik düzeyde belirlenir. Örneğin, bir hastada belirli bir sitokrom (yabancı maddelerin metabolizmasından sorumlu bir karaciğer proteini) daha aktif, diğerinde daha az olabilir. Belirli bir hastanın ne tür bir sitokroma sahip olduğunu belirlemek için ilacı kullanmadan önce bir PCR analizi yapılması önerilir. Bu analize ön genotipleme denir. olası genotipleme).

gen klonlama

Pirinç. dört: Bir plazmit kullanarak gen klonlama. .
(1) A organizmasının kromozomal DNA'sı. (2) PCR. (3) Organizma A'nın geninin çoklu kopyaları. (4) Genin bir plazmide eklenmesi. (5) A organizmasının geni ile plazmit. (6) Plazmitin B organizmasına dahil edilmesi. (7) B organizmasında A organizmasının geninin kopya sayısının çoğaltılması.

DNA dizilimi

Bir floresan etiketle veya dideoksinükleotitlerin radyoaktif bir izotopuyla etiketlenmiş kullanılarak dizileme yönteminde, PCR ayrılmaz bir parçadır, çünkü polimerizasyon sırasında bir floresan veya radyoaktif etiketle etiketlenmiş nükleotitlerin türevleri DNA zincirine eklenir. Bu, reaksiyonu durdurur ve jelde sentezlenen ipliklerin ayrılmasından sonra spesifik nükleotitlerin konumlarının belirlenmesine izin verir.

mutajenez

Şu anda, PCR ana mutajenez yöntemi haline geldi. PCR kullanımı, mutajenez prosedürünü basitleştirmeyi ve hızlandırmayı ve aynı zamanda daha güvenilir ve tekrarlanabilir hale getirmeyi mümkün kıldı.

Genellikle virüslerin belirlenmesi ve tanımlanması için hızlı bir yöntem olarak kullanılır.

Bu yöntem ilk olarak 1983 yılında C. Mullis (ABD) tarafından geliştirilmiştir. Yüksek duyarlılığı, özgüllüğü ve uygulama kolaylığı nedeniyle genetik, adli tıp, tanı ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Yöntemin özü, amplifikasyondur, yani bir DNA molekülünün kesin olarak tanımlanmış fragmanlarının in vitro kopyalarının sayısında bir artış. Bu yöntemde matris mekanizması ve tamamlayıcılık ilkesi çalışır. İki tekli polinükleotid zinciri (nükleik asitler), birinin nükleotid dizileri diğerinin nükleotid dizisiyle tam olarak eşleşiyorsa, azotlu bazları adenin-timin ve guanin-sitozin çiftleri oluşturabilecek şekilde bir çift sarmallı zincire hidrojen bağlama yeteneğine sahiptir.

PCR, iki primerden başlayarak karşılıklı olarak tamamlayıcı DNA zincirlerini sentezleyen bir termostabil DNA polimeraz kullanılarak DNA amplifikasyonuna dayanır. Primer, 20-30 nükleotitten oluşan bir DNA parçasıdır. Bu primerler (primerler), DNA'nın zıt ipliklerini tamamlayıcıdır. DNA sentezi sırasında, yeni sentezlenen DNA moleküllerinin zincirine primerler eklenir.

Genellikle PCR 25-40 döngüye ayarlanır. Her döngü üç aşama içerir: ilki 92-95 °C'de denatürasyondur. Bu durumda, DNA'nın iki ipliği birbirinden ayrılır; ikinci - tavlama veya 50-65 ° C'de primerlerin eklenmesi; üçüncüsü, 68-72 °C'de uzama veya polimerizasyondur, DNA polimeraz ise dört tip nükleotit kullanarak DNA şablon zincirlerinin tamamlayıcı tamamlanmasını gerçekleştirir. Bir döngü sonucunda istenilen genetik materyal iki katına çıkar. Birinci döngüde oluşturulan DNA iplikleri ikinci döngü için şablon görevi görür ve bu böyle devam eder.İlk döngüden sonra sadece iki primer arasındaki fragman amplifiye edilir. Böylece, amplifiye edilmiş bölgenin kopya sayısı iki katına çıkar, bu da 25-40 döngüde milyonlarca (2 n) DNA fragmanının sentezlenmesini mümkün kılar - bunları çeşitli yöntemlerle belirtmek için yeterli bir miktar (içeren hibridizasyon probları yöntemiyle). belirli bir etiket, elektroforez vb.) . Daha sık olarak, bu amaç için etidyum bromür boyamalı agaroz jel elektroforezi kullanılır.

PCR'de, yalnızca belirli bir patojen için karakteristik olan benzersiz bir nükleotit dizisine sahip olan patojenin DNA bölümlerinden primerler kullanılır.

PCR kurma yöntemi aşağıdaki gibidir: test materyalinden bir DNA şablonu izole edilir; izole edilmiş DNA, DNA polimeraz, 4 tip nükleotid, 2 tip primer, MgCl, tampon, deiyonize su ve mineral yağı içeren bir amplifikasyon karışımı ile bir test tüpünde birleştirilir. Daha sonra tüpler döngüleyiciye yerleştirilir ve amplifikasyon, patojen tipine karşılık gelen belirli bir programa göre otomatik modda gerçekleştirilir. Sonuçlar, DNA fragmanları ile birleşen etidyum bromür varlığında %1-2'lik bir agaroz jelde elektroforez ile daha sık kaydedilir ve jel bir transillüminatör üzerinde UV ışınlarına maruz bırakıldığında parlak bantlar olarak algılanır. Tüm PCR prosedürleri 1-2 iş günü sürer.

PCR'nin özgüllüğünü ve duyarlılığını artırmak için, Çeşitli seçenekler: yuvalanmış PCR; Bir parafin tabakası veya polimerazın aktif bölgelerinin monoklonal antikorlarla bloke edilmesi kullanılarak "sıcak başlangıçlı" PCR. Ayrıca bazı şirketler, PCR sürecini hızlandırabilen ve yanlış pozitif sonuç olasılığını azaltabilen DNA amplifikasyonu için liyofilize kitler üretir.

Şu anda uygulanıyor yeni teknoloji Gerçek zamanlı PCR-PCR (Real-Time PCR). Temel özelliği, polimeraz zincir reaksiyonu ürünlerinin birikiminin izlenmesi ve nicel analizi ve elde edilen sonuçların otomatik olarak kaydedilmesi ve yorumlanmasıdır. Bu yöntem, PCR için laboratuvar gereksinimlerini azaltan bir elektroforez adımı gerektirmez. Real-time PCR, amplifikasyon sırasında DNA'yı saptamak için floresan etiketli oligonükleotid probları kullanır. Gerçek zamanlı PCR, bir numunenin 20-60 dakika içinde tam bir analizine ve teorik olarak bir numunedeki tek bir DNA veya RNA molekülünü bile tespit etmenin bir yolunu sağlar.

Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonundaki (PCR izleme) ürün algılama sistemi, amplifiye DNA döngüsü döngüsünü döngü olarak izlemenizi sağlar. Sistem, hedef DNA'nın bir iç segmentine bağlanabilen (hibridize olabilen) bir oligonükleotid probu içerir. 5' ucunda, prob bir floresan haberci boya ile ve 3' ucunda bir engelleyici (söndürücü boya) ile etiketlenmiştir. PCR ürünü biriktikçe, prob ona hibritleşir, ancak raportör ve engelleyici arasındaki yakınlık nedeniyle parlama olmaz. Dizinin kopyalanmasının bir sonucu olarak, polimeraz probun 5' ucuna ulaşır. Polimerazın 5'-3'-eksonükleaz aktivitesi, floresan etiketi probun 3'-ucundan ayırır, böylece floresan haberciyi sinyal engelleyiciye bağlanmasından kurtarır, bu da floresansta bir artışa yol açar. Floresan seviyesi bu nedenle spesifik reaksiyon ürününün miktarı ile orantılıdır. PCR sonuçlarının kapalı tüplerde floresan varlığı ile kaydedilmesi önemlidir ve bu nedenle, bu yöntemin ana sorunlarından biri olan amplikon kontaminasyonu sorunu çözülür.

PCR'nin Avantajları: hızlı analiz; yüksek duyarlılık ve özgüllük; çalışılan materyalin minimum miktarı; uygulama kolaylığı ve tam otomasyon olasılığı.

PCR, şablon DNA'nın tek bir kopyasını saptamak kadar hassas olabileceğinden, yüksek hatalı pozitif sonuç riski vardır. Bu nedenle, PCR kurulurken, bir genetik tanı laboratuvarı, yerleşim düzeni ve çalışma modu için özel gereksinimlere sürekli olarak uymalıdır.

PCR, virolojik tanıda var olan tamamlayıcı yöntemlerden biridir. Bu reaksiyon, viral antijenlerin veya virüse özgü antikorların saptanamadığı durumlarda ve viral nükleik asit varlığının özellikle latent ve mikst enfeksiyonlarda enfeksiyonun tek kanıtı olabileceği durumlarda viral enfeksiyonların teşhisi için çok önemlidir.

Bir hata bulursanız, lütfen bir metin parçasını vurgulayın ve tıklayın. Ctrl+Enter.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve uygulaması. PCR analizi: nedir? PCR testi nasıl doğru yapılır PCR reaksiyonu nedir

PCR yürütmek

Reaksiyon bileşenleri

Primerler

amplifikatör

Reaksiyon ilerlemesi

denatürasyon

tavlama

Uzama

PCR çeşitleri

PCR uygulaması

kriminalistik

babalık kurmak

Tıbbi teşhis

Kişiselleştirilmiş tıp

gen klonlama

DNA dizilimi

mutajenez

polimeraz zincirleme tepki(PCR)

PCR yönteminin özü. DNA polimeraz

PCR yürütmek

PCR teşhisinin ilkeleri

Polimeraz zincir reaksiyonunun aşamaları

PCR uygulaması

Temel polimeraz zincir reaksiyonu yöntemlerindeki varyasyonlar

PCR'nin Tarihçesi

PCR yürütmek

Reaksiyon bileşenleri

Primerler

amplifikatör

Reaksiyon ilerlemesi

denatürasyon

tavlama

Uzama

PCR çeşitleri

PCR uygulaması

kriminalistik

babalık kurmak

Tıbbi teşhis

Kişiselleştirilmiş tıp

gen klonlama

DNA dizilimi

mutajenez

İlgili Makaleler