Gavo Nobelio premiją.

Metodo naudojimo pradžioje, po kiekvieno šildymo-aušinimo ciklo, į reakcijos mišinį reikėjo įpilti DNR polimerazės, nes ji buvo inaktyvuota. aukštos temperatūros būtina atskirti DNR spiralės grandines. Reakcijos procedūra buvo palyginti neefektyvi, reikalaujanti daug laiko ir fermentų. 1986 metais buvo žymiai patobulintas polimerazės grandininės reakcijos metodas. Buvo pasiūlyta naudoti termofilinių bakterijų DNR polimerazes. Šie fermentai pasirodė esantys termostabilūs ir gali atlaikyti daugybę reakcijos ciklų. Jų naudojimas leido supaprastinti ir automatizuoti PGR. Viena pirmųjų termostabilių DNR polimerazių buvo išskirta iš bakterijų Thermus aquaticus ir pavadintas Taq- polimerazė. Šios polimerazės trūkumas yra tai, kad klaidingo nukleotido įvedimo tikimybė yra gana didelė, nes šis fermentas neturi klaidų taisymo mechanizmų (3" → 5" egzonukleazės aktyvumas). Polimerazės pfu ir Pwo, išskirtos iš archajų, turi tokį mechanizmą, jų naudojimas žymiai sumažina DNR mutacijų skaičių, tačiau jų darbo greitis (procesiškumas) yra mažesnis nei Taq. Šiuo metu naudojami mišiniai Taq ir pfu pasiekti tiek didelį polimerizacijos greitį, tiek didelis tikslumas kopijavimas.

Metodo išradimo metu Cary Mullis dirbo sintetiniu chemiku (jis sintetino oligonukleotidus, kurie vėliau buvo naudojami taškinėms mutacijoms aptikti hibridizuojant su genomo DNR) korporacijoje Cetus, kuri patentavo PGR metodą. 1992 m. Cetus pardavė metodo teises ir naudojimo patentą Taq polimerazės kompanija „Hoffman-La Roche“ už 300 mln. Tačiau paaiškėjo, kad Taq-polimerazę apibūdino sovietų biochemikai A. Kaledinas, A. Sliusarenko ir S. Gorodetskis 1980 m., taip pat 4 metus prieš šį sovietinį leidinį, tai yra, 1976 m., amerikiečių biochemikai Alice Chien, David B. Edgar ir John M. Trela. Šiuo atžvilgiu bendrovė „Promega“ („Promega“) teisme bandė priversti „Roche“ atsisakyti išskirtinių teisių į šį fermentą. Amerikietiškas PGR metodo patentas pasibaigė 2005 m. kovo mėn.

PGR atlikimas

Metodas pagrįstas pakartotiniu selektyviu tam tikros DNR dalies kopijavimu, naudojant fermentus dirbtinės sąlygos (in vitro). Tokiu atveju nukopijuojama tik tas sritis, kuri atitinka nurodytas sąlygas, ir tik tuo atveju, jei ji yra tiriamoje imtyje. Priešingai nei DNR amplifikacija gyvuose organizmuose (replikacija), palyginti trumpos DNR dalys amplifikuojamos naudojant PGR. Įprastiniame PGR procese replikuotų DNR sričių ilgis yra ne didesnis kaip 3000 bazinių porų (3 kbp). Įvairių polimerazių mišinio pagalba, naudojant priedus ir tam tikromis sąlygomis PGR fragmento ilgis gali siekti 20-40 tūkstančių bazinių porų. Tai vis dar yra daug mažiau nei eukariotinės ląstelės chromosominės DNR ilgis. Pavyzdžiui, žmogaus genomas yra maždaug 3 milijardų bazinių porų ilgio.

Reakcijos komponentai

Paprasčiausiu atveju PGR reikalingi šie komponentai:

DNR šablonas, kuriame yra DNR dalis, kurią reikia amplifikuoti.
Du gruntai, papildantis priešingus norimos DNR fragmento skirtingų grandžių galus.
termostabilūs DNR polimerazė yra fermentas, katalizuojantis DNR polimerizaciją. Polimerazė, naudojama PGR, turi išlikti aktyvi aukštoje temperatūroje ilgas laikas, todėl naudojami iš termofilų išskirti fermentai - Thermus aquaticus(Taq polimerazė), Pyrococcus furiosus(Pfu polimerazė), Pyrococcus woesei(Pwo-polimerazė) ir kt.
Dezoksiribonukleozidų trifosfatai(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Mg 2+ jonai, reikalingi polimerazei veikti.
buferinis tirpalas, užtikrinant reikiamas reakcijos sąlygas – pH, tirpalo joninę stiprumą. Sudėtyje yra druskų, galvijų serumo albumino.

Kad reakcijos mišinys neišgaruotų, į mėgintuvėlį įpilama aukštai verdančio aliejaus, pavyzdžiui, vazelino. Jei naudojamas šildomas dangtelis, to nereikia.

Pirofosfatazės pridėjimas gali padidinti PGR reakcijos išeigą. Šis fermentas katalizuoja pirofosfato, šalutinio produkto, pridedant nukleotidų trifosfatų prie augančios DNR grandinės, hidrolizę į ortofosfatą. Pirofosfatas gali slopinti PGR reakciją.

Gruntai

PGR specifiškumas pagrįstas komplementarių kompleksų susidarymu tarp šablono ir pradmenų, trumpų sintetinių 18-30 bazių ilgio oligonukleotidų. Kiekvienas pradmuo papildo vieną iš dvigrandinio šablono grandinių ir riboja sustiprintos srities pradžią ir pabaigą.

Po šablono hibridizacijos su pradmeniu (atkaitinimas), pastarasis naudojamas kaip pradmuo DNR polimerazei sintezuojant šablono komplementarią grandinę (žr.).

Svarbiausia pradmenų charakteristika yra pradmenų ir matricų komplekso lydymosi temperatūra (Tm).

T m yra temperatūra, kurioje pusė DNR šablonų sudaro kompleksą su oligonukleotido pradmeniu. Vidutinė trumpojo oligonukleotido (ir ilgų DNR fragmentų) T m apskaičiavimo formulė, atsižvelgiant į K + jonų ir DMSO koncentraciją:

čia L – nukleotidų skaičius pradmenyje, K + – molinė kalio jonų koncentracija, G+C – visų guaninų ir citozinų suma.

Jei pradmens ilgis ir nukleotidų sudėtis arba atkaitinimo temperatūra parinkta neteisingai, gali susidaryti iš dalies papildantys kompleksai su kitomis DNR šablono sritimis, dėl kurių gali atsirasti nespecifinių produktų. Viršutinę lydymosi temperatūros ribą riboja optimali polimerazės veikimo temperatūra, kurios aktyvumas krenta aukštesnėje nei 80 °C temperatūroje.

Renkantis gruntus, pageidautina laikytis šių kriterijų:

stiprintuvas

Ryžiai. vienas: PGR cikleris

PGR atliekamas stiprintuve - įrenginyje, kuris periodiškai vėsina ir kaitina mėgintuvėlius, paprastai ne mažesniu kaip 0,1 ° C tikslumu. Šiuolaikiniai dviračiai leidžia nustatyti sudėtingas programas, įskaitant „karštojo paleidimo“, „Touchdown“ PGR (žr. toliau) ir paskesnį amplifikuotų molekulių saugojimą 4 °C temperatūroje. Realaus laiko PGR atveju gaminami prietaisai su fluorescenciniu detektoriumi. Prietaisus taip pat galima įsigyti su automatiniu dangteliu ir mikroplokštelių skyriumi, todėl juos galima integruoti į automatizuotas sistemas.

Reakcijos eiga

Gelio, kuriame yra žymeklio DNR (pirmasis ir paskutinis lizdas) ir PGR produktų, nuotrauka

Paprastai PGR metu atliekami 20-35 ciklai, kurių kiekvienas susideda iš trijų etapų (2 pav.).

Denatūravimas

Dvigrandė DNR šablonas kaitinamas iki 94-96°C (arba 98°C, jei naudojama ypač termostabili polimerazė) 0,5-2 min., kad DNR grandinės galėtų atsiskirti. Šis etapas vadinamas denatūravimas nes vandeniliniai ryšiai tarp dviejų DNR grandžių nutrūksta. Kartais prieš pirmąjį ciklą (prieš pridedant polimerazę) reakcijos mišinys pašildomas 2–3 min., kad visiškai denatūruotų šabloną ir pradmenis. Toks požiūris vadinamas karšta pradžia, tai leidžia sumažinti nespecifinių reakcijos produktų kiekį.

Atkaitinimas

Kai sruogos atskiriamos, temperatūra sumažinama, kad gruntai galėtų prisijungti prie viengubo šablono. Šis etapas vadinamas atkaitinimas. Atkaitinimo temperatūra priklauso nuo gruntų sudėties ir dažniausiai parenkama lygi gruntų lydymosi temperatūrai. Neteisingai pasirinkus atkaitinimo temperatūrą, pradmenys prastai prisiriša prie šablono (aukštesnėje temperatūroje), arba susiriša netinkamoje vietoje ir atsiranda nespecifinių produktų (žemoje temperatūroje). Atkaitinimo stadijos laikas yra 30 sek., tuo pačiu metu polimerazė jau spėja susintetinti kelis šimtus nukleotidų. Todėl rekomenduojama rinktis gruntus, kurių lydymosi temperatūra viršija 60 °C, ir atkaitinimą bei pailginimą atlikti vienu metu, 60-72 °C temperatūroje.

Pailgėjimas

DNR polimerazė replikuoja šablono grandinę, naudodama pradmenį kaip pradmenį. Tai yra etapas pailgėjimas. Polimerazė pradeda antrosios grandinės sintezę nuo 3" pradmens, kuris prisijungė prie šablono, galo ir juda palei šabloną, sintetindama naują grandinę kryptimi nuo 5" iki 3" galo. 72 °C. Pailgėjimo laikas priklauso ir nuo DNR polimerazės tipo, ir nuo amplifikuoto fragmento ilgio. Paprastai pailgėjimo laikas yra viena minutė kiekvienai tūkstančiui bazinių porų. Po visų ciklų dažnai atliekamas papildomas veiksmas. galutinis pailgėjimas užbaigti visus viengrandžius fragmentus. Šis etapas trunka 7-10 minučių.

Ryžiai. 2: Scheminis pirmojo PGR ciklo vaizdas. (1) Denatūravimas 94-96°C temperatūroje. (2) Atkaitinimas 68°C temperatūroje (pavyzdžiui). (3) Pailgėjimas 72°C temperatūroje (P = polimerazė). (4) Pirmasis ciklas baigtas. Dvi gautos DNR grandinės tarnauja kaip šablonas kitam ciklui, todėl šabloninės DNR kiekis padvigubėja per kiekvieną ciklą.

Specifinio reakcijos produkto kiekis (ribojamas pradmenų) teoriškai didėja proporcingai 2n - 2n, kur n yra reakcijos ciklų skaičius. Tiesą sakant, kiekvieno ciklo efektyvumas gali būti mažesnis nei 100%, taigi realybėje P ~ (1+E) n , kur P – produkto kiekis, E – vidutinis ciklo efektyvumas.

Auga ir „ilgųjų“ DNR kopijų skaičius, bet tiesiškai, todėl reakcijos produktuose dominuoja specifinis fragmentas.

Reikalingo produkto augimą eksponentiškai riboja reagentų kiekis, inhibitorių buvimas ir šalutinių produktų susidarymas. Paskutiniais reakcijos ciklais augimas sulėtėja, tai vadinama „plato efektu“.

PGR veislės

Įdėtas PGR(Nested PCR (eng.) ) – naudojamas šalutinių reakcijos produktų skaičiui sumažinti. Naudokite dvi poras pradmenų ir atlikite dvi reakcijas iš eilės. Antroji pradmenų pora amplifikuoja DNR sritį pirmosios reakcijos produkte.
Apverstas PGR(Inverse PCR (anglų k.) ) – naudojamas, jei žinomas tik mažas plotas norimoje sekoje. Šis metodas ypač naudingas, kai reikia nustatyti gretimas sekas po DNR įterpimo į genomą. Norint įgyvendinti apverstą PGR, atliekama eilė DNR pjūvių su restrikcijos fermentais, po to sujungiami fragmentai (ligavimas). Dėl to žinomi fragmentai yra abiejuose nežinomo regiono galuose, po kurių PGR gali būti atlikta kaip įprasta.
atvirkštinės transkripcijos PGR(Atvirkštinės transkripcijos PCR, RT-PCR (anglų k.) ) – naudojamas amplifikuoti, išskirti arba identifikuoti žinomą seką iš RNR bibliotekos. Prieš atliekant įprastą PGR, iRNR šablone, naudojant reversetazę, susintetinama viengrandė DNR molekulė ir gaunama viengrandė cDNR, kuri naudojama kaip PGR šablonas. Šis metodas dažnai nustato, kur ir kada šie genai yra išreikšti.
Asimetrinė PGR(Anglų) Asimetrinė PGR) – atliekama, kai reikia amplifikuoti daugiausia vieną iš pradinės DNR grandinių. Naudojamas kai kuriuose sekos nustatymo ir hibridizacijos analizės metoduose. PGR atliekama kaip įprasta, išskyrus tai, kad vienas iš pradmenų imamas dideliu pertekliumi. Šio metodo modifikacijos yra angliškos. L vidinis- A po- T jis- E xponential-PCR (LATE-PCR), kuriame naudojami skirtingų koncentracijų pradmenys, o žemos koncentracijos gruntas parenkamas su aukštesne (lydymosi temperatūra) nei didelės koncentracijos gruntas. PGR atliekama esant aukštai atkaitinimo temperatūrai, taip išlaikant reakcijos efektyvumą per visus ciklus.
Kiekybinė PGR(Kiekybinė PGR, Q-PGR) arba realaus laiko PGR- naudojamas tiesiogiai stebėti konkretaus PGR produkto kiekio matavimą kiekviename reakcijos cikle. Šis metodas naudoja fluorescenciniu būdu pažymėtus pradmenis arba DNR zondus, kad tiksliai išmatuotų reakcijos produkto kiekį, kai jis kaupiasi; arba naudojami fluorescenciniai interkaluojantys dažai Sybr Green I kuris jungiasi su dvigrande DNR. Sybr Green I suteikia paprastą ir ekonomišką galimybę PGR aptikti ir kiekybiškai nustatyti PGR produktus realiuoju laiku, nereikalaujant specialių fluorescencinių zondų ar pradmenų. Amplifikacijos metu dažai SYBR Green I integruojasi į mažąjį PGR produktų DNR griovelį ir skleidžia stipresnį fluorescencinį signalą nei nesusiję dažai, kai yra apšvitinti mėlynu lazeriu. SYBR Green I suderinamas su visais šiuo metu žinomais realaus laiko PGR instrumentais. Maksimali absorbcija skirta SYBR Green I yra 494 nm bangos ilgio. Be pagrindinės, dažų spektre yra du nedideli papildomi sugerties maksimumai – ties 290 nm ir 380 nm. Didžiausia emisija už SYBR Green I yra 521 nm bangos ilgio (žalia spalva).
Žingsnis PCR(Touchdown PCR (anglų k.) ) – naudojant šį metodą, sumažinama nespecifinio pradmenų surišimo įtaka. Pirmieji ciklai atliekami esant aukštesnei už optimalią atkaitinimo temperatūrą, tada kas keletą ciklų atkaitinimo temperatūra palaipsniui mažinama iki optimalios. Taip siekiama užtikrinti, kad pradmenys hibridizuotųsi su papildoma grandine per visą jos ilgį; tuo tarpu esant optimaliai atkaitinimo temperatūrai pradmenys iš dalies hibridizuojasi su komplementaria grandine. Dalinė pradmenų hibridizacija genominėje DNR sukelia nespecifinę amplifikaciją, jei pradmeniui yra pakankamai surišimo vietų. Daugeliu atvejų pirmieji dešimt PGR ciklų gali būti atliekami esant 72–75 °C atkaitinimo temperatūrai, o po to nedelsiant sumažinami iki optimalios, pavyzdžiui, iki 60–65 °C.
Molekulinės kolonijos metodas(PGR gelyje) Kolonija-PGR kolonija) - akrilamido gelis polimerizuojamas su visais PGR komponentais ant paviršiaus ir atliekama PGR. Taškuose, kuriuose yra analizuojama DNR, amplifikacija vyksta formuojant molekulines kolonijas.
PGR su greitu cDNR galų amplifikavimu(Anglų) Greitas cDNR galų amplifikavimas, RACE-PGR ).
Ilgų fragmentų PGR(Anglų) Ilgo nuotolio PGR) - PGR modifikavimas išplėstų DNR segmentų (10 tūkst. ir daugiau bazių) amplifikacijai. Naudojamas dviejų polimerazių mišinys, iš kurių viena yra Taq polimerazė, pasižyminti dideliu procesyvumu (tai yra, galinti susintetinti ilgą DNR grandinę vienu važiavimu), o antroji yra DNR polimerazė, turinti 3 "-5" egzonukleazės aktyvumą. dažniausiai Pfu polimerazė. Antroji polimerazė yra būtina norint ištaisyti pirmosios įvestas klaidas, nes Taq polimerazė sustabdo DNR sintezę, jei pridedamas nekomplementarus nukleotidas. Šį nekomplementarų nukleotidą pašalina Pfu polimerazė. Polimerazių mišinys imamas santykiu 50:1 arba net mažiau nei 100:1, kur Taq polimerazės imama 25-100 kartų daugiau, palyginti su Pfu polimeraze.
RAPD(Anglų) Atsitiktinė polimorfinės DNR amplifikacija ), PGR su atsitiktine polimorfinės DNR amplifikacija – naudojama, kai reikia atskirti organizmus, panašius genetine seka, pavyzdžiui, skirtingas veisles. auginami augalai, šunų veislės ar glaudžiai susiję mikroorganizmai. Šis metodas paprastai naudoja vieną gruntą mažas dydis(apie 10 bp). Šis pradmuo iš dalies papildys atsitiktines tiriamų organizmų DNR sritis. Pasirinkus sąlygas (pradžio ilgis, pradmenų sudėtis, temperatūra ir kt.), galima pasiekti patenkinamą dviejų organizmų PGR modelio skirtumą.
Konkrečios grupės PGR(Anglų) grupės specifinis PGR) – PGR susijusioms sekoms toje pačioje arba tarp skirtingų rūšių, naudojant konservatyvius šių sekų pradmenis. Pavyzdžiui, universalių pradmenų parinkimas ribosominiam 18S ir 26S genai, skirti rūšiai būdingo tarpgeninio tarpiklio amplifikacijai: genų seka 18S ir 26S yra konservatyvus tarp rūšių, todėl PGR tarp šių genų vyks visoms tirtoms rūšims. Šio metodo priešingybė yra unikalus PGR(Anglų) unikalus PGR), kurioje užduotis yra pasirinkti pradmenis, kad būtų galima sustiprinti tik tam tikrą seką tarp susijusių sekų.
PGR naudojant karštąjį paleidimą(Anglų) Karšto paleidimo PGR) - PGR modifikavimas naudojant DNR polimerazę, kai polimerazės aktyvumą kambario temperatūroje blokuoja antikūnai arba mažos molekulės, imituojančios antikūnus, pvz., Affibody, tai yra reakcijos metu prieš pirmąjį denatūravimą PGR. Paprastai pirmoji denatūracija atliekama 95 °C temperatūroje 10 minučių.
Virtualus PGR(angl. in silico PCR, digital PCR, electronic PCR, e-PCR) – matematinis metodas kompiuterinei teorinės polimerazės grandininės reakcijos analizei, naudojant pradmenų sekų (arba DNR zondų) sąrašą, siekiant numatyti galimą tiriamo genomo DNR amplifikaciją. , chromosoma, žiedinė DNR ar bet kuri kita DNR dalis.

Jei šablono nukleotidų seka iš dalies žinoma arba visai nežinoma, galima naudoti išsigimę pradmenys, kurios sekoje yra išsigimusių pozicijų, kuriose gali būti bet kokių bazių. Pavyzdžiui, pradmenų seka gali būti tokia: …ATH…, kur N - A, T arba C.

PGR taikymas

PGR naudojamas daugelyje sričių analizei ir moksliniams eksperimentams.

Kriminalistika

PGR naudojama vadinamiesiems „genetiniams pirštų atspaudams“ palyginti. Reikalingas genetinės medžiagos mėginys iš nusikaltimo vietos – kraujo, seilių, spermos, plaukų ir kt. Jis lyginamas su įtariamojo genetine medžiaga. Užtenka labai mažo DNR kiekio, teoriškai – vienos kopijos. DNR supjaustoma į fragmentus, tada amplifikuojama PGR. Fragmentai atskiriami DNR elektroforezės būdu. Gautas DNR juostų išsidėstymo vaizdas vadinamas genetinis pirštų atspaudas(Anglų) genetinis pirštų atspaudas).

Tėvystės nustatymas

Ryžiai. 3: DNR fragmentų, amplifikuotų PGR, elektroforezės rezultatai. (1) Tėvas. (2) Vaikas. (3) Motina. Vaikas paveldėjo kai kurias abiejų tėvų genetinio atspaudo ypatybes, kurios suteikė naują, unikalų įspaudą.

Nors „genetiniai pirštų atspaudai“ yra unikalūs (išskyrus identiškų dvynių atvejus), šeimos ryšius vis tiek galima užmegzti padarius kelis tokius pirštų atspaudus (3 pav.). Tas pats metodas su nedideliais pakeitimais gali būti taikomas evoliuciniams ryšiams tarp organizmų nustatyti.

Medicininė diagnostika

PGR leidžia žymiai pagreitinti ir palengvinti paveldimų ir virusinių ligų diagnostiką. Norimas genas amplifikuojamas PGR, naudojant tinkamus pradmenis, o tada sekvenuojamas, kad būtų nustatytos mutacijos. Virusinės infekcijos gali būti aptiktos iškart po užsikrėtimo, likus savaitėms ar mėnesiams iki ligos simptomų atsiradimo.

Individualizuota medicina

Kartais vaistai kai kuriems pacientams yra toksiški arba sukelia alergiją. To priežastys iš dalies yra individualūs vaistų ir jų darinių jautrumo ir metabolizmo skirtumai. Šie skirtumai nustatomi genetiniame lygmenyje. Pavyzdžiui, vienam ligoniui tam tikras citochromas (kepenų baltymas, atsakingas už pašalinių medžiagų apykaitą) gali būti aktyvesnis, pas kitą – mažiau. Norint nustatyti, kokio tipo citochromą turi konkretus pacientas, prieš vartojant vaistą, siūloma atlikti PGR analizę. Ši analizė vadinama preliminariu genotipo nustatymu. numatomas genotipų nustatymas).

Genų klonavimas

Genų klonavimas (nepainioti su organizmų klonavimu) yra genų išskyrimo ir dėl genų inžinerijos manipuliacijų didelio kiekio tam tikro geno produkto gavimo procesas. PGR naudojamas amplifikuoti geną, kuris vėliau įterpiamas į vektorius- DNR fragmentas, pernešantis svetimą geną į tą patį ar kitą patogų augti organizmą. Kaip vektoriai, pavyzdžiui, naudojamos plazmidės arba virusinė DNR. Genų įterpimas į svetimą organizmą dažniausiai naudojamas šio geno produktui – RNR arba dažniausiai baltymui gauti. Tokiu būdu pramoniniais kiekiais gaunama daug baltymų, skirtų naudoti žemės ūkyje, medicinoje ir kt.

Ryžiai. keturi: Genų klonavimas naudojant plazmidę.
(1) A organizmo chromosominė DNR. (2) PGR. (3) Kelios organizmo A geno kopijos. (4) Geno įterpimas į plazmidę. (5) Plazmidė su organizmo A genu. (6) Plazmidės įvedimas į organizmą B. (7) Organizmo A geno kopijos skaičiaus dauginimas organizme B.

DNR sekos nustatymas

Atliekant sekos nustatymo metodą, naudojant dideoksinukleotidus, paženklintus fluorescencine žyme arba radioaktyviu izotopu, PGR yra neatsiejama dalis, nes būtent polimerizacijos metu į DNR grandinę įterpiami fluorescencine arba radioaktyvia žyme pažymėti nukleotidų dariniai. Dideoksinukleotido pridėjimas prie susintetintos grandinės nutraukia sintezę, todėl po atskyrimo gelyje galima nustatyti konkrečių nukleotidų padėtį.

Mutagenezė

Šiuo metu PGR tapo pagrindiniu metodu atliekant mutagenezę (įvedant pokyčius DNR nukleotidų sekoje). PGR naudojimas leido supaprastinti ir pagreitinti mutagenezės procedūrą, taip pat padaryti ją patikimesnę ir atkuriamą.

Polimerazė grandininė reakcija(PGR)

PGR metodo esmė. DNR polimerazė

Polimerazės grandininė reakcija – eksperimentinis molekulinės biologijos metodas, leidžiantis pasiekti reikšmingą mažų tam tikrų nukleorūgščių fragmentų koncentracijų padidėjimą biologinėje medžiagoje. Šis DNR kopijų skaičiaus didinimo procesas vadinamas stiprinimas. DNR kopijavimas PGR metu atliekamas specialiu fermentu - polimerazė. DNR polimerazė (3 pav.) – tai fermentas, dalyvaujantis DNR replikacijoje (DNR amplifikacijoje gyvuose organizmuose). Šios klasės fermentai katalizuoja dezoksiribonukleotidų polimerizaciją išilgai DNR nukleotidų grandinės, kurią fermentas „perskaito“ ir naudoja kaip šabloną. Naujo nukleotido tipas nustatomas pagal komplementarumo su šablonu, iš kurio atliekamas skaitymas, principą.

DNR polimerazė prideda laisvųjų nukleotidų prie 3 "surinktos grandinės galo. Dėl to grandinė pailgėja 5"-3 kryptimi. Nė viena iš žinomų DNR polimerazių nesugeba sukurti grandinės "nuo nulio": jos yra tik gali pridėti nukleotidus prie jau esančios 3"-hidroksilo grupės. Dėl šios priežasties reikia DNR polimerazės gruntas– trumpa nukleotidų seka (dažniausiai 20–25), papildanti tiriamo geno galines dalis – prie kurios ji galėtų pridėti pirmąjį nukleotidą. Pradmenys visada susideda iš DNR ir RNR bazių, o pirmosios dvi bazės visada yra RNR bazės. Pradmenis sintetina kitas fermentas - primasas. Kitas fermentas yra helikaze- būtinas DNR dvigubos spiralės išvyniojimui susidarant viengrandei struktūrai, kuri užtikrina abiejų grandinių replikaciją pagal pusiau konservatyvų DNR replikacijos modelį.

Kai kurios DNR polimerazės taip pat turi galimybę ištaisyti klaidas naujai surinktoje DNR grandinėje. Jei aptinkama neteisinga nukleotidų pora, DNR polimerazė pasisuka vienu žingsniu atgal, pašalina iš grandinės netinkamą nukleotidą, tada į jo vietą įterpia tinkamą, o po to replikacija tęsiasi kaip įprasta.

PGR atlikimas

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) – tai DNR amplifikacijos metodas, leidžiantis per kelias valandas išskirti ir padauginti tam tikrą DNR seką milijardus kartų. Galimybė gauti didelis kiekis vienos griežtai apibrėžtos genomo srities kopijos labai supaprastina esamo DNR mėginio tyrimą.

Kad polimerazės grandininė reakcija įvyktų, turi būti įvykdytos kelios sąlygos. Paprasčiausiu atveju PGR reikalingi šie komponentai:

DNR šablonas, kuriame yra amplifikuotinos DNR dalis.

Du pradmenys, papildantys norimo fragmento galus. (Dirbtinai susintetintų oligonukleotidų pora, dažniausiai 15–30 bp dydžio, identiškų tikslinės DNR atitinkamoms sritims. Jie atlieka pagrindinį vaidmenį formuojantis amplifikacijos reakcijos produktams. Tinkamai parinkti pradmenys užtikrina tyrimo specifiškumą ir jautrumą sistema.)

Termostabili DNR polimerazė. PGR naudojama polimerazė turi išlikti aktyvi aukštoje temperatūroje ilgą laiką, todėl naudojami iš termofilų išskirti fermentai - Thermus aquaticus (Taq polimerazė) ir kt.

Deoksinukleotido trifosfatai (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Mg 2+ jonai, reikalingi polimerazei veikti.

Buferinis tirpalas, užtikrinantis reikiamas reakcijos sąlygas – pH, tirpalo joninę stiprumą. Sudėtyje yra druskų, serumo albumino.

Kad reakcijos mišinys neišgaruotų, į mėgintuvėlį įpilama aukštai verdančio aliejaus, pavyzdžiui, vazelino. Jei naudojamas prietaisas su šildomu dangčiu, to nereikia.

Norint padauginti pradinės DNR kopijų skaičių, reikalinga ciklinė reakcija. Paprastai kiekvienas iš eilės kartojamas PGR ciklas susideda iš trijų etapų:

1. Denatūracija arba DNR „lydymas“. Dvigubos grandinės DNR šablonas kaitinamas iki 94–96 °C (arba 98 °C, jei naudojama ypač termostabili polimerazė) 0,5–2 minutes, kad DNR grandinės galėtų atsiskirti. Šis žingsnis vadinamas denatūravimu, nes nutrūksta vandenilio ryšiai tarp dviejų DNR grandžių. Kartais prieš pirmąjį ciklą (prieš pridedant polimerazę) reakcijos mišinys pašildomas 2–5 minutes, kad visiškai denatūruotų šabloną ir pradmenis. Šis požiūris vadinamas karšta pradžia, tai leidžia sumažinti nespecifinių reakcijos produktų kiekį.

2. Atkaitinimas – pradmenų prisijungimas prie šabloninės DNR. Kai sruogos atsiskiria, temperatūra lėtai mažinama, kad gruntai galėtų prisijungti prie viengubo šablono. Atkaitinimo temperatūra priklauso nuo grunto sudėties ir dažniausiai parenkama 50–65°C. Scenos laikas - 20 - 60 sekundžių. Neteisingai pasirinkus atkaitinimo temperatūrą, pradmenys prastai prisiriša prie šablono (aukštesnėje temperatūroje), arba susiriša netinkamoje vietoje ir atsiranda nespecifinių produktų (žemoje temperatūroje).

3. Sintezė (grandinės pailgėjimas). DNR polimerazė replikuoja šablono grandinę, naudodama pradmenį kaip „sėklą“. Polimerazė pradeda antrosios grandinės sintezę nuo 3" grunto galo, kuris prisijungė prie šablono ir juda palei šabloną. Pailgėjimo temperatūra priklauso nuo polimerazės. Dažniausiai naudojamos Taq ir Pfu polimerazės aktyviausios 72 °C amplifikuojamo fragmento ilgis Paprastai pailgėjimo laikas yra viena minutė kiekvienam tūkstančiui bazinių porų. Pasibaigus visiems ciklams, dažnai atliekamas papildomas veiksmas galutinis pailgėjimas užbaigti visus viengrandžius fragmentus. Šis etapas trunka 7-10 minučių.

Vėliau denatūravimo, atkaitinimo ir pailgėjimo etapai kartojami daug kartų (30 ir daugiau kartų). Kiekviename cikle susintetintų DNR fragmento kopijų skaičius padvigubėja.

Visos reakcijos atliekamos mėgintuvėliuose, panardintuose į termostatą. Temperatūros režimo keitimas ir jo priežiūra vykdoma automatiškai.

Norint tiksliai suprasti, kaip vyksta tam tikro DNR segmento amplifikacija PGR metu, būtina aiškiai suprasti visų pradmenų ir jų papildomų sekų padėtį amplifikuojamose grandinėse kiekviename raunde. Pirmajame raunde kiekviena naujai susintetinta grandinė yra daug ilgesnė nei atstumas nuo jos pradmens 3" hidroksilo grupės iki antrajam pradmeniui komplementarios sekos galinio nukleotido. Tokios grandinės vadinamos "ilgais šablonais". ant jų vyks tolesnė sintezė.

Antrajame raunde dvigrandė DNR, susidedanti iš panašių ir naujai susintetintų (ilgo šablono) grandžių, vėl denatūruojama, o po to atkaitinama pradmenimis. Šio etapo sintezės metu vėl susintetinami „ilgieji šablonai“, taip pat daugybė gijų, kurių viename gale yra pradmuo, o kitame – seka, kuri papildo antrąjį pradmenį („trumpieji šablonai“). Trečiojo raundo metu visi anksčiau susidarę heterodupleksai vienu metu denatūruojami ir atkaitinami pradmenimis, o po to pakartojami. Vėlesniuose turuose „trumpųjų matricų“ atsiranda vis daugiau, o 30-ajame raunde jų skaičius jau yra 10 6 kartus didesnis nei pradinių grandinių arba „ilgų matricų“.

Specifinio reakcijos produkto kiekis (ribojamas pradmenų) teoriškai proporcingai didėja iki 2 n , kur n yra reakcijos ciklų skaičius. Tiesą sakant, kiekvieno ciklo efektyvumas gali būti mažesnis nei 100%, todėl iš tikrųjų:

kur P – produkto kiekis, E – vidutinis ciklo efektyvumas.

Auga ir „ilgųjų“ DNR kopijų skaičius, bet tiesiškai, todėl reakcijos produktuose dominuoja specifinis fragmentas. Reikalingo produkto augimą eksponentiškai riboja reagentų kiekis, inhibitorių buvimas ir šalutinių produktų susidarymas.

PGR yra labai jautrus metodas, todėl, jei tiriamajame mėginyje yra net nežymus DNR kiekis, kuris atsitiktinai pateko iš vieno reakcijos mišinio į kitą, gali būti gauti klaidingai teigiami rezultatai. Dėl to būtina atidžiai kontroliuoti visus PGR naudojamus tirpalus ir indus.

Pagrindiniai grunto parinkimo principai.

Kuriant PGR testavimo sistemą, viena iš pagrindinių užduočių yra teisingas pradmenų pasirinkimas, kuris turi atitikti keletą kriterijų:

1. Gruntai turi būti specifiniai. Ypatingas dėmesys skiriamas 3" pradmenų galams, nes būtent nuo jų Taq polimerazė pradeda užbaigti komplementarią DNR grandinę. Jei jų specifiškumas yra nepakankamas, tada mėgintuvėlyje su reakcijos mišiniu greičiausiai įvyks nepageidaujami procesai. , būtent nespecifinės DNR (trumpų ar ilgų fragmentų) sintezė.Jis matomas elektroforezės metu sunkių ar lengvų papildomų juostų pavidalu.Tai apsunkina reakcijos rezultatų įvertinimą, nes lengva supainioti konkrečią amplifikacijos produktas su susintetinta svetima DNR. Kai kurie pradmenys ir dNTP sunaudojami nespecifinės DNR sintezei, todėl labai prarandamas jutimas.

2. Gruntai neturi formuoti dimerų ir kilpų, t.y. nereikėtų formuoti stabilių dvigubų sruogų, atkaitinant gruntus prie savęs ar vienas su kitu.

Polimerazės grandininė reakcija (PGR)- tai biocheminės technologijos metodas molekulinėje biologijoje, atliekamas siekiant padidinti vieną ar daugiau DNR fragmentų kopijų keliais laipsniais, leidžiantis sukurti nuo kelių tūkstančių iki milijonų konkrečios DNR sekos kopijų.

1983 m. Cary Mullis sukurtas PGR metodas dabar yra įprastas ir dažnai nepakeičiamas metodas, naudojamas medicinos ir biologinių tyrimų laboratorijose įvairioms reikmėms. Tai apima DNR klonavimą sekos nustatymui, DNR pagrįstą filogeniją arba funkcinę genų analizę; paveldimų ligų diagnostika; genetinių pirštų atspaudų (naudojamų teismo medicinos šakose ir atliekant tėvystės tyrimus), taip pat identifikavimas ir diagnostika užkrečiamos ligos. 1993 m. Mullis buvo apdovanotas Nobelio chemijos premija kartu su Michaelu Smithu už jų darbą PGR srityje.

Metodas pagrįstas terminiu ciklu, susidedančiu iš kartotinių šildymo ir aušinimo reakcijų ciklų, siekiant denatūruoti ir atkartoti DNR fermentais. Pradmenys (trumpos DNR dalys), turinčios sekos, kurios papildo tikslinę vietą kartu su DNR polimeraze (iš kurios ir gavo savo pavadinimą). pagrindiniai komponentai paleisti atrankinį ir pakartotinį stiprinimą. PGR procese pati susintetinta DNR naudojama kaip replikacijos šablonas, suaktyvinant grandininę reakciją, kurios metu šabloninė DNR amplifikuojama eksponentiškai. PGR gali būti žymiai pakeistas, kad būtų atliktas Didelis pasirinkimas genetinė manipuliacija.

Beveik visose PGR programose naudojama termostabili DNR polimerazė, tokia kaip Taq polimerazė, iš bakterijų išskirtas fermentas. Termusasaquaticus. Ši DNR polimerazė iš DNR statybinių blokų – nukleotidų – fermentiniu būdu surenka naują DNR grandinę, kaip šabloną naudodama viengrandę DNR ir DNR oligonukleotidus (taip pat vadinamus DNR pradmenimis), kurie reikalingi DNR sintezei inicijuoti. Daugumoje PGR metodų naudojamas terminis ciklas, ty kaitinamas ir aušinamas PGR mėginys per tam tikrą temperatūros pakopų seriją. Šių terminio ciklo etapų pirmiausia reikia norint fiziškai atskirti dvi DNR dvigubos spiralės grandines aukštoje temperatūroje, procese, vadinamame DNR denatūravimu. Esant žemesnei temperatūrai, kiekviena grandinė bus naudojama kaip šablonas DNR sintezėje, naudojant DNR polimerazę, siekiant selektyviai amplifikuoti tikslinę DNR sritį. PGR rezultatų selektyvumas naudojant pradmenis, kurie papildo tikslinę DNR sritį amplifikacijai tam tikromis terminio ciklo sąlygomis.

PGR diagnostikos principai

PGR naudojama tam tikrai DNR grandinės atkarpai (tikslinės DNR) amplifikuoti. Dauguma PGR metodų paprastai amplifikuoja DNR fragmentus iki ~ 10 000 bazinių porų (kb), nors kai kurie metodai leidžia fragmentus padidinti iki 40 kb dydžio. Reakcijos metu susidaro ribotas galutinio amplifikuoto produkto kiekis, kurį kontroliuoja turimi reagentai reakcijos metu ir reakcijos produktų grįžtamasis ryšys.

Pagrindiniam PGR rinkiniui reikalingi keli komponentai ir reagentai. Jie apima:

DNR šablonas, kuriame yra tikslinė DNR sritis, kurią reikia amplifikuoti.
du gruntai, papildo kiekvienos tikslinės DNR sensorinės ir antisensinės grandinės 3' galus.
Taq polimerazė arba kita DNR polimerazė, veikianti optimalioje maždaug 70°C temperatūroje.
Deoksinukleozidų trifosfatai(dNTP; trifosfatinės grupės, kuriose yra nukleotidų), statybiniai blokai, iš kurių DNR polimerazė sintezuoja naują DNR grandinę.
buferinis tirpalas suteikiant tinkamas cheminės sąlygos optimaliam DNR polimerazės aktyvumui ir stabilumui.
dvivalenčių katijonų, magnio arba mangano jonai; Dažniausiai naudojamas Mg2+, tačiau Mn2+ gali būti naudojamas ir PGR sąlygotai DNR mutagenezei, nes didesnės Mn2+ koncentracijos padidina klaidų dažnį DNR sintezės metu.
Monovalentiniai katijonai kalio jonų.

PGR paprastai atliekama naudojant 10–200 µl reakcijos tūrį mažuose reakcijos mėgintuvėliuose (tūris 0,2–0,5 ml) termocikleryje-stiprintuve. Cikleris šildo ir aušina reakcijos vamzdelius, kad pasiektų kiekvienam reakcijos etapui reikalingą temperatūrą. Daugelis šiuolaikinių dviratininkų naudoja Peltier efektą, kuris leidžia šildyti ir vėsinti PGR vamzdžių mazgą tiesiog keičiant elektros srovės kryptį. Plonasieniai reakcijos vamzdeliai skatina palankų šilumos laidumą, kad būtų užtikrinta greita šiluminė pusiausvyra. Senesniems dviračiams, neturintiems šildomo dangčio, reakcijos mišinio paviršiuje reikia aliejaus sluoksnio arba vaško granulės buteliuke.

Procedūros tvarka

Paprastai PGR susideda iš 20–40 pasikartojančių temperatūros pokyčių, vadinamų ciklais, serijos, o kiekvienas ciklas paprastai susideda iš 2–3 atskirų temperatūros pakopų, dažniausiai trijų. Važiavimas dviračiu dažnai prasideda ir baigiasi vienu temperatūros žingsniu (vadinamuoju numatymas) esant aukštai temperatūrai (> 90 °C), skirta galutiniam produkto išsiplėtimui arba trumpam laikymui. Kiekviename cikle naudojamos temperatūros ir jų taikymo trukmė priklauso nuo daugelio parametrų. Tai apima DNR sintezei naudojamą fermentą, dvivalenčių jonų ir dNTP koncentraciją reakcijoje ir pradmenų lydymosi temperatūrą (Tm).

Inicializacijos etapas:Šis etapas susideda iš reakcijos kaitinimo iki 94-96°C (arba 98°C, jei naudojamos labai karščiui atsparios polimerazės) temperatūros, kuri vyksta 1-9 minutes. Šis veiksmas reikalingas tik DNR polimerazėms, kurioms reikalingas šiluminis aktyvinimas, vadinamasis karšto paleidimo PGR.
Denatūravimo etapas: Tai pirmasis reguliarus terminio ciklo įvykis, kurį sudaro reakcijos kaitinimas iki 94–98 °C 20–30 sekundžių. Tai sukelia DNR šablono skilimą, sunaikinant vandenilinius ryšius tarp komplementarių bazių ir susidaro vienos grandinės DNR molekulės.
Atkaitinimo žingsnis: Reakcijos temperatūra sumažinama iki 50-65°C 20-40 sekundžių, todėl pradmenys gali prisijungti prie viengrandžių DNR šablono. Paprastai atkaitinimo temperatūra yra apie 3–5 laipsniais Celsijaus žemesnė už naudojamų gruntų Tm. Stabilios DNR-DNR vandenilinės jungtys susidaro tik tada, kai pradmenų seka labiau atitinka sekos šabloną. Polimerazė prisijungia prie pradmenų ir šablonų hibrido ir inicijuoja DNR sintezę.
Išsiplėtimo / pailgėjimo etapas: Temperatūra šiame etape priklauso nuo naudojamos DNR polimerazės; Taq polimerazės optimali aktyvumo temperatūra yra 75-80°C; šiam fermentui paprastai naudojama 72°C temperatūra. Šiame etape DNR polimerazė sintezuoja naują DNR grandinę, papildančią DNR šablono grandinę, pridėdama dNTP, kurie papildo šabloną 5"–3" kryptimi, sujungdama dNTP 5" fosfato grupę su 3" hidroksilo grupe. pabaigoje susidariusios (išsiplečiančios ) DNR. Išsiplėtimo laikas priklauso ir nuo naudojamos DNR polimerazės, ir nuo amplifikuojamo DNR fragmento ilgio. Paprastai, esant optimaliai temperatūrai, DNR polimerazė polimerizuoja tūkstantį bazių per minutę. Esant optimalioms sąlygoms, t.y. nesant apribojimų dėl ribojančių substratų ar reagentų, kiekviename išplėtimo etape tikslinės DNR kiekis padvigubinamas, todėl DNR fragmentas amplifikuojamas eksponentinis (geometrinis).
Galutinis pratęsimas: Tai yra vienintelis žingsnis, kartais atliekamas 70–74 °C temperatūroje 5–15 minučių po paskutinio PGR ciklo, siekiant užtikrinti, kad likusi vienos grandinės DNR būtų visiškai išsiplėtusi.
Galutinis lūkestis:Šis etapas 4–15 °C temperatūroje gali būti naudojamas neribotą laiką, kad reakcija būtų trumpa. Norint patikrinti, ar PGR susintetino laukiamą DNR fragmentą (taip pat kartais vadinamą „amplimeriu“ arba „amplikonu“), PGR produktų atskyrimui pagal dydį naudojama agarozės gelio elektroforezė. PGR produktų dydis nustatomas lyginant su DNR kopėčiomis (molekulinės masės žymekliu), kurioje yra žinomo dydžio DNR fragmentai, atliekami ant gelio kartu su PGR produktais.

Polimerazės grandininės reakcijos etapai

PGR procesą galima suskirstyti į tris etapus:

Eksponentinis stiprinimas: Kiekvieno ciklo metu produkto kiekis padvigubinamas (darant prielaidą, kad reakcijos efektyvumas yra 100%). Reakcija labai jautri: reikia tik nedidelio DNR kiekio.
Išlyginimo etapas: reakcija sulėtėja, nes DNR polimerazė praranda aktyvumą, o vartojant reagentus, tokius kaip dNTP ir pradmenys, jie tampa riboti .
Plokščiakalnis: Produktas nebesikaupia dėl reagentų ir fermentų išeikvojimo.

PGR optimizavimas

Praktiškai PGR gali būti nesėkmingas įvairių priežasčių, ypač dėl jo jautrumo užteršimui, dėl kurio padaugėja šalutinių DNR produktų. Šiuo atžvilgiu buvo sukurta daugybė metodų ir procedūrų, skirtų optimizuoti PGR sąlygas. Užteršimas svetima DNR tvarkomas taikant laboratorinius protokolus ir procedūras, kuriomis išgryninami galimų DNR teršalų mišiniai prieš PGR. Paprastai tai apima PGR rinkinių atskyrimą nuo PGR produktų analizės arba valymo zonų, vienkartinių plastikinių indų naudojimą ir kruopštų darbo paviršiaus valymą tarp reakcijos etapų. Pradmenų projektavimo metodai atlieka svarbų vaidmenį gerinant PGR produktų išskyrimą ir išvengiant šalutinių produktų susidarymo, o alternatyvių buferinių komponentų arba polimerazės fermentų naudojimas gali padėti amplifikuoti ilgas ar kitaip problemiškas DNR sritis. Reagentų, tokių kaip formamidas, pridėjimas į buferines sistemas gali padidinti PGR specifiškumą ir išgauti. Galima atlikti kompiuterinį teorinių PGR rezultatų modeliavimą (elektroninį PGR), kad būtų lengviau suprojektuoti pradmenis.

PGR taikymas

Selektyvus DNR išskyrimas

PGR leidžia išskirti DNR fragmentus iš genominės DNR, selektyviai amplifikuojant tam tikrą DNR sritį. Šis PGR taikymas papildo daugelį metodų, pavyzdžiui, hibridizacijos zondų kūrimą Southern arba Northern blotavimo ir DNR klonavimo metodams, kuriems reikalingi dideli DNR kiekiai, atstovaujantys tam tikram DNR regionui. PGR suteikia šiuos metodus su dideliu grynos DNR kiekiu, kuris leidžia analizuoti DNR mėginius net ir naudojant nedidelį pradinės medžiagos kiekį.

Kiti PGR pritaikymai apima DNR sekos nustatymą, siekiant nustatyti nežinomas PGR amplifikuotas sekas, kai vienas iš amplifikacinių pradmenų gali būti naudojamas Sanger sekvenavimui, DNR sekos išskyrimas, siekiant pagreitinti rekombinantinės DNR technologijas, apimančias DNR sekos įterpimą į plazmidę arba genetinę medžiagą. kito organizmo. Bakterijų (E. coli) kolonijos gali būti greitai patikrintos PGR, kad būtų ištaisyta vektorinė DNR. PGR taip pat gali būti naudojamas genetiniams pirštų atspaudams imti; teismo medicinoje naudojama metodika asmens ar organizmo identifikavimui lyginant eksperimentinę DNR, naudojant įvairius PGR metodus.

Kai kurie „pirštų atspaudų“ PGR metodai turi didelę diskriminacinę galią ir gali būti naudojami genetiniams ryšiams tarp asmenų, pvz., tėvų ir vaikų arba tarp brolių ir seserų, nustatyti, ir yra naudojami tiriant tėvystę. Šis metodas taip pat gali būti taikomas evoliuciniams ryšiams tarp organizmų nustatyti.

DNR amplifikacija ir kiekybinis nustatymas

Kadangi PGR padidina tikslinių DNR sričių kopijų skaičių, PGR galima naudoti labai mažiems mėginio kiekiams analizuoti. Tai dažnai labai svarbu atliekant teismo medicinos tyrimus, kai kaip įrodymas yra tik nedideli DNR kiekiai. PGR taip pat gali būti naudojamas analizuoti senovės DNR, kuri yra dešimtys tūkstančių metų. Šie PGR metodai buvo sėkmingai naudojami gyvūnams, tokiems kaip 40 000 metų senumo mamutas, taip pat žmogaus DNR, pradedant Egipto mumijų analize ir baigiant Rusijos caro identifikavimu.

Kiekybiniais PGR metodais įvertinamas tam tikros sekos kiekis mėginyje, dažnai naudojamas genų ekspresijos lygiui nustatyti. Realaus laiko PGR yra sukurtas DNR kiekybinio nustatymo įrankis, matuojantis produkto DNR kaupimąsi po kiekvieno PGR amplifikacijos ciklo.

PGR diagnozuojant ligas

PGR leidžia ankstyva diagnostika piktybinės ligos, pavyzdžiui, leukemija ir limfoma, kuri šiuo metu yra labai išvystyta vėžio tyrimuose ir jau naudojama reguliariai. PGR gali būti atlikta tiesiogiai su genominiais DNR mėginiais, siekiant aptikti translokacijai specifines piktybines ląsteles, kurių jautrumas yra bent 10 000 kartų didesnis nei kitų metodų.

PGR taip pat leidžia aptikti nekultivuojamus arba lėtai augančius organizmus, tokius kaip mikobakterijos, anaerobinės bakterijos ir virusai iš audinių kultūros ir gyvūnų modelių. PGR diagnostikos taikymo mikrobiologijos srityje pagrindas yra infekcinių sukėlėjų identifikavimas ir nepatogeninių padermių atskyrimas nuo patogeninių dėl specifinių genų.

Viruso DNR taip pat galima aptikti PGR būdu. Pradmenys turi būti specifiniai viruso tikslinėms DNR sekoms, o PGR gali būti naudojamas diagnostiniams DNR tyrimams arba viruso genomo sekos nustatymui. Didelis PGR jautrumas leidžia aptikti virusus netrukus po užsikrėtimo ir net prieš prasidedant ligai. Šis ankstyvas viruso nustatymas gali suteikti gydytojams reikšmingų gydymo galimybių. Viruso kiekį („viruso apkrovą“) pacientui taip pat galima nustatyti atliekant kiekybinę PGR pagrįstą DNR analizę.

Pagrindinių polimerazės grandininės reakcijos metodų variantai

Aleliui specifinis PGR: diagnostinis arba klonavimo metodas, pagrįstas vieno nukleotido polimorfizmais (SNP) (vienos bazės skirtumai DNR). Reikia išankstinių žinių apie DNR seką, įskaitant alelių skirtumus, ir naudojami pradmenys, kurių 3' galai apima SNP. Griežta PGR amplifikacija yra daug mažiau efektyvi, jei šablonas ir pradmuo nesutampa, todėl sėkmingas amplifikavimas naudojant specifinį SNP pradmenų signalai apie specifinių SNP buvimą sekoje.
PGR mazgas arba polimerazės ciklo mazgas (PCP): dirbtinė ilgų DNR sekų sintezė PGR metodu ilgų oligonukleotidų su trumpais persidengiančiais segmentais telkinyje. Oligonukleotidai pakaitomis keičia jutiminę ir antisensinę grandinių kryptis, o persidengiantys segmentai nustato PGR fragmentų tvarką, tokiu būdu selektyviai generuodami galutinį ilgą DNR produktą.
Asimetrinė PGR: pirmiausia amplifikuoja vieną DNR grandinę dvigrandės DNR šablone. Naudojamas sekos nustatymui ir hibridizacijos zondavimui, kai reikia amplifikuoti tik vieną iš dviejų papildomų grandžių. PGR atliekama kaip įprasta, tačiau su dideliu amplifikacijai skirtos grandinės pradmenų pertekliumi. Dėl lėtos (aritmetinės progresijos) amplifikacijos reakcijos pabaigoje panaudojus ribojantį pradmenį, reikalingi papildomi PGR ciklai. Naujausioje šio proceso modifikacijoje, žinomoje kaip „LATE-PCR“ (tiesiškumas po eksponentinės fazės – PGR), naudojamas ribinis pradmuo, kurio lydymosi temperatūra (Tm) yra aukštesnė nei pradmenų perteklius, kad būtų išlaikytas reakcijos efektyvumas, nes mažėja ribinio pradmens koncentracija. reakcijos viduryje.
Išrinkimo PGR: labai lygiagretus metodas gauti tikslias DNR molekules genų sintezei. Sudėtingas DNR molekulių telkinys modifikuojamas unikaliomis šoninėmis žymėmis, kad būtų atlikta didžiulė lygiagreta seka. Tada į žymę nukreipti pradmenys suteikia sekvenuotas molekules PGR būdu.
Nuo helikazės priklausomas stiprinimas: panašus į tradicinį PGR, bet reikalauja pastovios temperatūros nei denatūravimo ir atkaitinimo / plėtimosi ciklai. Vietoj šilumos denatūravimo naudojama DNR helikazė, fermentas, kuris išvynioja DNR.
Karšto paleidimo PGR: metodas, kuris sumažina nespecifinį amplifikaciją pradinio PGR etapų nustatymo metu. Galima atlikti rankiniu būdu, kaitinant reakcijos komponentus iki denatūravimo temperatūros (pvz., 95 °C), prieš įdedant polimerazę. Sukurtos specializuotos fermentų sistemos, kurios slopina polimerazės aktyvumą kambario temperatūroje arba jungiantis antikūnus, arba esant kovalentiškai surištiems inhibitoriams, kurie disocijuoja tik po aktyvavimo aukštoje temperatūroje. Karšto paleidimo / šalto užbaigimo PGR pasiekiama naudojant naujas hibridines polimerazes, kurios yra neaktyvios aplinkos temperatūroje ir akimirksniu aktyvuojamos pailgėjimo temperatūroje.
Intermikrosatelitinės sekos specifinė PGR (ISSR): PGR DNR pirštų atspaudų ėmimo metodas, kuris padidina regionų kopijų skaičių tarp paprastų pasikartojančių sekų, kad iš amplifikuoto fragmento ilgio būtų gautas unikalus piršto atspaudas.
Apverstas PGR plačiai naudojamas sekos regionams aplink genominius intarpus apibrėžti. Tai apima eilę DNR skilimų ir savaiminio susijungimo, todėl žinomos sekos abiejuose nežinomos sekos galuose.
PGR tarpininkaujant ligavimui: Naudoja mažus DNR linkerius, susietus su dominančia DNR, ir keletą pradmenų, susietų su DNR jungtimis; naudojamas DNR sekos nustatymui, genomo vaikščiojimui ir DNR pėdsakų nustatymui.
Metilinimui specifinis PGR(MSP): Johnso Hopkinso medicinos mokykloje sukūrė Stephenas Bailinas ir Jimas Hermanas, jis naudojamas aptikti CpG salų metilinimą genominėje DNR. Pirmiausia DNR apdorojama natrio bisulfitu, kuris nemetilintas citozino bazes paverčia uracilu, kurį PGR pradmenys atpažįsta kaip timiną. Tada modifikuotai DNR atliekami du PGR, naudojant identiškų pradmenų rinkinius, išskyrus bet kurią CpG salą pradmenų sekoje. Šiuose taškuose vienas pradmenų rinkinys atpažįsta DNR su citozinais, kad padidintų metilintos DNR kopijų skaičių, o vienas rinkinys atpažįsta DNR su uracilu arba timinu, kad amplifikuotų nemetilintą DNR. MSP naudojant qPCR taip pat galima atlikti norint gauti kiekybinę, o ne kokybinę informaciją apie metilinimą.
Mini gruntas – PGR: Naudojamos termostabilios polimerazės (S-Tbr), kurios gali tęstis iš trumpų pradmenų ("smalligos"), turinčių 9 arba 10 nukleotidų skaičių. Šis metodas leidžia PGR nukreipti į regionus, susijusius su mažesniais pradmenimis, ir yra naudojamas konservuotų DNR sekų, tokių kaip 16S (arba eukariotinis 18S) rRNR genas, amplifikavimui.
Daugkartinio ligavimo priklausomas zondo amplifikacija (MLPA): leidžia amplifikuoti kelis taikinius tik su viena pradmenų pora, taip išvengiant multipleksinės PGR skiriamosios gebos apribojimų.
Daugkartinis PGR susideda iš kelių pradmenų rinkinių viename PGR mišinyje, siekiant gauti skirtingo dydžio amplikonus, būdingus skirtingoms DNR sekoms. Vienu metu sutelkus dėmesį į kelis genus, vieno tyrimo metu galima gauti papildomos informacijos, kuriai atlikti kitu atveju prireiktų kelis kartus daugiau reagentų ir daugiau laiko. Kiekvieno pradmenų rinkinio atkaitinimo temperatūra turi būti optimizuota, kad tinkamai veiktų per vieną reakciją ir su amplikonų dydžiais. Tai reiškia, kad jų bazinės poros ilgis turi būti pakankamai skirtingas, kad vizualizuojant gelio elektroforezės būdu susidarytų atskiros juostos.
Įdėtas PGR: padidina DNR amplifikacijos specifiškumą, sumažindamas foną dėl nespecifinės DNR amplifikacijos. Du pradmenų rinkiniai naudojami dviejuose iš eilės PGR. Pirmoje reakcijoje DNR produktams sintetinti naudojama viena pradmenų pora, kuri, be numatytos paskirties, dar gali susidėti iš nespecifiškai amplifikuotų DNR fragmentų. Tada produktai naudojami antrajame PGR su pradmenų rinkiniu, kurio surišimo vietos visiškai arba iš dalies skiriasi nuo kiekvieno pirmojoje reakcijoje naudoto pradmenų 3' galų. Įdėta PGR dažnai sėkmingiau specifiškai amplifikuoja ilgus DNR fragmentus nei tradicinis PGR, tačiau tam reikia išsamesnių žinių apie tikslines sekas.
PGR su persidengiančiais plėtiniais arba sujungimas su persidengiančiais plėtiniais(SOE): genų inžinerijos metodas, naudojamas sujungti dvi ar daugiau DNR dalių, kuriose yra viena kitą papildančių sekų. Naudojamas sujungti DNR dalis, kuriose yra genų, reguliuojančių sekas ar mutacijas; technika leidžia sukurti specifines ir ilgas DNR konstrukcijas.
Kiekybinė PGR (QPCR): naudojamas PGR produkto kiekiui matuoti (dažniausiai realiu laiku). Kiekybiškai nustato pradinį DNR, cDNR arba RNR kiekį. qPCR plačiai naudojamas DNR sekos buvimui mėginyje ir jos kopijos numeriui mėginyje nustatyti. Realaus laiko kiekybinė PGR turi labai aukštą tikslumo laipsnį. QRT-PGR (arba QF-PGR) metodai naudoja fluorescencinius dažus, tokius kaip Sybr Green, EvaGreen, arba fluoroforų turinčius DNR zondus, tokius kaip TaqMan, kad išmatuotų amplifikuoto produkto kiekį realiuoju laiku. Kartais vadinamas RT-PCR (realaus laiko PGR) arba RQ-PGR. QRT-PCR arba RTQ-PCR yra tinkamesnės santrumpos, nes RT-PGR paprastai reiškia atvirkštinės transkripcijos PGR, dažnai naudojamą kartu su qPCR.
Atvirkštinės transkripcijos PGR (RT-PGR): padidinti DNR kopijų skaičių iš RNR. Atvirkštinė transkriptazė transkribuoja RNR į cDNR, kuri vėliau amplifikuojama PGR. RT-PCR plačiai naudojamas ekspresijos profiliavimui, siekiant aptikti genų ekspresiją arba nustatyti RNR transkripto seką, įskaitant transkripcijos pradžios ir pabaigos vietas. Jei geno genominė DNR seka yra žinoma, RT-PGR gali būti naudojama geno egzonų ir intronų vietai nustatyti. Geno 5' galas (atitinkantis transkripcijos pradžios vietą) paprastai nustatomas RACE-PCR (greitas cDNR galų amplifikavimas).
kietosios fazės PGR: apima keletą reikšmių, įskaitant „Polonia Amplification“ (kai PGR kolonijos sudaromos, pavyzdžiui, ant gelio matricos), „Bridge PCR“ (pradmenys kovalentiškai surišti su kietu atraminiu paviršiumi), tradicinę kietosios fazės PGR (kur „asimetrinė PGR“ " naudojamas, kai yra pradmenys, turintys kietą pagrindą, kurio seka atitinka vieną iš vandeninių pradmenų), ir sustiprintą kietosios fazės PGR (kai įprastinė kietosios fazės PGR gali būti pagerinta naudojant didelio Tm ir įdėtus kietojo pagrindo pradmenis su galimybė taikyti terminį „pakopą“, kad būtų skatinamas gruntų susidarymas su tvirta atrama).
Terminis asimetrinis interleaved PGR (TAIL-PCR): naudojamas atskirti nežinomą seką po žinomos sekos. Žinoma seka TAIL-PGR naudoja įdėtą pradmenų porą su skirtinga atkaitinimo temperatūra; pradmuo degenerate naudojamas amplifikuoti kita kryptimi nei nežinoma seka.
Touchdown PGR (pakopinis PGR): PGR variantas, skirtas sumažinti nespecifinį foną palaipsniui mažinant atkaitinimo temperatūrą, kai PGR ciklai progresuoja. Atkaitinimo temperatūra pradiniuose cikluose paprastai yra keliais laipsniais (3–5 °C) aukštesnė už naudojamų gruntų Tm, o vėlesniuose ciklo metu temperatūra yra keliais laipsniais (3–5 °C) žemesnė už naudojamų gruntų Tm. gruntai. Aukštesnė temperatūra suteikia daugiau specifiškumo grunto surišimui ir dar daugiau žemos temperatūros skatinti efektyvesnį stiprinimą iš specifinių produktų, susidarančių per pradinius ciklus.
PAN-AC: amplifikacijai naudojamos izoterminės sąlygos ir gali būti taikomos gyvoms ląstelėms.
Universalus greitas pasivaikščiojimas per genomą: genomo vaikščiojimui ir genetiniam pirštų atspaudų ėmimui naudojant specifiškesnį „dvipusį“ PGR nei tradicinį „vienpusį“ metodą (naudojant tik vieną specifinį genų pradmenį ir vieną bendrą pradmenį, dėl kurio mechanizmas gali sukelti dirbtinį „triukšmą“). , įskaitant laso struktūros formavimąsi. Supaprastinti UFW dariniai yra "Lane RAGE" (lasso įdėtas PGR greitam genomo DNR galų amplifikavimui), "5" RACE Lane" ir "3" RACE Lane.
ĮsilicioPGR(skaitmeninis PGR, virtualus PGR, e-PGR, e-PGR) reiškia skaičiavimo priemones, naudojamas apskaičiuoti teorinės polimerazės grandininės reakcijos rezultatus, naudojant tam tikrą pradmenų (zondų) rinkinį, siekiant amplifikuoti DNR sekas iš sekvenuoto genomo arba transkripto.

PGR istorija

1971 m. žurnale „Journal of Molecular Biology“ paskelbtame straipsnyje Kleppe ir jo bendraautoriai pirmą kartą aprašė metodą, naudojant fermentinę analizę, skirtą trumpam DNR šablonui atkartoti pradmenimis mėgintuvėlio sąlygomis. Tačiau šis ankstyvas pagrindinio PGR principo pasireiškimas nesulaukė daug dėmesio, o polimerazės grandininės reakcijos išradimas 1983 m. paprastai priskiriamas Kary Mullis.

Kai Mullis sukūrė PGR 1983 m., jis dirbo Emeryville mieste, Kalifornijoje, Cetus Corporation, ankstyvoje biotechnologijų įmonėje. Ten jis buvo atsakingas už trumpų DNR grandinių sintezę. Mullisas rašė, kad PGR jis pastojo vieną naktį savo automobilyje važiuodamas Ramiojo vandenyno pakrantės greitkeliu. Jis galvojo apie naują DNR pokyčių (mutacijų) analizės būdą, kai suprato, kad vietoj to išrado metodą, kaip padidinti bet kurios DNR dalies kopijų skaičių per pasikartojančius DNR polimerazės sukeltus dubliavimo ciklus. Leidinyje Scientific American Mullis apibendrino procedūrą: „Pradedant nuo vienos DNR genetinės medžiagos molekulės, PGR gali sukurti 100 milijardų tokių molekulių per vieną dieną. Šią reakciją lengva atlikti. Tam reikia ne daugiau kaip mėgintuvėlio, kelių paprastų reagentų ir šilumos šaltinio. 1993 m. už savo išradimą jam buvo įteikta Nobelio chemijos premija, o po septynerių metų jis ir jo kolegos iš Cetus pirmą kartą įgyvendino savo pasiūlymą. Tačiau išlieka tam tikrų ginčų dėl kitų mokslininkų intelektualinio ir praktinio indėlio į Mulliso darbą ir ar jis buvo vienintelis PGR principo išradėjas.

PGR metodas pagrįstas tinkamos DNR polimerazės, galinčios atlaikyti aukštą > 90 °C (194 °F) temperatūrą, reikalingą dviem DNR grandinėms DNR dviguboje spiralėje po kiekvieno replikacijos ciklo suskaidyti, naudojimu. DNR polimerazės, iš pradžių naudotos in vitro eksperimentams, kuriuos numatė PGR, neatlaikė tokios aukštos temperatūros. Todėl ankstyvos DNR replikacijos procedūros buvo labai neveiksmingos ir atimančios daug laiko, todėl reikėjo daug DNR polimerazės ir nuolatinio apdorojimo viso proceso metu.

1976 m. buvo atrasta Taq polimerazė, DNR polimerazė, išskirta iš termofilinės bakterijos, Termusasaquaticus, kuris natūraliai gyvena karštoje (nuo 50 iki 80 °C (122–176 °F)) aplinkoje, pavyzdžiui, karštosiose versmėse, atvėrė kelią dramatiškam PGR metodo patobulinimui. DNR polimerazė išskirta iš T.Aquaticus, yra stabilus aukštoje temperatūroje ir išlieka aktyvus net po DNR denatūracijos, todėl po kiekvieno ciklo nereikia pridėti naujų DNR polimerazių. Tai leido automatizuoti DNR amplifikacijos procesą, pagrįstą terminiu cikleriu.

Patentų karai

Siūlomas PGR metodas buvo patentuotas Carey Mullis ir yra priskirtas korporacijai Cetus, kurioje Mullis dirbo, kai išrado šią techniką 1983 m. Taq polimerazės fermentas taip pat buvo apsaugotas patentais. Buvo keli didelio atgarsio sulaukę ieškiniai, susiję su metodika, įskaitant nesėkmingą „DuPont“ ieškinį. farmacijos kompanija Hoffmann-La Roche įgijo teises į patentus 1992 m. ir šiuo metu turi tuos, kurie vis dar saugomi.

Panaši kova dėl Taq polimerazės fermento patentų vis dar vyksta kai kuriose jurisdikcijose visame pasaulyje tarp Roche ir Promega. Teisiniai argumentai viršijo pradinių PGR ir Taq polimerazės patentų, kurie pasibaigė 2005 m. kovo 28 d., sąlygas.

Tačiau tuo metu ši idėja liko nepriimta. Polimerazės grandininę reakciją 1983 metais iš naujo atrado Kary Mullis. Jo tikslas buvo sukurti metodą, kuris leistų amplifikuoti DNR per daug kartų iš eilės pradinės DNR molekulės dubliavimą naudojant DNR polimerazės fermentą. Praėjus 7 metams nuo šios idėjos paskelbimo, 1993 m., Mullis už tai gavo Nobelio premiją.

Metodo naudojimo pradžioje, po kiekvieno šildymo-aušinimo ciklo, į reakcijos mišinį reikėjo pridėti DNR polimerazės, nes ji greitai buvo inaktyvuota aukštoje temperatūroje, reikalinga atskirti DNR spiralės grandines. Procedūra buvo labai neefektyvi, pareikalavo daug laiko ir fermentų. 1986 metais jis buvo gerokai patobulintas. Buvo pasiūlyta naudoti termofilinių bakterijų DNR polimerazes. Šie fermentai pasirodė esantys termostabilūs ir gali atlaikyti daugybę reakcijos ciklų. Jų naudojimas leido supaprastinti ir automatizuoti PGR. Viena pirmųjų termostabilių DNR polimerazių buvo išskirta iš bakterijų Thermus aquaticus ir pavadintas Taq- polimerazė. Šios polimerazės trūkumas yra tai, kad klaidingo nukleotido įvedimo tikimybė yra gana didelė, nes šis fermentas neturi klaidų taisymo mechanizmų (3" → 5" egzonukleazės aktyvumas). Polimerazės pfu ir Pwo, išskirtos iš archajų, turi tokį mechanizmą, jų naudojimas žymiai sumažina DNR mutacijų skaičių, tačiau jų darbo greitis (procesiškumas) yra mažesnis nei Taq. Šiuo metu naudojami mišiniai Taq ir pfu pasiekti didelį polimerizacijos greitį ir didelį kopijavimo tikslumą.

Metodo išradimo metu Mullis dirbo įmonėje Cetus (lt: Cetus Corporation), kuri patentavo PGR metodą. 1992 m. Cetus pardavė metodo teises ir naudojimo patentą Taq- polimerazės kompanija Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) už 300 milijonų dolerių. Tačiau paaiškėjo, kad Taq-polimerazę 1980 metais charakterizavo rusų biochemikas Aleksejus Kaledinas, dėl kurio bendrovė Promega (Promega) teisme bandė priversti Roche atsisakyti išskirtinių teisių į šį fermentą. Amerikietiškas PGR metodo patentas pasibaigė 2005 m. kovo mėn.

PGR atlikimas

Metodas pagrįstas daugkartiniu selektyviu tam tikros DNR srities kopijavimu fermentų pagalba dirbtinėmis sąlygomis ( in vitro). Tokiu atveju nukopijuojama tik tas sritis, kuri atitinka nurodytas sąlygas, ir tik tuo atveju, jei ji yra tiriamoje imtyje. Priešingai nei DNR amplifikacija gyvuose organizmuose (replikacija), palyginti trumpos DNR dalys amplifikuojamos naudojant PGR. Įprastiniame PGR procese replikuotų DNR sričių ilgis yra ne didesnis kaip 3000 bazinių porų (3 kbp). Įvairių polimerazių mišinio pagalba, naudojant priedus ir tam tikromis sąlygomis PGR fragmento ilgis gali siekti 20-40 tūkstančių bazinių porų. Tai vis dar yra daug mažiau nei eukariotinės ląstelės chromosominės DNR ilgis. Pavyzdžiui, žmogaus genomas yra maždaug 3 milijardų bazinių porų ilgio.

Reakcijos komponentai

Paprasčiausiu atveju PGR reikalingi šie komponentai:

DNR šablonas, kuriame yra DNR dalis, kurią reikia amplifikuoti.
Du gruntai, papildantis priešingus norimos DNR fragmento skirtingų grandžių galus.
termostabilūs DNR polimerazė yra fermentas, katalizuojantis DNR polimerizaciją. PGR naudojama polimerazė turi išlikti aktyvi aukštoje temperatūroje ilgą laiką, todėl naudojami iš termofilų išskirti fermentai - Thermus aquaticus(Taq polimerazė), Pyrococcus furiosus(Pfu polimerazė), Pyrococcus woesei(Pwo-polimerazė) ir kt.
Deoksinukleozidų trifosfatai(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Mg 2+ jonai, reikalingi polimerazei veikti.
buferinis tirpalas, užtikrinant reikiamas reakcijos sąlygas – pH, tirpalo joninę stiprumą. Sudėtyje yra druskų, galvijų serumo albumino.

Kad reakcijos mišinys neišgaruotų, į mėgintuvėlį įpilama aukštai verdančio aliejaus, pavyzdžiui, vazelino. Jei naudojamas šildomas dangtelis, to nereikia.

Gruntai

Po šablono hibridizacijos su pradmeniu (atkaitinimas), pastarasis naudojamas kaip pradmuo DNR polimerazei sintezuojant šablono komplementarią grandinę (žr.).

Svarbiausia pradmenų charakteristika yra pradmenų ir matricų komplekso lydymosi temperatūra (Tm). T m yra temperatūra, kurioje pusė šabloninės DNR sudaro kompleksą su oligonukleotido pradmeniu. Lydymosi temperatūrą galima apytiksliai nustatyti pagal formulę , kur n X yra X nukleotidų skaičius pradmenyje. Jei pradmens ilgis ir nukleotidų sudėtis arba atkaitinimo temperatūra parinkta neteisingai, gali susidaryti iš dalies papildantys kompleksai su kitomis DNR šablono sritimis, dėl kurių gali atsirasti nespecifinių produktų. Viršutinę lydymosi temperatūros ribą riboja optimali polimerazės veikimo temperatūra, kurios aktyvumas krenta aukštesnėje nei 80 °C temperatūroje.

Renkantis gruntus, pageidautina laikytis šių kriterijų:

stiprintuvas

Ryžiai. vienas: PGR cikleris

Reakcijos eiga

Gelio, kuriame yra žymeklio DNR (1) ir PGR reakcijos produktų (2, 3), nuotrauka. Skaičiai rodo DNR fragmentų ilgį nukleotidų poromis.

Paprastai, atliekant PGR, atliekami 20-35 ciklai, kurių kiekvienas susideda iš trijų etapų (2 pav.).

Denatūravimas

Dvigubos grandinės DNR šablonas kaitinamas iki 94-96°C (arba 98°C, jei naudojama ypač termostabili polimerazė) 0,5-2 minutes, kad DNR grandinės galėtų atsiskirti. Šis etapas vadinamas denatūravimas nes vandeniliniai ryšiai tarp dviejų DNR grandžių nutrūksta. Kartais prieš pirmąjį ciklą (prieš pridedant polimerazę) reakcijos mišinys pašildomas 2–5 min. visiškai denatūruoti šabloną ir pradmenis. Toks požiūris vadinamas karšta pradžia, tai leidžia sumažinti nespecifinių reakcijos produktų kiekį.

Atkaitinimas

Pailgėjimas

PGR veislės

"Nested" PCR (Nested PCR (eng.)) - naudojamas siekiant sumažinti šalutinių reakcijos produktų skaičių. Naudokite dvi poras pradmenų ir atlikite dvi reakcijas iš eilės. Antroji pradmenų pora amplifikuoja DNR sritį pirmosios reakcijos produkte.
"Inverted" PGR (atvirkštinis PCR (angl.)) - naudojamas, jei norimoje sekoje žinomas tik nedidelis plotas. Šis metodas ypač naudingas, kai reikia nustatyti gretimas sekas po DNR įterpimo į genomą. Norint įgyvendinti apverstą PGR, atliekama eilė DNR pjūvių su restrikcijos fermentais, po to sujungiami fragmentai (ligavimas). Dėl to žinomi fragmentai yra abiejuose nežinomo regiono galuose, po kurių PGR gali būti atlikta kaip įprasta.
Atvirkštinės transkripcijos PGR (RT-PGR) naudojama žinomai sekai iš RNR bibliotekos amplifikuoti, išskirti arba identifikuoti. Prieš atliekant įprastą PGR, iRNR šablone, naudojant reversetazę, susintetinama viengrandė DNR molekulė ir gaunama viengrandė cDNR, kuri naudojama kaip PGR šablonas. Šis metodas dažnai nustato, kur ir kada šie genai yra išreikšti.
asimetrinė PGR. Asimetrinė PGR) – atliekama, kai reikia amplifikuoti daugiausia vieną iš pradinės DNR grandinių. Naudojamas kai kuriuose sekos nustatymo ir hibridizacijos analizės metoduose. PGR atliekama kaip įprasta, išskyrus tai, kad vienas iš pradmenų imamas dideliu pertekliumi.
Kiekybinė PGR (Q-PGR) naudojama norint greitai išmatuoti specifinės DNR, cDNR arba RNR kiekį mėginyje.
Kiekybinė realaus laiko PGR – šis metodas naudoja fluorescenciniu būdu pažymėtus reagentus, kad tiksliai išmatuotų reakcijos produkto kiekį, kai jis kaupiasi.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR(English) ) - naudojant šį metodą, sumažinama nespecifinio pradmenų surišimo įtaka produkto susidarymui. Pirmieji ciklai atliekami esant aukštesnei nei atkaitinimo temperatūrai, po to kas kelis ciklus temperatūra mažinama. Tam tikroje temperatūroje sistema praeis per optimalaus pradmenų specifiškumo juostą DNR.
Molekulinės kolonijos metodas (PGR gelyje) Polonijos-PCR kolonija) - akrilamido gelis polimerizuojamas su visais PGR komponentais ant paviršiaus ir atliekama PGR. Taškuose, kuriuose yra analizuojama DNR, amplifikacija vyksta formuojant molekulines kolonijas.
PGR su greitu cDNR galų amplifikavimu Greitas cDNR galų amplifikavimas, RACE-PGR )
Ilgų fragmentų PGR Ilgo nuotolio PGR) - PGR modifikavimas išplėstų DNR segmentų amplifikacijai (10 tūkst. bazių ir daugiau). Naudojamos dvi polimerazės, viena iš kurių yra Taq polimerazė, turinti didelį procesyvumą (tai yra, vienu žingsniu galinti susintetinti ilgą DNR grandinę), o antroji – DNR polimerazė, turinti 3'-5' endonukleazės aktyvumą. Antroji polimerazė reikalinga norint ištaisyti pirmosios įvestas klaidas.
RAPD-PCR Atsitiktinis polimorfinės DNR PGR amplifikavimas , PGR su atsitiktine polimorfinės DNR amplifikacija – naudojama, kai reikia atskirti organizmus, kurie yra artimi genetine seka, pavyzdžiui, skirtingų veislių auginamų augalų, šunų veislių ar artimai giminingų mikroorganizmų. Šiam metodui dažniausiai naudojamas vienas mažas gruntas (20-25 bp). Šis pradmuo iš dalies papildys atsitiktines tiriamų organizmų DNR sritis. Pasirinkus sąlygas (pradžio ilgis, pradmenų sudėtis, temperatūra ir kt.), galima pasiekti patenkinamą dviejų organizmų PGR modelio skirtumą.

PGR taikymas

PGR naudojamas daugelyje sričių analizei ir moksliniams eksperimentams.

Kriminalistika

PGR naudojama vadinamiesiems „genetiniams pirštų atspaudams“ palyginti. Reikalingas genetinės medžiagos mėginys iš nusikaltimo vietos – kraujo, seilių, spermos, plaukų ir kt. Jis lyginamas su įtariamojo genetine medžiaga. Užtenka labai mažo DNR kiekio, teoriškai – vienos kopijos. DNR supjaustoma į fragmentus, tada amplifikuojama PGR. Fragmentai atskiriami naudojant DNR elektroforezę. Gautas DNR juostų išsidėstymo vaizdas vadinamas genetinis pirštų atspaudas(Anglų) genetinis pirštų atspaudas).

Tėvystės nustatymas

Medicininė diagnostika

Individualizuota medicina

Yra žinoma, kad dauguma vaistų veikia ne visus pacientus, kuriems jie skirti, o tik 30–70 proc. Be to, kai kuriems pacientams daugelis vaistų yra toksiški arba sukelia alergiją. To priežastys iš dalies yra individualūs vaistų ir jų darinių jautrumo ir metabolizmo skirtumai. Šie skirtumai nustatomi genetiniame lygmenyje. Pavyzdžiui, vienam ligoniui tam tikras citochromas (kepenų baltymas, atsakingas už pašalinių medžiagų apykaitą) gali būti aktyvesnis, pas kitą – mažiau. Norint nustatyti, kokio tipo citochromą turi konkretus pacientas, prieš vartojant vaistą, siūloma atlikti PGR analizę. Ši analizė vadinama preliminariu genotipo nustatymu. numatomas genotipų nustatymas).

Genų klonavimas

Ryžiai. keturi: Genų klonavimas naudojant plazmidę. .
(1) A organizmo chromosominė DNR. (2) PGR. (3) Kelios organizmo A geno kopijos. (4) Geno įterpimas į plazmidę. (5) Plazmidė su organizmo A genu. (6) Plazmidės įvedimas į organizmą B. (7) Organizmo A geno kopijos skaičiaus dauginimas organizme B.

DNR sekos nustatymas

Atliekant sekos nustatymo metodą, pažymėtą fluorescencine žyme arba radioaktyviuoju dideoksinukleotidų izotopu, PGR yra neatsiejama dalis, nes būtent polimerizacijos metu į DNR grandinę įterpiami fluorescencine arba radioaktyvia žyme pažymėti nukleotidų dariniai. Tai sustabdo reakciją, leidžiančią nustatyti konkrečių nukleotidų padėtis po sintezuotų sruogų atskyrimo gelyje.

Mutagenezė

Šiuo metu PGR tapo pagrindiniu mutagenezės metodu. PGR naudojimas leido supaprastinti ir pagreitinti mutagenezės procedūrą, taip pat padaryti ją patikimesnę ir atkuriamą.

Dažnai naudojamas kaip greitas virusų nustatymo ir identifikavimo metodas.

Pirmą kartą šį metodą sukūrė C. Mullis (JAV) 1983 m., dėl didelio jautrumo, specifiškumo ir įgyvendinimo paprastumo jis plačiai naudojamas genetikoje, teismo medicinoje, diagnostikoje ir kitose srityse.

Metodo esmė – amplifikacija, t.y., griežtai apibrėžtų DNR molekulės fragmentų kopijų skaičiaus padidėjimas in vitro. Šiuo metodu veikia matricinis mechanizmas ir papildomumo principas. Dvi pavienės polinukleotidinės grandinės (nukleorūgštys) gali susijungti vandeniliniu ryšiu į vieną dvigrandę grandinę, jei vienos nukleotidų sekos tiksliai sutampa su kitos, todėl jų azotinės bazės gali sudaryti adenino-timino ir guanino-citozino poras.

PGR pagrįsta DNR amplifikacija naudojant termostabilią DNR polimerazę, kuri sintezuoja vienas kitą papildančias DNR grandines, pradedant dviem pradmenimis. Pradmenys yra DNR dalis, susidedanti iš 20-30 nukleotidų. Šie pradmenys (pradmenys) papildo priešingas DNR grandines. DNR sintezės metu pradmenys įterpiami į naujai susintetintų DNR molekulių grandinę.

Paprastai PGR nustatoma 25-40 ciklų. Kiekvieną ciklą sudaro trys etapai: pirmasis yra denatūravimas 92–95 °C temperatūroje. Šiuo atveju dvi DNR grandinės skiriasi; antrasis - atkaitinimas arba pradmenų pridėjimas 50-65 ° C temperatūroje; trečiasis yra pailgėjimas arba polimerizacija 68–72 ° C temperatūroje, o DNR polimerazė atlieka papildomą DNR šablonų grandinių užbaigimą, naudodama keturių tipų nukleotidus. Vieno ciklo metu norima genetinė medžiaga padvigubėja. Pirmajame cikle susidariusios DNR grandinės tarnauja kaip antrojo ciklo šablonai ir tt Po pirmojo ciklo amplifikuojamas tik fragmentas tarp dviejų pradmenų. Taigi amplifikuotos srities kopijų skaičius padvigubėja, o tai leidžia susintetinti milijonus (2 n) DNR fragmentų per 25–40 ciklų – tiek, kad būtų galima juos įvairiais metodais (hibridizacijos zondų, kuriuose yra tam tikra etiketė, elektroforezė ir pan.). Dažniau tam naudojama agarozės gelio elektroforezė su etidžio bromido dažymu.

Atliekant PGR, pradmenys naudojami iš patogeno DNR sekcijų, turinčių unikalią nukleotidų seką, būdingą tik konkrečiam patogenui.

PGR nustatymo metodas yra toks: iš tiriamosios medžiagos išskiriamas DNR šablonas; išskirta DNR sujungiama mėgintuvėlyje su amplifikaciniu mišiniu, kuriame yra DNR polimerazės, visų 4 tipų nukleotidų, 2 tipų pradmenų, MgCl, buferio, dejonizuoto vandens ir mineralinės alyvos. Tada vamzdeliai dedami į ciklerį, o amplifikacija atliekama automatiniu režimu pagal tam tikrą programą, atitinkančią patogeno tipą. Rezultatai dažniau registruojami elektroforezės būdu 1-2 % agarozės gelyje, esant etidžio bromidui, kuris susijungia su DNR fragmentais ir aptinkamas kaip šviečiančios juostos, kai gelis apšvitinamas UV spinduliais ant transiliuminatoriaus. Visos PGR procedūros trunka 1-2 darbo dienas.

Siekiant padidinti PGR specifiškumą ir jautrumą, įvairių variantų: įdėtas PGR; PGR su „karštu paleidimu“ naudojant parafino sluoksnį arba aktyviųjų polimerazės vietų blokavimą monokloniniais antikūnais. Be to, kai kurios įmonės gamina liofilizuotus rinkinius DNR amplifikacijai, kurie gali pagreitinti PGR procesą ir sumažinti klaidingų teigiamų rezultatų tikimybę.

Šiuo metu įgyvendinama nauja technologija PGR-PGR realiuoju laiku (Real-Time PCR). Pagrindinis jo bruožas yra polimerazės grandininės reakcijos produktų kaupimosi stebėjimas ir kiekybinė analizė bei automatinis gautų rezultatų registravimas ir interpretavimas. Šis metodas nereikalauja elektroforezės pakopos, todėl sumažėja laboratoriniai PGR reikalavimai. Realaus laiko PGR naudoja fluorescenciniu būdu pažymėtus oligonukleotidinius zondus, kad aptiktų DNR amplifikacijos metu. Realaus laiko PGR leidžia atlikti visą mėginio analizę per 20-60 minučių ir teoriškai aptikti mėginyje net vieną DNR ar RNR molekulę.

Produkto aptikimo sistema realaus laiko polimerazės grandininėje reakcijoje (stebėjimo PGR) leidžia stebėti amplifikuotos DNR kaupimąsi ciklais po ciklo. Sistema apima oligonukleotidinį zondą, kuris gali prisijungti (hibridizuotis) prie vidinio tikslinės DNR segmento. 5' gale zondas yra paženklintas fluorescenciniais reporteriniais dažais, o 3' gale - blokatoriumi (gesinančiais dažais). Kai PGR produktas kaupiasi, zondas hibridizuojasi su juo, bet nevyksta švytėjimas dėl artumo tarp reporterio ir blokatoriaus. Nukopijavus seką, polimerazė pasiekia 5' zondo galą. Polimerazės 5'-3'-egzonukleazės aktyvumas atskiria fluorescencinę žymę nuo zondo 3' galo, taip atlaisvindamas fluorescencinį reporterį nuo prisijungimo prie signalo blokatoriaus, o tai padidina fluorescenciją. Taigi fluorescencijos lygis yra proporcingas konkretaus reakcijos produkto kiekiui. Svarbu, kad PGR rezultatai būtų fiksuojami fluorescencijos buvimu uždaruose mėgintuvėliuose ir tokiu būdu būtų išspręsta viena iš pagrindinių šio metodo problemų – amplikonų užterštumo problema.

PGR privalumai: greita analizė; didelis jautrumas ir specifiškumas; minimalus tiriamos medžiagos kiekis; įgyvendinimo paprastumas ir visiško automatizavimo galimybė.

Kadangi PGR gali būti toks pat jautrus, kaip ir vienos DNR šablono kopijos aptikimas, yra didelė klaidingai teigiamų rezultatų rizika. Todėl, nustatydama PGR, genetinės diagnostikos laboratorija turi nuolat atitikti specialius išdėstymo ir veikimo režimo reikalavimus.

PGR yra vienas iš papildomų virusologinės diagnostikos metodų. Ši reakcija labai svarbi diagnozuojant virusines infekcijas, kai viruso antigenų ar virusui specifinių antikūnų aptikti nepavyksta ir kai virusinės nukleino rūgšties buvimas gali būti vienintelis infekcijos požymis, ypač latentinės ir mišrios infekcijos atveju.

Jei radote klaidą, pažymėkite teksto dalį ir spustelėkite Ctrl + Enter.

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) ir jos taikymas. PGR analizė: kas tai? Kaip teisingai atlikti PGR testą Kas yra PGR reakcija

PGR atlikimas

Reakcijos komponentai

Gruntai

stiprintuvas

Reakcijos eiga

Denatūravimas

Atkaitinimas

Pailgėjimas

PGR veislės

PGR taikymas

Kriminalistika

Tėvystės nustatymas

Medicininė diagnostika

Individualizuota medicina

Genų klonavimas

DNR sekos nustatymas

Mutagenezė

Polimerazė grandininė reakcija(PGR)

PGR metodo esmė. DNR polimerazė

PGR atlikimas

PGR diagnostikos principai

Polimerazės grandininės reakcijos etapai

PGR taikymas

Pagrindinių polimerazės grandininės reakcijos metodų variantai

PGR istorija

PGR atlikimas

Reakcijos komponentai

Gruntai

stiprintuvas

Reakcijos eiga

Denatūravimas

Atkaitinimas

Pailgėjimas

PGR veislės

PGR taikymas

Kriminalistika

Tėvystės nustatymas

Medicininė diagnostika

Individualizuota medicina

Genų klonavimas

DNR sekos nustatymas

Mutagenezė

susiję straipsniai