Federalinė švietimo agentūra

valstybė švietimo įstaiga

Aukščiausias profesinį išsilavinimą

„Karelijos valstybinė pedagoginė akademija“

Kursinis darbas tema:

Polimerazė grandininė reakcija(PGR) ir jo taikymas

Baigė: studentė Koryagina Valeria Aleksandrovna

Patikrino: Karpikova Natalija Michailovna

Petrozavodskas 2013 m

Įvadas

1 skyrius Literatūros apžvalga

1.5.4 Plokštumos efektas

1.5.6 Stiprinimas

Išvada

Įvadas

Pastarieji dvidešimt metų buvo pažymėti plačiai paplitusiu molekulinių genetinių metodų diegimu biologijos, medicinos ir žemės ūkio moksluose.

Aštuntojo dešimtmečio pradžioje atrodė, kad molekulinė biologija pasiekė tam tikrą tobulumo laipsnį. Šiuo laikotarpiu mikroorganizmai buvo pagrindinis molekulinių genetinių tyrimų objektas. Perėjimas prie eukariotų tyrėjams iškėlė visiškai naujas problemas, kurių nepavyko išspręsti taikant tuo metu egzistavusius genetinės analizės metodus. Proveržis molekulinės genetikos raidoje tapo įmanomas atsiradus naujai eksperimentinei priemonei – restrikcijos endonukleazėms. Vėlesniais metais ėmė sparčiai daugėti tiesioginių DNR analizės metodų, pagrįstų kokybiškai skirtingais metodais.

Daugeliu atvejų šiuolaikinės technologijos leido pradėti giliau tirti įvairių organizmų branduolinio ir ekstrabranduolinio genomo smulkią struktūrinę ir funkcinę organizaciją. Tai buvo ypač svarbu kuriant naujus įvairių ligų diagnostikos ir gydymo metodus. Ne mažiau svarbi buvo galimybė panaudoti molekulinės genetikos pasiekimus populiacijų biologijoje ir selekcijoje populiacijų, veislių ir padermių genetiniam kintamumui nustatyti ir analizuoti, ekonomiškai vertingiems individams identifikuoti ir sertifikuoti, genetiškai modifikuotiems organizmams kurti, kitiems klausimams spręsti.

Kiekvienas metodas turi savo privalumų ir trūkumų. Nėra universalaus metodo, kuris galėtų išspręsti visas kylančias problemas. Todėl konkretaus metodo pasirinkimas vykdomam tyrimui yra vienas iš svarbiausių bet kokio mokslinio darbo etapų.

1 skyrius Literatūros apžvalga

1.1 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) atradimo istorija

1983 metais K.B. Mullis ir kt. paskelbė ir užpatentavo polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodą, kuriam buvo lemta turėti didelę įtaką visoms nukleorūgščių tyrimų ir taikymo sritims. Šio metodo reikšmė molekulinei biologijai ir genetikai pasirodė tokia didelė ir akivaizdi, kad po septynerių metų autorius buvo apdovanotas Nobelio chemijos premija.

Metodo naudojimo pradžioje, po kiekvieno šildymo-aušinimo ciklo, į reakcijos mišinį turėjo būti pridėta DNR polimerazės, nes ji buvo inaktyvuota aukštoje temperatūroje, reikalinga atskirti DNR spiralės grandines. Reakcijos procedūra buvo palyginti neefektyvi, reikalaujanti daug laiko ir fermentų. 1986 metais buvo žymiai patobulintas polimerazės grandininės reakcijos metodas. Buvo pasiūlyta naudoti termofilinių bakterijų DNR polimerazes. Šie fermentai pasirodė esantys termostabilūs ir gali atlaikyti daugybę reakcijos ciklų. Jų naudojimas leido supaprastinti ir automatizuoti PGR. Viena pirmųjų termostabilių DNR polimerazių buvo išskirta iš bakterijų Thermus aquaticusir pavadintas Taq- polimerazė.

Galimybė amplifikuoti bet kurį DNR segmentą, kurio nukleotidų seka yra žinoma, ir gauti jį po PGR homogenine forma ir preparatiniu kiekiu, daro PGR alternatyviu trumpų DNR fragmentų molekulinio klonavimo metodu. Šiuo atveju nereikia taikyti sudėtingų metodinių metodų, kurie naudojami genų inžinerijoje įprastinio klonavimo metu. PGR metodo sukūrimas labai išplėtė molekulinės genetikos, o ypač genų inžinerijos metodologines galimybes, tiek, kad radikaliai pakeitė ir sustiprino daugelio savo sričių mokslinį potencialą.

1.2 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) rūšys

· Įdėtas PGR- naudojamas šalutinių reakcijos produktų skaičiui sumažinti. Naudokite dvi poras pradmenų ir atlikite dvi reakcijas iš eilės. Antroji pradmenų pora amplifikuoja DNR sritį pirmosios reakcijos produkte.

· Apverstas PGR- naudojamas, kai žinomas tik nedidelis norimos sekos plotas. Šis metodas ypač naudingas, kai reikia nustatyti gretimas sekas po DNR įterpimo į genomą. Norint įgyvendinti apverstą PGR, restrikcijos fermentais atliekama DNR pjūvių serija<#"justify">polimerazės grandininės reakcijos pradmenys

· Konkrečios grupės PGR- PGR artimiesiems<#"center">1.3 Polimerazės grandininė reakcija

Devintojo dešimtmečio viduryje atrasta polimerazės grandininė reakcija (PGR) per kelias valandas gali milijonus kartų padidinti originalaus mėginio kopijų skaičių. Per kiekvieną reakcijos ciklą iš pradinės molekulės susidaro dvi kopijos. Kiekviena susintetinta DNR kopija gali būti kaip šablonas naujų DNR kopijų sintezei kitame cikle. Taigi pakartotinis ciklų kartojimas lemia eksponentiškai didėjantį kopijų skaičių. Iš skaičiavimų matyti, kad net jei yra 30 ciklų, originalios molekulės kopijų skaičius bus didesnis nei 1 mlrd. Net jei atsižvelgsime į tai, kad ne visi amplikonai yra dubliuojami per kiekvieną ciklą, bendras kopijų skaičius, nepaisant to, yra gana didelis skaičius.

Kiekvienas polimerazės grandininės reakcijos (PGR) ciklas susideda iš šių etapų:

· Denatūracija – temperatūrai padidėjus, dvigrandė DNR molekulė išsivynioja ir suskaidoma į dvi viengrandes;

· Atkaitinimas – temperatūros sumažinimas leidžia pradmenims prisijungti prie komplementarių DNR molekulės sričių;

· Pailgėjimas – fermentas DNR polimerazė užbaigia komplementarią grandinę.

Pasirinktam fragmentui amplifikuoti naudojami du oligonukleotidiniai pradmenys (sėklos), besiribojantys su tam tikra DNR sritimi. Gruntai orientuoti 3 - baigiasi vienas kito link ir seka, kurią reikia sustiprinti, kryptimi. DNR polimerazė atlieka vienas kitą papildančių DNR grandinių sintezę (užbaigimą), pradedant pradmenimis. DNR sintezės metu pradmenys fiziškai įterpiami į naujai susintetintų DNR molekulių grandinę. Kiekviena DNR molekulės grandinė, suformuota naudojant vieną iš pradmenų, gali būti kaip šablonas papildomos DNR grandinės sintezei naudojant kitą pradmenį.

1.4 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) vykdymas

Polimerazės grandininė reakcija atliekama specialiuose plonasieniuose polipropileno mėgintuvėliuose, kurių dydis suderinamas su naudojamu terminiu cikleriu (stiprintuvu) - prietaisu, kuris kontroliuoja polimerazės grandininės reakcijos (PGR) etapų temperatūrą ir laiko charakteristikas. .

1.5 Polimerazės grandininės reakcijos metodo principas

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra in vitro DNR amplifikacijos metodas, leidžiantis išskirti ir padauginti specifinę DNR seką milijardus kartų per kelias valandas. Galimybė gauti daugybę vieno griežtai apibrėžto genomo regiono kopijų labai supaprastina esamo DNR mėginio tyrimą.

Norint atlikti polimerazės grandininę reakciją, turi būti įvykdytos kelios sąlygos:

1.5.1 Kai kurių komponentų buvimas reakcijos mišinyje

Pagrindiniai reakcijos (PGR) mišinio komponentai yra: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, nukleotidų trifosfatų mišinys (ATP, GTP, CTP, TTP), pradmenys (oligonukleotidai), analizuotas DNR preparatas, termostabili DNR polimerazė. Kiekvienas reakcijos mišinio komponentas tiesiogiai dalyvauja polimerazės grandininėje reakcijoje (PGR), o reagentų koncentracija tiesiogiai veikia amplifikacijos eigą.

· Tris-HCl – nustato reakcijos mišinio pH, sukuria buferinę talpą. DNR polimerazės aktyvumas priklauso nuo terpės pH, todėl pH reikšmė tiesiogiai veikia polimerazės grandininės reakcijos eigą. Paprastai pH vertė yra 8–9,5 intervale. Aukštas pH yra dėl to, kad kylant temperatūrai Tril-HCl buferio pH krenta.

· KCl - kalio chlorido koncentracija iki 50 mm veikia denatūravimo ir atkaitinimo procesų eigą, didesnė nei 50 mm koncentracija slopina DNR polimerazę.

· MgCl 2- nes DNR polimerazė yra Mg 2+- priklausomas fermentas, tada magnio jonų koncentracija veikia fermento aktyvumą (Mg 2+sudaro kompleksus su NTP – būtent šie kompleksai yra polimerazės substratas). Didelė koncentracija padidina nespecifinę amplifikaciją, o maža - reakcijos slopinimą, optimalus (įvairioms polimerazėms) yra 0,5-5 mM. Be to, magnio druskų koncentracija turi įtakos denatūravimo ir atkaitinimo procesų eigai – padidėja Mg koncentracija. 2+sukelia DNR lydymosi temperatūros padidėjimą (t. y. temperatūrą, kuriai esant 50 % dvigrandžių DNR grandžių suskaidoma į viengrandes).

· NTP – nukleotidų trifosfatai yra tiesioginiai nukleorūgščių monomerai. Norint išvengti grandinės nutraukimo, rekomenduojamas vienodas visų keturių nukleotidų trifosfatų santykis. Maža šių komponentų koncentracija reakcijos mišinyje padidina komplementarios DNR grandinės konstravimo klaidų tikimybę.

· Gruntai – optimaliausias yra gruntų, kurių lydymosi temperatūros skirtumas ne didesnis kaip 2–4, naudojimas. o C. Kartais ilgai laikant 4 laipsnių temperatūroje o Su arba po daugelio užšaldymo – atšildymo, pradmenys sudaro antrines struktūras – dimerus, mažinančius PGR efektyvumą. Šios problemos pašalinimas sumažinamas iki inkubavimo vandens vonioje (T = 95 o C) 3 minutes ir po to greitai atvėsinama iki 0° NUO.

· DNR preparatai – DNR preparato (matricos) kiekis ir kokybė tiesiogiai veikia polimerazės grandininės reakcijos eigą ir parametrus. DNR mėginio perteklius slopina polimerazės grandininę reakciją (PGR). Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) efektyvumą gali sumažinti ir DNR preparate esančių įvairių medžiagų priemaišos: natrio acetatas, natrio chloridas, izopropanolis, etanolis, heparinas, fenolis, karbamidas, hemoglobinas ir kt.

· DNR polimerazė – naudojant nedidelį kiekį DNR polimerazės, pastebimas galutinio produkto sintezės sumažėjimas, tiesiogiai proporcingas fragmentų dydžiui. Polimerazės perteklius 2–4 kartus sukelia difuzinių spektrų atsiradimą, o 4–16 kartų – mažos molekulinės masės nespecifinius spektrus. Naudojamų koncentracijų diapazonas yra 0,5–1,5 aktyvumo vienetų 25 µl PGR mišinio.

Be pagrindinių PGR mišinio komponentų, naudojama nemažai papildomų medžiagų, gerinančių kokybinius ir kiekybinius PGR rodiklius: acetamidas (5%) – pagrindinių komponentų tirpumo padidėjimas; betainas (natrio druska) - DNR polimerazės stabilizavimas, DNR lydymosi temperatūros mažinimas, lydymosi temperatūros išlyginimas; galvijų albuminas (10-100 μg / ml) - DNR polimerazės stabilizavimas; dimetilsulfoksidas (1-10%) - didinant pagrindinių komponentų tirpumą; formamidas (2-10%) - atkaitinimo specifiškumo padidėjimas; glicerolis (15-20%) - fermento terminio stabilumo padidėjimas, DNR mėginio denatūravimo temperatūros sumažėjimas; amonio sulfatas – sumažina denatūravimo ir atkaitinimo temperatūrą.

1.5.2 Ciklas ir temperatūra

Bendra forma polimerazės grandininės reakcijos (PGR) programos yra šios:

etapas. Užsitęsusi pirminė DNR preparato denatūracija.1 ciklas

etapas. Greitas DNR preparato denatūravimas. Grunto atkaitinimas. Pailgėjimas.30 - 45 ciklai.

etapas. Ilgalaikis pailgėjimas. Reakcijos mišinio aušinimas 1 ciklas.

Kiekvienas stadijos elementas – denatūravimas, atkaitinimas, pailgėjimas – turi individualias temperatūros ir laiko charakteristikas. Kiekvieno elemento temperatūros ir tekėjimo laiko parametrai parenkami empiriškai, atsižvelgiant į stiprinimo produktų kokybinius ir kiekybinius rodiklius.

Denatūravimas. Šio polimerazės grandininės reakcijos elemento metu dvigrandė DNR molekulė suskaidoma į dvi viengrandes. Denatūravimo temperatūros parametrai yra 90–95 laipsnių diapazone o C, bet jei DNR mėginyje yra daug guanino ir citozino, temperatūrą reikia padidinti iki 98 o C. Denatūravimo temperatūra turi būti pakankama visiškai denatūruoti – suskaldyti DNR grandines ir išvengti „staigaus atšalimo“ ar greito atkaitinimo, tačiau termostabili DNR polimerazė yra mažiau stabili aukštoje temperatūroje. Taigi optimalių denatūravimo temperatūros parametrų parinkimas pradmenų ir mėginio santykiui (DNR paruošimui) yra svarbi amplifikacijos sąlyga. Jei denatūravimo temperatūra pirmajame etape viršija 95 o C, rekomenduojama į reakcijos mišinį po pirminės denatūracijos pridėti DNR polimerazės. Šio etapo elemento trukmė polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metu turėtų būti pakankama visiškam DNR denatūravimui, tačiau tuo pačiu metu neturėtų reikšmingai paveikti DNR polimerazės aktyvumo tam tikroje temperatūroje.

Atkaitinimas. Atkaitinimo temperatūra (T a ) yra vienas iš svarbiausių polimerazės grandininės reakcijos parametrų. Atkaitinimo temperatūra kiekvienam konkrečiam gruntui parenkama atskirai. Tai priklauso nuo pradmens ilgio ir nukleotidų sudėties. Paprastai jis yra mažesnis 2–4 o Nuo lydymosi temperatūros vertės (T m ) gruntas. Jei sistemos atkaitinimo temperatūra yra žemesnė už optimalią, tada nespecifinių amplifikuotų fragmentų skaičius didėja ir, atvirkščiai, aukštesnė temperatūra sumažina amplifikuotų produktų skaičių. Tokiu atveju specifinių amplikonų koncentracija gali smarkiai sumažėti iki polimerazės grandininės reakcijos (PGR) slopinimo. Padidėjus atkaitinimo laikui, taip pat padidėja nespecifinių amplikonų skaičius.

Pailgėjimas. Paprastai kiekvienas termostabilios DNR polimerazės tipas turi individualų aktyvumo temperatūros optimalumą. Fermento komplementarios DNR grandinės sintezės greitis taip pat yra kiekvienai polimerazei būdinga reikšmė (vidutiniškai 30–60 nukleotidų per sekundę arba 1–2 tūkst. bazių per minutę), todėl pailgėjimo laikas parenkamas priklausomai nuo. apie DNR polimerazės tipą ir amplifikuotos srities ilgį.

1.5.3 Pagrindiniai grunto parinkimo principai

Kuriant PGR testavimo sistemą, viena iš pagrindinių užduočių yra teisingas pradmenų pasirinkimas, kuris turi atitikti keletą kriterijų:

Gruntai turi būti konkretūs. Ypatingas dėmesys skiriamas 3 - pradmenų galai, nes būtent nuo jų Taq polimerazė pradeda užbaigti papildomą DNR grandinę. Jei jų specifiškumas yra nepakankamas, tikėtina, kad mėgintuvėlyje su reakcijos mišiniu įvyks nepageidaujami procesai, būtent nespecifinės DNR (trumpų ar ilgų fragmentų) sintezė. Jis matomas elektroforezės metu sunkių arba lengvų papildomų juostų pavidalu. Tai apsunkina reakcijos rezultatų įvertinimą, nes konkretų amplifikacijos produktą lengva supainioti su susintetinta svetima DNR. Dalis pradmenų ir dNTP sunaudojama nespecifinės DNR sintezei, todėl labai prarandamas jautrumas.

Gruntai neturi formuoti dimerų ir kilpų, t.y. nereikėtų formuoti stabilių dvigubų sruogų, atkaitinant gruntus prie savęs ar vienas su kitu.

1.5.4 Plokštumos efektas

Reikėtų pažymėti, kad specifinių stiprinimo produktų kaupimosi procesas eksponentiškai trunka tik ribotą laiką, o tada jo efektyvumas kritiškai krenta. Taip yra dėl vadinamojo „plato“ efekto.

termino efektas plokščiakalnis naudojamas apibūdinti PGR produktų kaupimosi procesą paskutiniuose amplifikacijos ciklus.

Priklausomai nuo sąlygų ir amplifikacijos reakcijos ciklų skaičiaus, tuo metu, kai pasiekiamas efektas plokščiakalnis substratų (dNTP ir pradmenų) panaudojimas, reagentų (dNTP ir fermentų) stabilumas, inhibitorių skaičius, įskaitant pirofosfatus ir DNR dupleksus, konkurencija dėl reagentų su nespecifiniais produktais arba pradmenimis-dimerais, konkretaus produkto koncentracija , ir nepilna denatūracija esant didelėms amplifikacijos produktų koncentracijoms.

Kuo mažesnė pradinė tikslinės DNR koncentracija, tuo didesnė reakcijos rizika plokščiakalnis". Šis taškas gali atsirasti anksčiau nei pakanka konkrečių amplifikacijos produktų skaičiaus analizei. Tik gerai optimizuotos bandymų sistemos gali to išvengti.

1.5.5 Biologinės medžiagos mėginių paruošimas

Priklausomai nuo užduočių, DNR išskyrimui naudojami skirtingi metodai. Jų esmė yra DNR išskyrimas (ekstrahavimas) iš biologinio produkto ir pašalinių priemaišų pašalinimas arba neutralizavimas, siekiant gauti PGR tinkamo grynumo DNR preparatą.

Marmur aprašytas gryno DNR preparato gavimo būdas laikomas standartiniu ir jau tapo klasikiniu. Tai apima fermentinę proteolizę, po kurios seka deproteinizacija ir DNR nusodinimas alkoholiu. Šis metodas leidžia gauti gryną DNR preparatą. Tačiau tai yra gana sudėtinga ir apima darbą su tokiomis agresyviomis ir aštriomis medžiagomis kaip fenolis ir chloroformas.

Vienas iš šiuo metu populiarių metodų yra DNR ekstrahavimo metodas, kurį pasiūlė Boom ir kt. Šis metodas pagrįstas stiprios chaotropinės medžiagos, guanidino tiocianato (GuSCN) naudojimu ląstelių lizei ir vėlesnei DNR sorbcijai ant nešiklio (stiklo karoliukų, diatomito, stiklinio pieno ir kt.). Po plovimo DNR lieka mėginyje, adsorbuotame ant nešiklio, iš kurio ją galima lengvai pašalinti naudojant eliuavimo buferį. Metodas patogus, technologiškai pažangus ir tinkamas mėginių paruošimui amplifikacijai. Tačiau DNR nuostoliai galimi dėl negrįžtamos sorbcijos ant nešiklio, taip pat daugelio plovimų metu. Tai ypač svarbu dirbant su nedideliu DNR kiekiu mėginyje. Be to, net nedideli GuSCN kiekiai gali slopinti PGR. Todėl naudojant šį metodą labai svarbu teisingai pasirinkti sorbentą ir atidžiai laikytis technologinių niuansų.

Kita mėginių paruošimo metodų grupė paremta Chilex tipo jonų mainų naudojimu, kurie, skirtingai nei stiklas, adsorbuoja ne DNR, o atvirkščiai – priemaišas, trukdančias reakcijai. Paprastai šią technologiją sudaro du etapai: mėginio virinimas ir priemaišų adsorbcija ant jonų keitiklio. Metodas itin patrauklus dėl jo vykdymo paprastumo. Daugeliu atvejų jis tinkamas darbui su klinikine medžiaga. Deja, kartais yra mėginių su priemaišomis, kurių negalima pašalinti naudojant jonų mainus. Be to, kai kurių mikroorganizmų negalima sunaikinti paprastu virimu. Tokiais atvejais būtina įvesti papildomus mėginių apdorojimo etapus.

Taigi mėginio paruošimo metodo pasirinkimas turėtų būti vertinamas atsižvelgiant į numatomų tyrimų tikslus.

1.5.6 Stiprinimas

Norint atlikti amplifikacijos reakciją, reikia paruošti reakcijos mišinį ir į jį įpilti analizuotą DNR mėginį. Šiuo atveju svarbu atsižvelgti į kai kurias grunto atkaitinimo ypatybes. Faktas yra tas, kad analizuojamame biologiniame mėginyje paprastai yra įvairių DNR molekulių, su kuriomis reakcijoje naudojami pradmenys turi dalinę, o kai kuriais atvejais reikšmingą homologiją. Be to, pradmenys gali susijungti vienas su kitu, kad susidarytų pradmenys-dimeriai. Abu jie sukelia daug pradmenų, skirtų šalutinių (nespecifinių) reakcijos produktų sintezei, ir dėl to žymiai sumažina sistemos jautrumą. Dėl to elektroforezės metu sunku arba neįmanoma nuskaityti reakcijos rezultatų.

1.6 Standartinio PGR reakcijos mišinio sudėtis

x PGR buferis (100 mM Tris-HCl tirpalas, pH 9,0, 500 mM KCl tirpalas, 25 mM MgCl2 tirpalas ) …….2,5 µl

Vanduo (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Nukleotidų trifosfatų (dNTP) mišinys

mM kiekvieno………………………………………….……….0,5 µl

Gruntas 1 (10 mM tirpalas) …………………………………………….….1 µl

Gruntas 2 (10 mM tirpalas) …………………………………………….….1 µl

DNR polimerazė (5 vienetai / µl) ……………………………………………… 0,2 µl

DNR mėginys (20 ng/µl) ……………………………………………..1 µl

1.7 Reakcijos rezultatų įvertinimas

Norint teisingai įvertinti PGR rezultatus, svarbu suprasti, kad šis metodas nėra kiekybinis. Teoriškai pavienių tikslinių DNR molekulių amplifikacijos produktus elektroforezės būdu galima aptikti jau po 30-35 ciklų. Tačiau praktikoje tai daroma tik tais atvejais, kai reakcija vyksta idealioms artimomis sąlygomis, su kuo nedažnai susiduriama gyvenime. Ypač didelę įtaką amplifikacijos efektyvumui turi DNR preparato grynumo laipsnis; tam tikrų inhibitorių buvimas reakcijos mišinyje, kurių kai kuriais atvejais gali būti labai sunku atsikratyti. Kartais dėl jų buvimo neįmanoma amplifikuoti net dešimčių tūkstančių tikslinių DNR molekulių. Taigi dažnai nėra tiesioginio ryšio tarp pradinio tikslinės DNR kiekio ir galutinio amplifikacijos produktų kiekio.

2 skyrius: Polimerazės grandininės reakcijos taikymas

PGR naudojamas daugelyje sričių analizei ir moksliniams eksperimentams.

Kriminalistika

PGR naudojama vadinamiesiems „genetiniams pirštų atspaudams“ palyginti. Mums reikia genetinės medžiagos mėginio iš nusikaltimo vietos – kraujo, seilių, spermos, plaukų ir kt. Jis lyginamas su įtariamojo genetine medžiaga. Užtenka labai mažo DNR kiekio, teoriškai – vienos kopijos. DNR supjaustoma į fragmentus, tada amplifikuojama PGR. Fragmentai atskiriami DNR elektroforezės būdu. Gautas DNR juostų vietos vaizdas vadinamas genetiniu pirštų atspaudu.

Tėvystės nustatymas

DNR fragmentų, amplifikuotų PGR, elektroforezės rezultatai. tėvas. Vaikas. Motina. Vaikas paveldėjo kai kurias abiejų tėvų genetinio atspaudo ypatybes, kurios suteikė naują, unikalų įspaudą.

Nors „genetiniai pirštų atspaudai“ yra unikalūs, šeimos ryšius vis tiek galima užmegzti padarius kelis tokius pirštų atspaudus. Tas pats metodas su nedideliais pakeitimais gali būti taikomas evoliuciniams ryšiams tarp organizmų nustatyti.

Medicininė diagnostika

PGR leidžia žymiai pagreitinti ir palengvinti paveldimų ir virusinės ligos. Dominantis genas amplifikuojamas PGR, naudojant tinkamus pradmenis, o tada sekvenuojamas, kad būtų nustatytos mutacijos. Virusinės infekcijos gali būti aptikti iškart po užsikrėtimo, savaitėmis ar mėnesiais iki ligos simptomų atsiradimo.

Personalizuota medicina

Kartais vaistai kai kuriems pacientams yra toksiški arba sukelia alergiją. To priežastys iš dalies yra individualūs vaistų ir jų darinių jautrumo ir metabolizmo skirtumai. Šie skirtumai nustatomi genetiniame lygmenyje. Pavyzdžiui, vienam ligoniui tam tikras citochromas gali būti aktyvesnis, kitam – mažiau. Norint nustatyti, kokio tipo citochromą turi konkretus pacientas, prieš vartojant vaistą, siūloma atlikti PGR analizę. Ši analizė vadinama preliminariu genotipo nustatymu.

Genų klonavimas

Genų klonavimas – tai genų išskyrimo ir dėl genų inžinerijos manipuliacijų didelio kiekio tam tikro geno produkto gavimo procesas. PGR naudojamas amplifikuoti geną, kuris vėliau įterpiamas į vektorių, DNR gabalėlį, pernešantį svetimą geną į tą patį organizmą arba į kitą organizmą, kurį lengva auginti. Kaip vektoriai, pavyzdžiui, naudojamos plazmidės arba virusinė DNR. Genų įterpimas į svetimą organizmą dažniausiai naudojamas šio geno produktui – RNR arba dažniausiai baltymui gauti. Tokiu būdu pramoniniais kiekiais gaunama daug baltymų, skirtų naudoti žemės ūkyje, medicinoje ir kt.

DNR sekos nustatymas

Atliekant sekos nustatymo metodą, paženklintą fluorescencine žyme arba radioaktyviuoju dideoksinukleotidų izotopu, PGR yra neatsiejama dalis, nes būtent polimerizacijos metu į DNR grandinę įterpiami fluorescencine arba radioaktyvia žyme pažymėti nukleotidų dariniai. Tai sustabdo reakciją, leidžiančią nustatyti konkrečių nukleotidų padėtis po sintezuotų sruogų atskyrimo gelyje.

Mutagenezė

Šiuo metu PGR tapo pagrindiniu mutagenezės metodu. PGR naudojimas leido supaprastinti ir pagreitinti mutagenezės procedūrą, taip pat padaryti ją patikimesnę ir atkuriamą.

PGR metodas leido išanalizuoti žmogaus papilomos viruso sekų buvimą žmogaus gimdos kaklelio navikų biopsijos skyriuose, įterptuose į parafiną likus 40 metų iki šio tyrimo. Be to, PGR pagalba buvo galima amplifikuoti ir klonuoti mitochondrijų DNR fragmentus iš 7 tūkstančių metų amžiaus žmogaus smegenų fosilinių liekanų!

Atskirų žmogaus spermatozoidų lizatuose buvo parodyta galimybė vienu metu analizuoti du lokusus, esančius skirtingose ​​nehomologinėse chromosomose. Šis metodas suteikia unikalią galimybę atlikti smulkią genetinę analizę ir tirti chromosomų rekombinaciją, DNR polimorfizmą ir kt. Atskirų spermatozoidų analizės metodas iškart buvo pritaikytas teismo medicinoje, nes haploidinių ląstelių HLA tipo nustatymas leidžia nustatyti tėvystę arba identifikuoti. nusikaltėlis (HLA kompleksas yra žmogaus pagrindinio histokompatibilumo komplekso genų rinkinys; HLA komplekso lokusai yra polimorfiškiausi iš visų žinomų aukštesniųjų stuburinių gyvūnų: rūšies viduje, kiekviename lokuse, yra neįprastai daug skirtingi aleliai – alternatyvios to paties geno formos).

Naudojant PGR, galima nustatyti svetimų genetinių struktūrų integracijos teisingumą iš anksto nustatytame tiriamų ląstelių genomo regione. Visa ląstelinė DNR yra sujungta su dviem oligonukleotidiniais pradmenimis, iš kurių vienas yra komplementarus šeimininko DNR vietai netoli įterpimo taško, o kitas - integruoto fragmento seka antilygiagrečioje DNR grandinėje. Polimerazės grandininė reakcija nepakitusios chromosomų DNR struktūros siūlomoje įterpimo vietoje sąlygoja neapibrėžto dydžio viengrandžių DNR fragmentų susidarymą, o planuojamo įterpimo atveju – žinomos dvigrandės DNR fragmentų susidarymą. dydis, nustatomas pagal atstumą tarp dviejų pradmenų atkaitinimo vietų. Be to, analizuojamo genomo regiono amplifikacijos laipsnis pirmuoju atveju priklausys tiesiškai nuo ciklų skaičiaus, o antruoju - eksponentiškai. Eksponentinis iš anksto nustatyto dydžio amplifikuoto fragmento kaupimasis PGR metu leidžia vizualiai jį stebėti po DNR preparato elektroforetinio frakcionavimo ir padaryti nedviprasmišką išvadą apie svetimos sekos įterpimą į tam tikrą chromosomų DNR sritį.

Išvada

Šiuo metu PGR metodas yra plačiausiai naudojamas kaip įvairių infekcinių ligų diagnostikos metodas. PGR leidžia nustatyti infekcijos etiologiją, net jei analizei paimtame mėginyje yra tik kelios patogeno DNR molekulės. PGR plačiai taikoma ankstyvai ŽIV infekcijų, virusinio hepatito ir kt. Iki šiol beveik nėra infekcinių ligų sukėlėjų, kurių nebūtų galima aptikti naudojant PGR.

Naudotos literatūros sąrašas

1.Padutov V.E., Baranovas O.Yu., Voropaev E.V. Molekulinės – genetinės analizės metodai. - Minskas: Unipolas, 2007. - 176 p.

2.PGR „realiu laiku“ / Rebrikovas D.V., Samatovas G.A., Trofimovas D.Yu. ir kt.; red. b. n. D.V. Rebrikovas; pratarmė L.A. Ostermanas ir akad. RAS ir RAAS E.D. Sverdlovas; 2 leidimas, red. ir papildomas - M.: BINOM. Žinių laboratorija, 2009. - 223 p.

.Patruševas L.I. Dirbtinės genetinės sistemos. - M.: Nauka, 2005. - Po 2 tonas

.B. Glick, J. Pasternak Molekulinė biotechnologija. Principai ir taikymas 589 psl., 2002 m

5.Shchelkunovas S.N. genetinė inžinerija. - Novosibirskas: Sib. univ. leidykla, 2004. - 496 p.

Redagavo A.A. Vorbjeva „Polimerazės grandininė reakcija ir jos taikymas diagnostikai dermatovenerologijoje“; Medicinos naujienų agentūra – 72 puslapiai

http://ru. wikipedia.org

http://mokslininkas. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - medicinos žurnalas

Mokymas

Reikia pagalbos mokantis temą?

Mūsų ekspertai patars arba teiks kuravimo paslaugas jus dominančiomis temomis.
Pateikite paraišką nurodydami temą dabar, kad sužinotumėte apie galimybę gauti konsultaciją.

SEI HPE „Krasnojarsko valstybinė medicinos akademija

pavadintas Yasenetsky federalinės sveikatos ir socialinės plėtros agentūros vardu »

IPO Medicininės genetikos ir klinikinės neurofiziologijos katedra

PAGRINDINIAI METODO PRINCIPAI

POLIMERAZĖS GRANDINĖ REAKCIJA

Metodinis vadovas 3-4 kursų studentams

bendrosios medicinos specialybėse (060101) ir

Krasnojarskas – 2007 m

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Pagrindiniai polimerazės grandininės reakcijos metodo principai. Bendrosios medicinos (060101) ir pediatrijos (060103) specialybių 3-4 kursų studentų popamokinio darbo metodinis vadovas. - Krasnojarskas: GOU VPO leidykla KrasGMA, 2007. - 42p.

Metodinis vadovas visiškai atitinka Valstybinio standarto (2000) reikalavimus ir atspindi pagrindinius aspektus modernus metodas diagnostika paveldimos ligosžmogus - polimerazės grandininės reakcijos metodas, mokomoji medžiaga pritaikyta edukacinėms technologijoms, atsižvelgiant į mokymo specifiką 3-4 medicinos ir pediatrijos fakultetų kursuose.

Recenzentai: Valstybinės aukštosios mokyklos Medicininės genetikos katedros vedėjas

„Federalinės sveikatos agentūros Novosibirsko valstybinis medicinos universitetas ir Socialinis vystymasis“, medicinos mokslų daktaras, profesorius;

DNR replikacija

Šio metodo tyrimo objektas yra dezoksiribonukleino rūgštis (DNR). DNR yra universalus genetinės informacijos nešėjas visuose Žemėje egzistuojančiuose organizmuose (išskyrus RNR turinčius mikroorganizmus). DNR yra dviguba grandinė, susukta į spiralę. Kiekviena grandinė susideda iš nuosekliai sujungtų nukleotidų. DNR grandinės turi priešingą kryptį: vienos grandinės 5' galas atitinka antrosios grandinės 3' galą. Unikali DNR savybė yra jos gebėjimas dubliuotis. Šis procesas vadinamas replikacija. DNR molekulės replikacija vyksta sintetiniu tarpfazės periodu. Kiekviena iš dviejų „motinos“ molekulės grandinių tarnauja kaip „dukters“ šablonas. Po replikacijos naujai susintetintoje DNR molekulėje yra viena „motiniška“ grandinė, o antroji – „dukra“, naujai susintetinta (pusiau konservatyvus metodas). Naujos DNR molekulės šablono sintezei būtina, kad senoji molekulė būtų despiralizuota ir ištempta. Replikacija prasideda keliose DNR molekulės vietose. DNR molekulės atkarpa nuo vienos replikacijos pradžios iki kitos pradžios vadinama replikonas.

Suaktyvinama replikacijos pradžia gruntai(sėklos), susidedančios iš 100-200 bazinių porų. DNR helikazės fermentas išsivynioja ir padalija pirminę DNR spiralę į dvi grandines, ant kurių pagal komplementarumo principą, dalyvaujant DNR polimerazės fermentui, surenkamos „dukterinės“ DNR grandinės. Kad fermentas pradėtų veikti, reikalingas pradinis blokas – nedidelis pradinis dvigrandė fragmentas. Pradinis blokas susidaro pradmeniui sąveikaujant su atitinkamos pirminės DNR grandinės komplementaria sritimi. Kiekviename replikone DNR polimerazė gali judėti palei "motininę" grandinę tik viena kryptimi (5`=>3`).

Pirmojoje sruogoje, replikonui išsivyniojus, palaipsniui nuolat auga „dukterinė“ sruogelė. Atsiliekančioje grandinėje dukterinė grandinė taip pat sintetina kryptimi (5`=>3`), bet atskirais fragmentais, kai replikonas išsivynioja.

Taigi „dukterinių“ gijų komplementarių nukleotidų prijungimas vyksta priešingomis kryptimis (antilygiagrečiai). Replikacija visuose replikonuose vyksta vienu metu. Skirtinguose replikonuose susintetinti „dukterinių“ gijų fragmentai ir dalys fermento ligazės surišamos į vieną grandinę. Replikacijai būdingas pusiau konservavimas, antiparaleliškumas ir nenuoseklumas. Visas ląstelės genomas replikuojamas vieną kartą per laikotarpį, atitinkantį vieną mitozinį ciklą. Replikacijos proceso rezultate iš vienos DNR molekulės susidaro dvi DNR molekulės, kurių viena grandinė yra iš pirminės DNR molekulės, o antroji – dukterinė – naujai susintetinama (1 pav.).

Ryžiai. vienas. DNR molekulės replikacijos diagrama.

Taigi, DNR replikacijos ciklas apima trys pagrindiniai etapai:

1. DNR spiralės išsivyniojimas ir sruogų divergencija (denatūracija);

2. gruntų tvirtinimas;

3. vaiko gijos grandinės užbaigimas.

PGR metodo principas

Būtent DNR replikacija sudarė PGR pagrindą. Atliekant PGR, pirmiau išvardyti procesai atliekami mėgintuvėlyje cikliniu režimu. Perėjimas iš vienos reakcijos stadijos į kitą pasiekiamas keičiant inkubacinio mišinio temperatūrą. Kai tirpalas pašildomas iki 93-95°C, įvyksta DNR denatūracija. Norėdami pereiti prie kito žingsnio – pradmenų pridėjimo arba „atkaitinimo“ – inkubacinis mišinys atšaldomas iki 50-65°C. Tada mišinys pašildomas iki 70-72°C – optimalus taq-DNR polimerazės veikimas – šiame etape baigiama kurti nauja DNR grandinė. Tada ciklas kartojasi dar kartą. Kitaip tariant PGR metodas yra daugkartinis kopijų skaičiaus padidinimas (stiprinimas) specifinė DNR dalis, katalizuojama fermento DNR polimerazės.

Dukterinės DNR grandinės pratęsimas turi vykti vienu metu abiejose motininės DNR grandinėse, todėl antrosios grandinės replikacijai taip pat reikalingas atskiras pradmuo. Taigi į reakcijos mišinį įvedami du pradmenys: vienas „+“ grandinei, antrasis „-“ grandinei. Sujungę priešingas DNR molekulės grandines, pradmenys apsiriboja ta jos dalimi, kuri vėliau bus pakartotinai padvigubinta arba amplifikuojama. Tokio fragmento, kuris vadinamas amplikonu, ilgis paprastai yra keli šimtai nukleotidų.

PGR žingsniai

Kiekvienas stiprinimo ciklas apima 3 etapus, vykstančius skirtingomis temperatūros sąlygomis (2 pav.).

· 1 etapas: DNR denatūracija . Jis teka 93-95° kampu 30-40 sekundžių.

· 2 etapas: grunto atkaitinimas . Pradmenų prijungimas vyksta papildant atitinkamas sekas priešingose ​​DNR grandinėse tam tikros srities ribose. Kiekviena gruntų pora turi savo atkaitinimo temperatūrą, kurios reikšmės yra 50-65°C diapazone. Atkaitinimo laikas 20-60 sek.

· 3 etapas: DNR grandinių pratęsimas.. Komplementarus DNR grandinių pratęsimas vyksta nuo grandinės 5" galo iki 3" galo priešingomis kryptimis, pradedant nuo pradmenų prisijungimo vietų. Medžiaga naujų DNR grandinių sintezei yra dezoksiribonukleozido trifosfatai, pridedami prie tirpalo. Sintezės procesą katalizuoja fermentas taq-polimerazė ir jis vyksta 70-72°C temperatūroje. Sintezės laikas - 20-40 sek.

Pirmajame amplifikacijos cikle susidariusios naujos DNR grandinės tarnauja kaip šablonai antrajam amplifikacijos ciklui, kuriame susidaro specifinis amplikono DNR fragmentas (3 pav.). Vėlesniuose amplifikacijos cikluose amplikonai tarnauja kaip šablonas naujų grandinių sintezei.

Taigi amplikonai tirpale kaupiasi pagal formulę 2", kur n yra amplifikacijos ciklų skaičius. Todėl net jei pradiniame tirpale iš pradžių buvo tik viena dvigrandė DNR molekulė, tirpale susikaupia apie 108 amplikonų molekulės. 30-40 ciklų Tokio kiekio pakanka patikimam vizualiniam šio fragmento aptikimui agarozės gelio elektroforeze.

Stiprinimo procesas atliekamas specialiame programuojamame termostate ( dviratininkas), kuri pagal nurodytą programą automatiškai keičia temperatūrą pagal stiprinimo ciklų skaičių.

Stiprinimui reikalingi šie komponentai:

· DNR šablonas(DNR arba jos dalis, kurioje yra norimas specifinis fragmentas);

· Gruntai(sintetiniai oligonukleotidai (20-30 nukleotidų porų), papildantys DNR sekas ties konkretaus nustatomo fragmento ribomis). Konkretaus fragmento pasirinkimas ir pradmenų parinkimas vaidina didelį vaidmenį amplifikacijos specifiškumui, o tai turi įtakos analizės kokybei.

· Deoksinukleotido trifosfatų (dNTP) mišinys(keturių dNTP mišinys, kuris yra medžiaga naujų komplementarių DNR grandinių sintezei, kurių lygiavertė koncentracija yra 200–500 mikronų)

· FermentasTaq- polimerazė(termostabili DNR polimerazė, katalizuojanti pradmenų grandinių pailgėjimą nuosekliai pridedant nukleotidų bazes į augančią susintetintos DNR grandinę, 2-3 mm).

· buferinis tirpalas(reakcijos terpė, kurioje yra Mg2+ jonų, būtinų fermentų aktyvumui palaikyti, PH 6,8-7,8).

Norint nustatyti konkrečias RNR virusų genomo sritis, pirmiausia iš RNR šablono gaunama DNR kopija, naudojant atvirkštinės transkripcijos (RT) reakciją, katalizuojamą fermento atvirkštinės transkriptazės (atvirkštinės transkriptazės).

Ryžiai. 2. Stiprinimas (1 ciklas).

Ryžiai. 3. Stiprinimas (2 ciklas).

Pagrindinės PGR taikymo sritys

klinikinė medicina:

o infekcijų diagnostika,

o mutacijų nustatymas, įskaitant paveldimų ligų diagnozę,

o genotipų nustatymas, įskaitant ŽLA genotipą,

o korinio ryšio technologijos

ekologija (kaip būdas stebėti aplinkos objektų ir maisto būklę bei kokybę)

transgeninių organizmų (GMO) apibrėžimas

Asmens tapatybė, tėvystė, teismo ekspertizė

bendroji ir specialioji biologija,

Pagrindiniai principai

diagnostinių laboratorijų organizavimas

Darbas PGR laboratorijoje vykdomas laikantis „Sveikatos priežiūros sistemos sanitarinių ir epidemiologinių įstaigų projektavimo, saugos, pramoninės sanitarijos, antiepideminio režimo ir asmens higienos taisyklių dirbant laboratorijose (skyriuose, skyriuose).

DNR mėginių užteršimas

PGR diagnostikos atlikimas yra susijęs su problema, kurią sukelia didelis metodo jautrumas - galimybė užteršimas. Jei į reakcijos mėgintuvėlį patenka nedidelis teigiamos DNR kiekis (specifiniai DNR amplifikacijos produktai – amplikonai; DNR standartas naudojamas kaip teigiama kontrolė; teigiama klinikinio mėginio DNR), PGR metu amplifikuojamas specifinis DNR fragmentas ir dėl to klaidingai teigiamų rezultatų atsiradimas.

Darbo metu galite susitikti dviejų tipų tarša:

1. kryžminis užteršimas nuo mėginio iki mėginio (apdorojant klinikinius mėginius arba iškasant reakcijos mišinį), todėl atsitiktiniai klaidingai teigiami rezultatai;

2. amplifikacijos produkto užterštumas(amplikonai), o tai turi didžiausią reikšmę, nes PGR proceso metu amplikonai susikaupia didžiuliais kiekiais ir yra idealūs produktai reamplifikacijai.

Dėl indų, automatinių pipečių ir laboratorinės įrangos, laboratorinių lentelių paviršiaus ar net laboratorijos darbuotojų odos paviršiaus užteršimo amplikonais gaunami sistemingi klaidingai teigiami rezultatai. Nustatyti užteršimo šaltinį gali būti labai sunku ir tam reikia didelių laiko ir pinigų investicijų. Patirtis, sukaupta iki šiol dirbant PGR metodą diagnostikai taikančiose laboratorijose, leidžia suformuluoti pagrindinius reikalavimus tokių laboratorijų organizavimui ir pačių tyrimų atlikimui. Šių reikalavimų laikymasis pašalina užteršimo ir klaidingų teigiamų rezultatų gavimo galimybę.

PGR analizės etapai

Geografiškai atskirti, patalpinti į atskiras patalpas (4.5 pav.):

· Prieš PGR kambarys, kur atliekamas klinikinių mėginių apdorojimas, DNR ekstrakcija, reakcijos mišinio paruošimas PGR ir PGR (jei yra sąlygos, paskutinius du veiksmus taip pat rekomenduojama atlikti papildomoje atskiroje patalpoje). Šiose patalpose draudžiama atlikti visus kitus darbus su tiriamomis medžiagomis, kurių PGR diagnostika atliekama šioje laboratorijoje.

· Kambarys po PGR, kur atliekamas amplifikacijos produktų nustatymas. Šioje patalpoje gali būti naudojami kiti aptikimo metodai. Pageidautina, kad patalpa amplifikacijos produktams aptikti būtų kuo toliau nuo patalpų prieš PGR.

Darbo patalpose yra įrengtos ultravioletinės lempos, kurių maksimali spinduliuotė yra 260 nm (DB-60 tipas), kurių greitis yra 2,5 W / 1 m3. Lempos išdėstytos taip, kad darbo stalų, įrangos ir medžiagų paviršiai, su kuriais operatorius liečiasi atliekant PGR analizę, būtų veikiami tiesioginės spinduliuotės. Švitinimas atliekamas per 1 valandą iki darbo pradžios ir per 1 valandą po darbo pabaigos.

Laboratorijos gydytojai dirba su specialiais laboratoriniais drabužiais, kurie keičiami pereinant iš vienos patalpos į kitą, ir su vienkartinėmis pirštinėmis. Drabužių iš skirtingų patalpų apdirbimas atliekamas atskirai. Ant skirtingi etapai PGR analizę atlieka įvairūs darbuotojai.

Darbui naudojami atskiri dozatorių komplektai, plastikiniai ir stikliniai indai, laboratorinė įranga, chalatai ir pirštinės, skirti įvairiems analizės etapams ir negali būti pernešami iš vienos patalpos į kitą. Kiekviename kambaryje esanti įranga, medžiagos ir inventorius yra atitinkamai paženklinti.

Visi darbo etapai atliekami tik naudojant vienkartines eksploatacines medžiagas: automatinių pipečių antgalius, mėgintuvėlius, pirštines ir tt Perkeldami nuo mėginio prie mėginio, būtinai pakeiskite antgalius. Būtina naudoti antgalius su aerozoliniu barjeriniu filtru, kad į pipetę nepatektų tirpalo mikrolašeliai. Panaudoti mėgintuvėliai ir antgaliai išmetami į specialius indus arba konteinerius su dezinfekuojančiu tirpalu. Klinikiniai mėginiai laikomi atskirai nuo reagentų.

Darbo vietos apdirbimui ir valymui kiekviename kambaryje yra vatos-marlės tamponai (servetėlės), pincetai, dezinfekciniai ir inaktyvuojantys tirpalai.

PGR diagnostikos laboratorijoje darbai, susiję su rekombinantinių plazmidžių, turinčių šioje laboratorijoje diagnozuojamų patogenų DNR sekas ar genų fragmentus, gamyba (klonavimu) ir išskyrimu.

Klinikinės medžiagos rinkimas

Tiriama medžiaga PGR gali būti epitelio ląstelių, kraujo, plazmos, serumo, pleuros ir smegenų skysčio, šlapimo, skreplių, gleivių ir kitų biologinių išskyrų, biopsijos mėginiai.

Medžiagos mėginių ėmimas atliekamas atitinkamo profilio gydymo kambario sąlygomis. Paėmus mėginius, mėginius reikia kuo greičiau nuvežti į PGR diagnostikos laboratoriją.

Mėginiai turi būti imami naudojant sterilius, pageidautina vienkartinius instrumentus tik vienkartiniuose steriliuose plastikiniuose arba stikliniuose vamzdeliuose, iš anksto valandą apdorotus chromo mišiniu, kruopščiai nuplauti distiliuotu vandeniu ir kaitinti orkaitėje 150 °C temperatūroje. 1 valandai.

Aptikimo zona (kitas aukštas ar kitas pastatas).

Ryžiai. keturi. PGR laboratorinis prietaisas su aptikimu elektroforezės būdu.

Aptikimo zona (skirtingame aukšte ar pastate)

Ryžiai. 5. PGR laboratorinis prietaisas su fluorescenciniu detektavimu (kiekybinė analizė).

Ryžiai. 6. DNR išgavimo kambarys. Parodyta stalinė dėžutė su baktericidine lempa.

Ryžiai. 7. stiprinimo kambarys.

Ryžiai. aštuoni. Aptikimo kambarys.

Ryžiai. 9. Kraujo mėginiai paveldimų ligų DNR diagnostikai.

Mėginių laikymas ir transportavimas

Paveldimų ligų diagnostikai kraujo mėginiai ilgą laiką laikomi specialiose popierinėse formelėse arba epindorfuose (plastikiniuose mėgintuvėliuose) sušaldyti (9 pav.).

Infekcinėms ligoms diagnozuoti mėginiai laikomi kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 2 valandas. Jei reikia ilgiau laikyti, mėginius galima įdėti į šaldytuvą 2-8°C temperatūroje ne ilgesniam kaip 24 valandų laikotarpiui. Ilgesnis saugojimas (iki 2 savaičių) yra priimtinas užšaldytas šaldiklis esant minus 20°C temperatūrai. Pakartotinis mėginių užšaldymas-atšildymas neleidžiamas.

Jeigu PGR diagnostikos laboratorija ir procedūrų patalpa mėginiams paimti yra geografiškai atskirtos, tai mėginiai turi būti vežami termosuose arba termose, laikantis mėginių laikymo taisyklių ir infekcinių medžiagų gabenimo taisyklių.

DNR išskyrimas iš mėginių

Plačiai paplitęs kietosios fazės sorbcijos metodas, kurį sudaro lizuojančio agento, kuriame yra guanidino tirpalo, pridėjimas, DNR sorbcija ant sorbento, pakartotinis plovimas ir DNR rezorbcija buferiniu tirpalu. Serumo, plazmos ar viso kraujo apdorojimo atveju dažniausiai naudojamas fenolio ekstrahavimo metodas. Metodas apima deproteinizaciją fenoliu/chloroformu, po to DNR (arba RNR) nusodinimą etanoliu arba izopropanoliu. Apdorojimas atliekamas Eppendor P tipo mikrocentrifuginiuose mėgintuvėliuose, kurių tūris yra 1,5 ml. Apdorojimo laikas 1,5-2 valandos (10 pav.).

Ryžiai. dešimt. DNR išskyrimas.

PGR atlikimas

Tam tikras kiekis mėginio iš apdoroto klinikinio mėginio perkeliamas į specialų Eppendorf tipo mikrocentrifugos mėgintuvėlį, kurio tūris yra 0,2 arba 0,5 ml. Į jį įpilamas amplifikacinis mišinys, susidedantis iš vandens, PGR buferio, dNTP tirpalo, pradmenų tirpalo ir tirpalo. Taq polimerazė (į mišinį pridedama paskutinė) Paprastai reakcijos mišinio tūris yra 25 µl Tada į kiekvieną mėgintuvėlį įlašinamas vienas lašas mineralinės alyvos, kad reakcijos mišinys neišgaruotų amplifikacijos metu. programuojamas termostatas (stiprintuvas), kur stiprinimas atliekamas automatiniu režimu pagal duotą programą (11 pav.).

Ryžiai. vienuolika. stiprintuvas" Termocikleris ».

Reakcijos laikas, priklausomai nuo nurodytos programos, yra 2-3 valandos. Lygiagrečiai su eksperimentiniais mėginiais dedami kontroliniai mėginiai: teigiama kontrolė apima visus reakcijos komponentus, tačiau vietoj klinikinio mėginio medžiagos įvedamas kontrolinis tiriamo geno DNR preparatas. Neigiama kontrolė apima visus reakcijos komponentus, tačiau vietoj klinikinės medžiagos ar DNR preparato pridedamas atitinkamas kiekis dejonizuoto vandens arba ekstrakto, kuriame nėra tiriamos DNR. Neigiama kontrolė būtina norint patikrinti reakcijos komponentus, ar juose nėra DNR dėl užteršimo, ir pašalinti klaidingai teigiamus rezultatus.

Rezultatų registracija

Amplifikuotas specifinis DNR fragmentas aptinkamas agarozės gelio elektroforeze, dalyvaujant etidžio bromidui. Etidžio bromidas sudaro stabilų intersticinį junginį su DNR fragmentais, kurie pasirodo kaip šviečiančios juostos, kai gelis apšvitinamas UV spinduliuote, kurio bangos ilgis yra 290-330 nm. Priklausomai nuo gautų PGR amplikonų dydžio, naudojamas gelis, kuriame yra 1,5–2,5 % agarozės. Agarozės geliui paruošti agarozės, buferio ir vandens mišinys ištirpinamas mikrobangų krosnelėje arba vandens vonioje ir įpilamas etidžio bromido tirpalas. Atvėsintas iki 50-60°C, mišinys pilamas į formą 4-6 mm storio sluoksniu ir specialiomis šukomis į gelį padaromos kišenės mėginiui uždėti. Šukos nustatomos taip, kad tarp šulinių dugno ir gelio pagrindo liktų 0,5-1 mm agarozės sluoksnis. Geliui sukietėjus, ant kišenių užtepamas 5-15 µl amplifikatas. DNR fragmentų ilgio žymenų mišinio elektroforezę rekomenduojama atlikti lygiagrečiai su kontroliniais ir eksperimentiniais mėginiais. Paprastai tokiame mišinyje yra dešimt DNR fragmentų 100, 200, 300 ir tt ilgų bazių porų.

Tokio mėginio nustatymas leidžia patikrinti amplikonų ilgį kontroliniuose ir eksperimentiniuose mėginiuose. Gelis su uždėtu mėginiu perkeliamas į elektroforezės kamerą, užpildytą buferiu, kamera prijungiama prie maitinimo šaltinio ir elektroforetinis stiprinimo produktų atskyrimas atliekamas 30-45 minutes, esant 10-15 elektrinio lauko stipriui. V/cm. Šiuo atveju dažų priekinė dalis, kuri yra reakcijos mišinio dalis, turi praeiti mažiausiai 3 cm.

Pasibaigus elektroforezei, gelis perkeliamas į transiliuminatoriaus stiklą ir apžiūrimas ultravioletinėje šviesoje. Dokumentacijai gelis fotografuojamas ant Mikrat 300 plėvelės arba įrašomas naudojant vaizdo sistemą, prijungtą prie kompiuterio.

Pirmiausia įvertinami kontroliniai mėginiai. Elektroforezės juostoje, atitinkančioje teigiamą kontrolę, turėtų būti oranžinė šviečianti juosta. Jo elektroforezinis mobilumas turi atitikti instrukcijose nurodytą amplikono ilgį.

Elektroforezės takelyje, atitinkančiame neigiamą kontrolę, tokios juostos neturėtų būti. Tokios juostos buvimas neigiamoje kontrolėje rodo užteršimą – naudojamų reagentų užterštumą tiriama DNR arba amplikonu. Tiriamieji mėginiai vertinami pagal juostos buvimą atitinkamoje juostoje, kuri yra tame pačiame lygyje kaip juosta teigiamame kontroliniame mėginyje. Juostos švytėjimo intensyvumas atitinka tiriamos DNR kiekį mėginyje, todėl galima pusiau kiekybiškai įvertinti PGR. Paprastai teigiami rezultatai vertinami keturių balų skalėje. Jei juostos švytėjimas bandomajame mėginyje yra labai silpnas, tuomet tokį mėginį reikia pertvarkyti (12 pav.).

Ryžiai. 12. Elektroforezė agarozės gelyje.

PGR programos, skirtostaškinių mutacijų ir genų polimorfizmų diagnostika

Viena iš pirmaujančių PGR taikymo sričių praktinėje sveikatos priežiūros srityje yra taškinių mutacijų ir genų polimorfizmų diagnostika. . Yra tiesioginiai ir netiesioginiai DNR diagnostikos metodai. Tais atvejais, kai yra žinomas genas, kurio pažeidimas lemia paveldimos ligos išsivystymą, šį pažeidimą galima nustatyti molekulinės genetikos metodais. Tokie metodai vadinami tiesioginiais. Taikant tiesioginius metodus, nustatomi pirminės DNR nukleotidų sekos sutrikimai (mutacijos ir jų tipai). Tiesioginiai metodai pasižymi tikslumu, siekiančiu beveik 100%.

Tačiau praktiškai šie metodai gali būti taikomi tam tikromis sąlygomis.:

su žinoma citogenetine geno, atsakingo už paveldimos ligos vystymąsi, lokalizacija;

Ligos genas turi būti klonuotas ir žinoma jo nukleotidų seka.

Tiesioginės DNR diagnostikos tikslas – nustatyti mutantinius alelius.

Taigi tais atvejais, kai yra žinoma, koks DNR pažeidimas sukelia paveldimą ligą, DNR fragmentas, kuriame yra pažeidimas, tiriamas tiesiogiai, t. y. naudojamas tiesioginis DNR diagnostikos metodas.

Tačiau iki šiol daugelio ligų genai nėra kartografuoti, nežinoma jų egzonintronų organizacija, daugeliui paveldimų ligų būdingas ryškus genetinis heterogeniškumas, neleidžiantis visapusiškai panaudoti tiesioginių DNR diagnostikos metodų. Todėl tais atvejais, kai žalos lokalizacija nežinoma, taikomas kitoks požiūris, siejamas su geno, atsakingo už genų ligą, apylinkių tyrimu, kartu su šeimos analize, tai yra netiesioginiais molekulinės genetinės diagnostikos metodais. vartojamos paveldimos ligos.

Taškinėms mutacijoms ir nedidelėms delecijoms nustatyti gali būti naudojami įvairūs metodai, tačiau visi jie yra pagrįsti PGR metodo naudojimu. Ši reakcija leidžia pakartotinai padauginti DNR nukleotidų seką ir tada ieškoti mutacijų. DNR fragmentų, turinčių mutacijas, paieškos metodai yra pagrįsti lyginamąja mutantinių ir normalių DNR nukleotidų sekų analize.

PGR produktų analizė

tiesioginės DNR diagnostikos procese

Tai apima specifinių geno amplifikuoto regiono savybių tyrimą. Taigi, sergant ligomis, kurias sukelia trinukleotidų pasikartojimų išsiplėtimas, amplifikacijos produktai skiriasi savo ilgiu (atspindi skirtingą tripletų skaičių tiriamame geno regione) ir dėl to judėjimo greičiu gelyje. Dėl to pasiekiamas aiškus normalių ir mutantinių alelių elektroforetinis atskyrimas ir tikslus patologiškai pailgėjusio fragmento nustatymas, t.y. ligos DNR diagnozė (13 pav.).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Ryžiai. keturiolika. Ištrynimo diagnozė GAG gene DYT 1 pacientams, sergantiems nuo dopa nepriklausoma distonija (poliakrilamido gelio elektroforezė). Trasos 2,3,6 - serga; juostos 1,4,5 - kontrolė. Plona rodyklė rodo normalų alelį, paryškinta rodyklė rodo trumpesnį mutantinį alelį (trijų nukleotidų ištrynimas).

Jei tiriama DNR sritis yra visiškai įtraukta į išplėstinę deleciją, tada DNR PGR amplifikacija iš šio pašalinto alelio nebus atlikta, nes trūksta vietų pradmenų hibridizacijai. Tokiu atveju homozigotinė delecija bus diagnozuota remiantis visišku reakcijos PGR produkto nebuvimu (DNR sintezė neįmanoma iš abiejų geno kopijų). Esant heterozigotinei delecijai, galima identifikuoti PGR produktą, susintetintą iš normalaus (saugaus) alelio, tačiau norint patikimai diagnozuoti tokią mutaciją, būtina naudoti sudėtingesnius DNR vizualizacijos metodus, leidžiančius įvertinti galutinis PGR produktas.

Norint nustatyti taškines mutacijas (dažniausiai nukleotidų pakaitalus) tam tikrose vietose, PGR metodas naudojamas kartu su kitais molekulinės genetinės analizės metodais. Jei siūlomos taškinės mutacijos vieta ir pobūdis yra tiksliai žinomi, norint tikslingai aptikti tokią mutaciją, restrikcijos endonukleazės (riboja) yra specialūs ląstelių fermentai, išskirti iš įvairių bakterijų padermių.

Šie fermentai atpažįsta specifines nukleotidų sekas, kurių ilgis yra nuo keturių iki dešimties nukleotidų. Tada jie atlieka šių sekų restrikciją (lot. (pjovimą) kaip dvigrandės DNR molekulės dalį. Kiekvienas restrikcijos fermentas atpažįsta ir fiksuotoje vietoje perpjauna griežtai apibrėžtą, specifinę nukleotidų seką) apribojimo vieta (atpažinimo vieta).

Tais atvejais, kai taškinė mutacija pakeičia natūralią konkretaus restrikcijos fermento atpažinimo vietą, tas fermentas negalės suskaldyti mutantinio PGR amplifikuoto fragmento. Kai kuriais atvejais dėl mutacijos atsiranda nauja tam tikro restrikcijos fermento atpažinimo vieta, kurios normoje nėra.

Abiem atvejais mutantiniai ir normalūs PGR produktai, apdoroti pasirinktu restrikcijos fermentu, duos skirtingo ilgio restrikcijos fragmentus, kuriuos galima nesunkiai aptikti elektroforezės būdu (15 pav.).

Taigi, jei reikia greitai aptikti kokią nors konkrečią taškinę mutaciją, užduotis sumažinama iki atitinkamo restrikcijos fermento, kurio atpažinimo vieta yra lokalizuota sutrikusios nukleotidų sekos vietoje, paieška. PGR produktų apdorojimas šiuo restrikcijos fermentu leis lengvai atskirti normalius ir mutantinius alelius. Restrikcijos analizė labai supaprastina žinomų taškinių mutacijų nustatymą ir šiuo metu plačiai naudojama tiesioginei paveldimų ligų DNR diagnostikai.

paskutinis etapas mutacijų molekulinė genetinė analizė yra tiriamo DNR fragmento nukleotidų sekos nustatymas (sekvenavimas), kuris lyginamas su norma ir suformuluojama galutinė genetinė diagnozė. Dėl molekulinės genetikos pažangos DNR diagnostikos metodai dabar sukurti daugiau nei 400 paveldimų ligų.

Ryžiai. penkiolika. Taškinės mutacijos aptikimas naudojant restrikcijos analizę: A – amplifikuojama geno sritis, turinti restrikcijos vietąAGCTdėl restrikcijos endonukleazėsAlu aš. MutacijaG→ Apakeičia šią nukleotidų seką, todėl susidaro restrikcijos fermentasAluiužblokuotas; B - restrikcijos produktų elektroferograma: 1 juosta - homozigotiškumas normaliam aleliui; 2 juosta, homozigotiškumas mutacijai; 3 juosta – heterozigotinė būsena (normalus alelis + mutacija).

Paveldimų ligų diagnostika, pagrįsta tiesioginiu pacientų, jų šeimos narių ar spėjamų heterozigotinių patologinių mutacijų nešiotojų mutantinių alelių ištyrimu, tinka presimptominei ir prenatalinei diagnostikai, kuri gali būti taikoma ankstyviausiose vaisiaus vystymosi stadijose, dar nepasireiškus vaisiaus vystymuisi. bet kokie klinikiniai ar biocheminiai simptomai.ligą.

Nepriklausomai nuo mutacijų aptikimo metodo, tikslią kiekvienos mutacijos molekulinę apibūdinimą galima gauti tik tiesiogiai nustatant seką. Norėdami automatizuoti šį procesą pastaraisiais metais Plačiai naudojami specialūs įrenginiai – sekvenatoriai, kurie leidžia žymiai pagreitinti DNR informacijos nuskaitymo procesą.

Kelias platesniam molekulinių biologinių tyrimų pritaikymui klinikinės diagnostikos laboratorijose atveriamas paspartinus analitinį procesą, visas procedūras atliekant vienu kontinuumu, neperkeliant mėginių, sudarant sąlygas išvengti užteršimo lygiagrečiai tiriant daugybę analičių ir objektyviai registruojant. kiekvieno ciklo rezultatų.

Pagrindinės PGR metodo modifikacijos

Naudojamas greitai nuskaityti ir ieškoti žinomų genų mutacijų.

Multipleksinė (multipramerinė) PGR

Šis metodas pagrįstas kelių tiriamo geno egzonų amplifikavimu vienu metu vienoje reakcijoje. Tai leidžia ekonomiškai greitai patikrinti dažniausiai pasitaikančias mutacijas. Pavyzdžiui, norint greitai diagnozuoti distrofino geno delecijų pernešimą pacientams, sergantiems progresuojančia Duchenne/Becker raumenų distrofija, vienu metu atliekama dažniausiai mutuojančių šio geno egzonų rinkinio amplifikacija. Kadangi šios ligos yra paveldimos su X susietu recesyviniu tipu ir yra susijusios su vienintelės X chromosomos pažeidimu berniukams, ilgesnės delecijos atveju reakcijos produktų elektroforezė parodys, kad nėra vieno ar daugiau DNR fragmentų (egzonų). ), kuris gali būti molekulinis diagnozės patvirtinimas. Be to, parenkant specifines genų sritis PGR amplifikacijai, galima gana tiksliai įvertinti bendrą delecijos ir genų lūžio taškų ilgį (iki egzono).

Kombinuotas kelių daugialypių reakcijų naudojimas leidžia diagnozuoti iki 98 % visų ištrynimų, atsirandančių pacientams, sergantiems progresuojančia Duchenne/Becker raumenų distrofija. Tai yra maždaug 60 % visų žinomų distrofino geno mutacijų skaičiaus ir rodo labai didelis efektyvumasšis atrankos metodas distrofinopatijos DNR diagnostikai (16 pav.).

Ryžiai. 16. Tiesioginė Diušeno raumenų distrofijos DNR diagnostika naudojant multipleksinę PGR (agarozės gelio elektroforezę). Kiekviename iš tirtų asmenų vienu metu buvo amplifikuoti keturi distrofino geno egzonai (17, 19, 44 ir 45 egzonai; rodyklės rodo atitinkamus amplifikacijos produktus). 1 juosta - kontrolinė, 2-5 juostos - pacientai, sergantys Diušeno raumenų distrofija su įvairiomis distrofino geno delecijomis (2 ir 5 juostos - 45 egzono delecija, 3 juosta - 44 egzono delecija, 4 juosta - 17 ir 19 egzonų delecija ).

Aleliui būdingas amplifikavimas

Metodas pagrįstas dviejų nepriklausomų pradmenų porų naudojimu konkrečiam geno regionui: vienas pradmuo abiejose porose yra bendras, o antrasis kiekvienos poros pradmuo turi skirtingą struktūrą ir papildo normalią arba mutantinę DNR sekas. . Dėl tokios reakcijos tirpale vienu metu gali būti susintetinti dviejų tipų PGR produktai – normalūs ir mutantiniai. Be to, naudojamų pradmenų konstrukcija leidžia aiškiai atskirti normalius ir mutantus amplifikacijos produktus pagal jų molekulinį dydį. Šis metodas yra labai aiškus ir leidžia patikrinti tiek homo-, tiek heterozigotinį mutantinio alelio nešimą.

Amplifikuotos DNR modifikavimo vietoje metodas

Metodas pagrįstas vadinamojo neatitikimo pradmens (ne visiškai papildančio šabloną) naudojimu PGR, kuris skiriasi nuo šabloninės DNR sekos vienu nukleotidu. Į mutantinio PGR produkto sudėtį įtraukus nurodytą pradmenį, jame susidaro dirbtinai sukurta vienos iš restrikcijos endonukleazių restrikcijos vieta, kuri leidžia tiesiogiai DNR diagnozuoti tam tikrą žinomą mutaciją naudojant restrikcijos analizę. Sukurti tokią dirbtinę restrikcijos vietą gali prireikti, jei paieška neatskleidė žinomo ir prieinamo fermento, kurio „natūrali“ restrikcijos vieta yra paveikta dėl tiriamos mutacijos atsiradimo DNR molekulėje. .

Atvirkštinės transkriptazės PGR metodas (RT- PGR)

Šis metodas taikomas tais atvejais, kai tyrimo objektu patogiau naudoti ne genominę DNR, o kompaktiškesnę ir informatyvesnę cDNR, gautą tinkamai apdorojus audinių mėginius, pavyzdžiui, biopsijos medžiagą ar limfocitų ląstelių linijas, fibroblastai ir kt. Čia svarbi sąlyga yra norimo geno ekspresija (bent jau minimali) tiriamame audinyje.

Pirmajame etape atliekama atvirkštinė mRNR transkripcija, o gautos cDNR molekulės yra PGR šablonas. Vėliau pakankamu kiekiu amplifikuotai kritinei cDNR sričiai atliekama sekvenavimo ir kitų mutacijų atrankos, tiesioginio elektroforezinio tyrimo (delecijų, intarpų ir kt. aptikimo) arba integravimo į ekspresijos sistemą metodais, siekiant gauti. baltyminis produktas ir jos tiesioginė analizė.

Šis metodas ypač efektyvus nustatant mutacijas, vedančias į „sutrumpinto“ baltymo sintezę (nesąmonių mutacijos, sujungimo mutacijos, didelės delecijos) – tai vadinamoji PTT analizė (Protein Truncation Test). PTT analizė dažniausiai naudojama tiriant išplėstinius kelių egzonų genus, tokius kaip Duchenne/Becker raumenų distrofijos, ataksijos-telangiektazijos arba 1 tipo neurofibromatozės genas.

realaus laiko PGR(realiojo laiko PGR)

Kiekvienais metais praktinėje sveikatos priežiūros srityje realaus laiko PGR tampa vis populiaresniu diagnostikos metodu. Pagrindinis jo bruožas yra polimerazės grandininės reakcijos produktų kaupimosi stebėjimas ir kiekybinė analizė bei automatinis rezultatų registravimas ir interpretavimas. Šis metodas nereikalauja elektroforezės pakopos, todėl sumažėja PGR laboratorijos reikalavimai. Sutaupius gamybos plotą, sumažėjus darbuotojų skaičiui ir DNR/RNR kiekybinio įvertinimo poreikiui, šis metodas pastaraisiais metais sėkmingai naudojamas didžiausiuose išsivysčiusių pasaulio šalių sanitarinės epidemijos, diagnostikos ir tyrimų centruose, pakeičiant PGR dabartinį ("klasikinį") formatą.

Realaus laiko PGR naudoja fluorescenciniu būdu pažymėtus oligonukleotidinius zondus, kad aptiktų DNR amplifikacijos metu. Realaus laiko PGR leidžia atlikti visą mėginio analizę per 20-60 minučių ir teoriškai gali aptikti net vieną DNR ar RNR molekulę mėginyje.

Ryžiai. 17. PCR realiu laiku.

Realaus laiko PGR naudoja TaqMan sistemą, kad kontroliuotų PGR kinetiką tiesiogiai amplifikacijos metu, naudojant rezonansinį fluorescencinį gesinimą. Aptikimui naudojamas zondas, turintis fluoroforą ir gesintuvą, papildantį amplifikuoto fragmento vidurinę dalį. Kai fluoroforas ir gesintuvas yra prijungti prie oligonukleotido zondo, pastebima tik nedidelė fluorescencinė emisija. Amplifikacijos proceso metu dėl Taq polimerazės 5'-egzonukleazės aktyvumo fluorescencinė etiketė pereina į tirpalą, išsilaisvindama nuo gesintuvo arti, ir generuoja fluorescencinį signalą, kuris didėja realiu laiku proporcingai kaupimuisi. amplifikuoti (17 pav.).

Pagrindiniai PGR-realiojo laiko pranašumai, palyginti su PGR su gelio elektroforeze:

Visas metodas vyksta viename mėgintuvėlyje;

· Metodas trunka 1 valandą;

Pakanka 1-2 darbo kambarių;

Kartu su kokybiniu rezultato įvertinimu atsiranda galimybė kiekybiškai įvertinti rezultatą (pvz., skiriant antivirusinį AIDS ar virusinis hepatitas būtina žinoti viruso apkrovą, t.y. viruso kiekį 1 vienete, kuris užtikrina realaus laiko PGR);

· Dramatiškai sumažina užteršimo riziką.

Išvada

PGR metodas yra vienas iš labiausiai paplitusių molekulinių biologinių tyrimų metodų. Šį metodą gydytojai turėtų naudoti prasmingai, o gydytojas, nusprendęs savo darbe naudoti PGR, turi turėti tam tikrų žinių apie šio metodo ypatybes ir galimybes. Antra, tarp gydytojo ir PGR laboratorijos turi būti glaudus grįžtamasis ryšys, kuris būtinas sudėtingų atvejų analizei ir teisingos diagnostikos strategijos sukūrimui. Trečia, PGR analizė nėra panacėja diagnozuojant (pirmiausia infekcines ligas) ir nepakeičia esamų tyrimo metodų, o tik juos papildo. O svarbiausia – PGR negali pakeisti intuicijos ir analitinio mąstymo, kurį turėtų turėti gydytojas, kuris tikisi sėkmės.

P . S . Molekuliniai-biologiniai tyrimai – diagnostikos ir gydymo atskaitos taškų kaita. Molekulinių biologinių metodų naudojimas yra susijęs su radikalaus laboratorinės diagnostikos akcentų pasikeitimo perspektyva. Galime kalbėti ne tik apie savalaikę informaciją, bet ir apie išankstinį jos gavimą. Jei dabar laboratoriniai tyrimai daugeliu atvejų atliekami jau pažengusiai ligai ir pradėtas gydymas, tai tikimasi, kad iš molekulinės biologinės laboratorinės informacijos bus galima nustatyti žmogaus polinkį į tam tikros rūšies patologijas ir jautrumo tam tikriems vaistams laipsnį, leis pagrįsti prognozuojamą, prevencinį ir personalizuotą ateities medicinos pobūdį.

DIAGNOZĖS IR GYDYMO DĖMESIO KEITIMAS

PAVELDIMOS LIGOS

Šiandien Ateityje

Diagnozė Genetinis pasas

8. Kiek darbo patalpų reikia PGR laboratorijai su fluorescencijos nustatymu (kiekybinė analizė, realaus laiko PGR)?

9. Kas yra aptikimas?

10. Kokie išskiriami DNR diagnostikos metodai?

11. Kuris fermentas veikia PGR pagrindu?

12. Kodėl aptikimo zona turi būti atskirta nuo kitų darbo zonų?

13. Kas yra apribojimų svetainė?

14. Kuo skiriasi tiesioginis DNR diagnostikos metodas nuo netiesioginio?

15. Kas yra sekvenavimas?

16. Kas yra multipleksinė PGR?

17. Kokių tipų mutacijos nustatomos PGR?

18. Kas yra tarša?

19. Kokia yra aleliui specifinio amplifikacijos metodo esmė?

20. PGR medžiagos laikymo sąlygos?

21. Koks įrenginys naudojamas stiprinimui?

22. Koks yra atvirkštinės transkriptazės PGR (RT-PGR) metodas?

23. Kokia medžiaga PGR diagnostikai?

24. Išvardykite užterštumo tipus?

Testai savarankiškam mokymuisi

1. Restrikcijos endonukleazės:

a) fermentai, „sulaužantys“ DNR griežtai tam tikrose vietose;

b) fermentai, kurie susiuva DNR molekulės plyšius;

c) fermentai, kurie suteikia junginių, kurie atlieka DNR taisymą.

2. Genų amplifikacija:

3. Kuris iš molekulinės genetikos metodų naudojamas diagnozuojant ligas, kurias sukelia žinomos sekos mutantinis genas?

a) konkretaus apribojimo naudojimas;

b) tiesioginis aptikimas naudojant specifinius molekulinius zondus;

c) normalaus restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmo pasiskirstymo šeimos analizė.

4. DNR sekos nustatymas:

a) DNR bazinės sekos identifikavimas;

b) pakartotinis bet kurio DNR segmento pasikartojimas;

c) DNR fragmento, kuriame yra tiriamas genas, išskyrimas.

5. DNR mėginius galima gauti naudojant :

b) choriono gaureliai;

c) vaisiaus vandenys;

d) vaisiaus vandenų ląstelės;

e) odos, raumenų, kepenų biopsijos,

e) viskas teisinga, išskyrus "c" punktą,

g) viskas teisinga, išskyrus "d" punktą,

h) Visa tai, kas išdėstyta pirmiau, yra teisinga.

6. Kokios mutacijos diagnozuojamos PGR?

a) genominis;

b) chromosomų;

c) genas (taškas).

7. Gruntas yra:

a) papildoma DNR dalis;

b) sintetinį oligonukleotidą, pažymėtą (radioaktyviai arba fluorescenciškai) seką, komplementarią mutantui arba normaliam genui;

c) oligonukleotidas, veikiantis kaip "sėkla" ir inicijuojantis polinukleotidinės grandinės sintezę DNR arba RNR šablone.

8. Kas sukūrė PGR metodo principą?

b) K. Mullis

9. Ar PGR metodas naudojamas trinukleotidų pasikartojimų (dinaminio tipo mutacijų) išsiplėtimui diagnozuoti?

10. Kokiose srityse naudojamas PGR?

a) klinikinė medicina;

b) transgeninių organizmų (GMO) apibrėžimas

c) asmens identifikavimas, tėvystės nustatymas, kriminalistika

d) visa tai, kas išdėstyta pirmiau

d) nė vienas iš aukščiau išvardytų dalykų.

Atsakymų pavyzdžiai: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - in; 7 - į; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Pagrindinis

1. Bočkovo genetika. Maskva. GEOTAR, 2002 m.

Papildomas

1., Bakharevas ir įgimtų bei paveldimų vaikų ligų gydymas. - Maskva, 2004 m.

2. DNR diagnostika ir medicininis genetinis konsultavimas. - Maskva, 2004 m.

3. Ginter genetika. - Maskva, 2003 m.

4. Gorbunov medicinos genetikos pagrindai. – Sankt Peterburgas: Intermedica, 1999 m.

5. J. McGee. Molekulinė klinikinė diagnostika. – Pasaulis, 1999 m.

6. Menšikovas - biologiniai tyrimai klinikinėje laboratorinėje diagnostikoje: problemos galimybės (paskaitos). Klinikinė laboratorinė diagnostika, 2006 Nr.3.

7. Kornienko apie PGR laboratorijos darbą atliekant tiesioginę biologinės medžiagos analizę. Klinikinė laboratorinė diagnostika, 2006 Nr.10.

8. PGR laboratorijos darbo organizavimas. Metodinės instrukcijos. MU 1.3.1794-03. Rusijos Federacijos vyriausiasis sanitaras, 2003 m.

9. Erlicho H. A. PGR technologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993 m.

10. Heid C. A., Stevens J. Realaus laiko kiekybinė PGR. Genome Res. - 1996 Nr.6.

PAGRINDINIAI METODO PRINCIPAI

POLIMERAZĖS GRANDINĖ REAKCIJA

Bendrosios medicinos (060101) ir pediatrijos (060103) specialybių 3-4 kursų studentų popamokinio darbo metodinis vadovas.

SEI HPE "Federalinės sveikatos ir socialinės plėtros agentūros Krasnojarsko valstybinė medicinos akademija"

Rusija, Krasnojarskas,

S.V. Pospelova, M.V. Kuznecova

polimerazės grandininė reakcija

S.V. Pospelova– Cand. medus. Mokslai, Mikrobiologijos, virusologijos ir imunologijos katedros docentas, M.V. Kuznecova– Cand. biol. Sci., IEGM UB RAS darbuotojas

Pospelova, S.V.

Skirtas savarankiškam visų fakultetų: medicinos, pediatrijos, medicinos ir profilaktikos, odontologijos ir Medicinos akademijos aukštojo slaugos fakulteto (FVSO) studentų darbui.

Recenzentas:

galva PSMA Biologijos, ekologijos ir medicininės genetikos katedros profesorius A.B. Vinogradovas

Atspausdinta centrinio koordinatoriaus sprendimu
GOU VPO PGMA metodinė taryba
juos. ak. E.A. Vagneris Roszdravas

UDC 616-078.33

© Pospelova S.V., Kuznecova M.V., 2007 m

© GOU VPO PGMA im. ak. E.A. Wagneris Roszdravas, 2007 m

Polimerazės grandininė reakcija klinikinėje praktikoje
mikrobiologinė diagnostika

Šiuolaikinė medicina sėkmingai naudoja gamtos mokslų pasiekimus, intensyviai taiko naujas technologijas ligų diagnostikai ir gydymui. Pastaruoju metu prie tradicinių mikrobiologinių ir imunologinių infekcinių ligų laboratorinės diagnostikos metodų atsirado naujų metodų, pagrįstų molekulinių genetinių technologijų panaudojimu. Šių metodų naudojimas ne tik moksliniais tikslais, bet ir praktinėje laboratorinėje diagnostikoje, didžiąja dalimi tapo įmanoma dėl devintojo dešimtmečio viduryje sukurto dirbtinio daugkartinio DNR kopijavimo proceso ir tolesnės sparčios šios technologijos, šiuo metu žinomos kaip polimerazės grandininė reakcija(PGR). Per mažiau nei 15 gyvavimo metų PGR tapo įprasta daugelio patogenų specifinių DNR sekų analize. Dėl universalumo, didelio jautrumo ir sąlyginio vykdymo paprastumo PGR metodas tapo nepakeičiamu sprendžiant įvairias problemas. klinikinė diagnostika pavyzdžiui, tiesioginis patogenų aptikimas ir identifikavimas, molekulinis tipavimas ir apibūdinimas patogeniniai mikroorganizmai, mutacijų, susijusių su žmogaus genetinėmis ligomis, analizė, žmogaus asmenybės identifikavimas.

Kas yra PGR?

polimerazės grandininė reakcija(PGR) – dirbtinis pakartotinio kopijavimo procesas (stiprinimai) atlikta specifinė DNR seka in vitro(1 pav.). DNR kopijavimas PGR metu atliekamas specialiu fermentu - DNR polimerazė, kaip ir gyvų organizmų ląstelėse. DNR polimerazė, judėdama išilgai vienos DNR grandinės (matricos), sintezuoja savo komplementarią DNR seką. Svarbu, kad DNR polimerazė negalėtų pradėti DNR grandinės sintezės „nuo nulio“, jai reikia trumpos „sėklinės“ RNR arba DNR grandinės, į kurią ji gali pradėti pridėti nukleotidų. Pagrindinis PGR principas yra tas, kad polimerizacijos reakciją (DNR polimero grandinės sintezę iš monomerinių nukleotidų vienetų) inicijuoja specifiniai gruntai(trumpi „sėklos“ DNR fragmentai) kiekviename iš daugelio pasikartojančių ciklų. PGR specifiškumą lemia pradmenų gebėjimas „atpažinti“ griežtai apibrėžtą DNR sritį ir prie jos prisijungti pagal molekulinio principą. papildomumo.

Įprastinėje PGR reakcijoje naudojama pradmenų pora, kuri „riboja“ amplifikuotą sritį iš abiejų pusių, prisijungdama prie priešingų DNR šablono grandžių. Norint padauginti pradinės DNR kopijų skaičių, reikalinga ciklinė reakcija. Paprastai kiekvienas iš eilės kartojamas PGR ciklas susideda iš trijų etapų:

1)denatūravimas, arba dvigrandės DNR „lydymas“: prieš prasidedant reakcijai tikslinė DNR yra dvigrandė, 94-95 0 C temperatūroje komplementarios DNR grandinės išsiskiria – pereina į viengrandę būseną;

2) įrišimas (atkaitinimas) pradmenys: esant pasirinktiems pradmenims optimalioje temperatūroje, jie jungiasi prie DNR šablono komplementarios srities;

3)pailgėjimas, arba grandinės pailgėjimas: DNR polimerazė prideda nukleotidų prie pradmenų, sintezuodama naujas DNR grandines, kurios tampa pradmenų taikiniais vėlesniuose PGR cikluose.

Kiekvieno ciklo etapų kaita atliekama keičiant reakcijos mišinio temperatūrą (žr. 1 pav.).

Ryžiai. 1. Pagrindiniai PGR ciklo etapai

Iš pradžių pradmenys gali jungtis tik prie tam tikros pradinės DNR sekos, tačiau vėlesniais ciklais prisijungia prie šios sekos kopijų, susintetintų ankstesniuose cikluose. Tokiu atveju pagrindinio PGR produkto (praimeriais apribotos DNR sekos kopijos) kiekis teoriškai padvigubėja kiekviename cikle. Jei pradiniame cikle tiriamoje medžiagoje buvo tik viena tikslinė DNR, po pirmojo ciklo jau bus dvi kopijos, po dviejų ciklų - 4 kopijos, trečiojo ciklo rezultatas bus 8 kopijos, o trisdešimt penktas – jau 68 milijardai egzempliorių (2 pav.).

Ryžiai. 2. Daugkartinio kopijavimo procesas
Tikslinė DNR nuoseklaus veikimo metu
besikeičiantys ciklai

Pagrindinis reakcijos produktų analizės metodas, kuris tradiciškai naudojamas daugelyje laboratorijų amplifikuotai DNR aptikti ir jos dydžiui nustatyti, yra metodas. gelio elektroforezė po to dažomas DNR specifiniais dažais, pvz., etidžio bromidu (3 pav.).

Kontrolė – įvairūs DNR fragmentai su žinomu juos sudarančių nukleotidų skaičiumi. Yra žinoma, kad atstumas tarp skirtingų fragmentų logaritmiškai priklauso nuo jų dydžio ir masės. 1 eilutė – buvo aptikti maždaug 1850 bazių PGR fragmentai. 2 ir 4 eilutės yra maždaug 800 bazių ilgio fragmentai.

Ryžiai. 3. Reakcijos produktų analizė metodu
gelio elektroforezė

3 eilutė - norimi fragmentai nebuvo aptikti, neigiamas reakcijos rezultatas. 5 eilutė – susidarė kelios linijos, nes pradmenys buvo komplementarūs keliems įvairaus ilgio DNR fragmentams: apie 550, 800 ir 1500 bazių.

PGR technologijos tobulinimas

Iš pradžių PGR atlikti buvo naudojamos įprastos DNR polimerazės, kurios kiekviename cikle buvo inaktyvuojamos DNR denatūravimo stadijoje. Į reakcijos mišinį teko pakartotinai dėti polimerazę, o tai buvo gana sudėtinga ir neleido automatizuoti proceso.

Reakcija naudoja termostabilūs DNR polimerazės, kurios atlaiko aukštą temperatūrą visuose PGR ciklo etapuose kelias dešimtis ciklų. Prekyboje parduodamų termostabilių DNR polimerazių, kurios skiriasi kai kuriomis savo savybėmis, skaičius yra gana didelis. Dažniausiai naudojamas Taq polimerazė, iš pradžių išskirtas iš termofilinio mikroorganizmo Thermus aquaticus. Kitos polimerazės dažniau naudojamos specifiniams PGR taikymams. Šiuolaikiniai komerciniai termostabilių polimerazių preparatai, kaip taisyklė, užtikrina stabilų atkuriamąjį aktyvumą, o tai leidžia naudoti PGR technologiją standartinėje laboratorinėje praktikoje.

Techninis reakcijos mišinio temperatūros keitimo projektas pastaraisiais metais taip pat sparčiai vystėsi. Pirma, PGR buvo atlikta naudojant tris vandens voneles, nustatytas skirtingoms temperatūroms: DNR denatūravimui, pradmenų atkaitinimui ir polimerizacijai. Mėgintuvėliai iš vienos vandens vonios į kitą buvo perkeliami „ratu“, dėl to skirtinguose ciklo etapuose vyko temperatūros pokytis. Buvo ir įrenginių versijų, kai į vandens vonią pakaitomis buvo tiekiamas skirtingos temperatūros vanduo, kuriame buvo mėgintuvėliai su reakcijos mišiniu. Šiais atvejais ciklų keitimas užtruko ilgai, o procesą buvo sunku automatizuoti. PGR įgyvendinimui dažniausiai naudojami instrumentai (šiluminiai dviračiai), kurios automatiškai keičia temperatūrą pagal nustatytą programą. Termocikleriuose mėgintuvėliai su reakcijos mišiniu dedami į metalinį bloką, kurio temperatūra kinta dideliu greičiu, o tai sumažina kiekvieno PGR ciklo trukmę.

Šiuolaikiniai termocikleriai pritaikyti reakcijos mišiniui naudoti specialius plonasienius plastikinius mėgintuvėlius, kurie leidžia pagreitinti šilumos mainus tarp įrenginio bloko ir reakcijos mišinio ir galiausiai dar labiau sutrumpinti reakcijos laiką.

Taigi standartinis PGR gali būti atliktas per 1-3 valandas.Daugelis prietaisų leidžia programuoti specialius sudėtingus temperatūros profilius, reikalingus specifinėms PGR proceso modifikacijoms.

Lygiagrečiai tobulėjant PGR technologijai, buvo sukurti ir reakcijos produktų analizės metodai. Metodas gelio elektroforezė po to dažymas specifiniais DNR dažais, tokiais kaip etidžio bromidas, tradiciškai naudojamas daugelyje laboratorijų amplifikuotai DNR aptikti ir jos dydžiui nustatyti. Naudojimas hibridizacija su vidiniais DNR zondais kai kuriais atvejais leidžia žymiai padidinti PGR produktų aptikimo jautrumą ir specifiškumą. Kadangi nėra poreikio ruošti ir atlikti elektroforetinį atskyrimą, automatizuojant didelio mėginių skaičiaus analizę ir naudojant neradioaktyvų aptikimo formatą, šis metodas tampa vis dažnesnis. Kai kuriais atvejais specialių fluorescencinių „žymenų“ naudojimas leidžia kontroliuoti amplifikacijos eigą arba PGR galutinių produktų aptikimą tiesiai reakcijos mėgintuvėlyje.

Naudojant PGR
medicinos mikrobiologijoje

Tarp daugybės skirtingų klinikinės diagnostikos sričių medicinos mikrobiologija galbūt užima pirmaujančią vietą pagal PGR technologiją naudojančių pritaikymų skaičių ir įvairovę. Šio metodo įdiegimas praktikoje, kartu su serologine diagnostika, gerokai praplėtė šiuolaikinės klinikinės mikrobiologijos, kuri vis dar remiasi mikroorganizmų išskyrimo ir kultivavimo dirbtinėse maistinėse terpėse ar ląstelių kultūroje metodais, galimybes.

Tradicinės galimybės ir apribojimai
auginimo būdai

Tradicinis mikrobiologinėms laboratorijoms, kultūros diagnostikos metodas, kaip taisyklė, puikiai pasiteisina nustatant ir tiriant tokias savybes kaip jautrumas antibiotikams, lengvai auginamų mikroorganizmų virulentiškumas. Tačiau kai kurie mikroorganizmai (pneumokokai, hemofilai, neisserija, mikoplazmos, privalomieji anaerobai ir kt.) gali būti itin jautrūs klinikinės medžiagos mėginių ėmimo, transportavimo ir auginimo sąlygoms, specialių augimo faktorių buvimui arba gali daugintis. in vitro tik ląstelių kultūroje (virusai, chlamidijos, riketsijos).

Lėtas mikroorganizmų, tokių kaip mikobakterijos ir grybai, augimas dirbtinėje terpėje yra dar vienas natūralus apribojimas, susijęs su kultivavimo metodo naudojimu šiems mikroorganizmams diagnozuoti. Be to, darbas su gyvomis izoliuotų patogenų kultūromis, ne tik ypač pavojingais, bet kartais ir oportunistiniais patogenais, gali kelti grėsmę laboratorijos darbuotojų sveikatai.

Tarp žmonių ligų sukėlėjų žinomos ir, pavyzdžiui, nekultivuojamos bakterijų rūšys Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, ir daugelio tipų virusai, įskaitant žmogaus papilomos virusus ir hepatitą C, kurių bandymai augti ląstelių kultūroje iki šiol buvo nesėkmingi. Galiausiai, net ir sėkmingai auginant, reikia vėliau identifikuoti izoliuotus mikroorganizmus.

Tradiciniai mikrobiologiniai identifikavimo metodai yra pagrįsti įvairių fenotipinių testų naudojimu, pavyzdžiui, specifinio fermentinio aktyvumo nustatymu, gebėjimu metabolizuoti cukrų arba palaikyti augimą terpėse su selektyviais priedais. Tokių tyrimų sąlygų standartizavimo sunkumai, taip pat natūralus fenotipinis kintamumas, būdingas daugeliui mikroorganizmų, gali būti klaidingo identifikavimo priežastis.

PGR naudojimas tiesioginei diagnostikai
ir patogenų identifikavimas
užkrečiamos ligos

Tais atvejais, kai auginimo metodų naudojimas yra problemiškas arba susijęs su nepakankamu diagnostikos efektyvumu, galimybė biologinę amplifikaciją (t. y. auginimą dirbtinėje terpėje) pakeisti fermentiniu nukleorūgščių padvigubėjimu. in vitro su PGR naudojimas yra ypač patrauklus. Egzistuoti skirtingus požiūrius PGR naudojimas infekcinių ligų sukėlėjams diagnozuoti. Labiausiai paplitęs PGR tipas (specifinis PGR) apima papildančių pradmenų naudojimą specifinė seka DNR būdinga griežtai apibrėžtam mikroorganizmų tipui. Pavyzdžiui, specifinio geno regiono, koduojančio pagrindinį išorinės membranos baltymą (MOMP), PGR amplifikacija. Chlamydia trachomatis, kartu su neradioaktyvia hibridizacija, skirta reakcijos produktams nustatyti, leidžia tirtuose mėginiuose aptikti pavienes chlamidijų DNR kopijas. Tuo pačiu metu PGR yra žymiai pranašesnis diagnostikos efektyvumu nei auginimas ir tiesioginio chlamidijų antigeno nustatymo metodai (mikroimunofluorescencinis ir fermentinis imunologinis tyrimas), tradiciškai naudojami C. trachomatis.

Taip pat yra galimybė viename reakcijos mėgintuvėlyje vienu metu naudoti kelias rūšiai būdingų pradmenų poras, kad vienu metu būtų galima amplifikuoti įvairių patogenų DNR. Ši modifikacija vadinama daugybine PGR. (daugybinis PGR). Norint nustatyti įvairių mikroorganizmų, sukeliančių tam tikras ligas, etiologinį vaidmenį, galima naudoti kelis PGR. Pavyzdžiui, kelių PGR naudojimo galimybės vienu metu aptikti du (C. trachomatis ir N. gonorrhoeae sergant urogenitalinio trakto ligomis) ar net keturiais patogenais (I. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis ir A. otitidis su lėtiniu pūlingu otitu).

Alternatyvus PGR diagnostikos metodas siejamas su universalių pradmenų, leidžiančių amplifikuoti genų fragmentus, esančius visuose tam tikros taksonominės grupės mikroorganizmuose, naudojimu. Šiuo metodu identifikuojamų rūšių skaičius gali būti apribotas tiek mažų sisteminių grupių (genties, šeimos), tiek didelių taksonų sistemos, klasės, tipo lygmeniu. Pastaruoju atveju PGR taikinys dažniausiai yra ribosomų genai (16S ir 23S rRNR), kurių struktūra įvairiuose prokariotiniuose mikroorganizmuose yra panaši.

Naudojant pradmenis, papildančius konservuotas šių genų sritis, galima amplifikuoti daugumos bakterijų rūšių DNR. Gauti PGR ribosomų geno fragmentai gali būti analizuojami naudojant įvairius laboratorinius metodus, siekiant nustatyti bakterijas, kurioms jie priklauso. Tiksliausias „molekulinio“ identifikavimo metodas – nustatyti pilną amplifikuotos DNR nukleotidų seką (seką) ir palyginti ją su atitinkamomis žinomų rūšių sekomis.

Nepaisant to, kad yra automatizuotų sistemų, kurios naudoja aprašytą identifikavimo principą, praktikoje dažniausiai naudojami mažiau laiko reikalaujantys ir brangūs metodai, kurie vis dėlto leidžia patikimai aptikti tam tikrus DNR fragmentų sekos skirtumus. Labiausiai paplitę yra metodai, pagrįsti skilimo vietų vietos DNR analize restrikcijos fermentais (RFLP metodas - restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmas), arba dėl vienos grandinės DNR elektroforetinio mobilumo nustatymo (SSCP metodas vienos grandinės konformacinis polimorfizmas).

PGR naudojant universalius pradmenis gali būti naudojamas tiek mikroorganizmams, išskirtiems grynoje kultūroje, tiek tiesiogiai diagnozuoti įvairius patogenus tiesiogiai klinikiniuose mėginiuose. Tačiau reikia pažymėti, kad „plataus spektro“ PGR jautrumas paprastai yra mažesnis nei „specifinių“ bandymų sistemų jautrumas. Be to, PGR su universaliais pradmenimis paprastai nenaudojamas tiriant mėginius, kuriuose gali būti daug skirtingų mikroorganizmų, nes sunku analizuoti reakcijos produktus, gautus amplifikuojant skirtingų rūšių DNR.

Molekulinio tipavimo metodai
mikroorganizmai, pagrįsti PGR

PGR plačiai taikomas ne tik diagnostikai ir identifikavimui, bet ir porūšių tipavimui bei izoliuotų mikroorganizmų padermių genetinio ryšio (kloniškumo) analizei, ypač atliekant epidemiologinius tyrimus. Lyginant su tradiciniais fenotipų nustatymo metodais (bio-, fagų ir serotipų nustatymas), PGR pagrįstas genotipų nustatymas pasižymi universalumu, gilesniu diferenciacijos lygiu, galimybe naudoti kiekybinius metodus padermių tapatumui įvertinti ir dideliu atkuriamumu. Buvo aprašyta daug genotipų nustatymo metodų, kurie gali būti laikomi PGR technologijos dariniais.

Nepaisant PGR tipavimo metodų įvairovės, daugumai jų įprasta naudoti gelio elektroforezę, siekiant atskirti skirtingo ilgio DNR fragmentus, gautus iš kiekvienos atskiros padermės. Tuo pačiu metu lyginamoji atskirų elektroforezinių profilių analizė, atlikta vizualiai arba naudojant kompiuterį, leidžia įvertinti tiriamų padermių genetinio ryšio laipsnį.

PGR naudojimas vaistams aptikti
atsparumas mikroorganizmams

Pastaruoju metu PGR vis dažniau naudojamas tiriant įvairias patogeninių mikroorganizmų savybes, ypač siekiant nustatyti tam tikrų rūšių patogenų atsparumą tam tikriems vaistams. Paprastai PGR naudojimas mikroorganizmų jautrumui nustatyti tikslingas tik tais atvejais, kai tradiciniai fenotipiniai metodai netaikomi arba nėra pakankamai veiksmingi. Pavyzdžiui, jautrumo apibrėžimas Mycobacterium tuberculosis iki tuberkuliozės vaistų, naudojant kultivavimo metodus, paprastai trunka 4–8 savaites. Be to, fenotipinių tyrimų rezultatai tokiais atvejais gali būti iškreipti dėl antimikrobinių medžiagų aktyvumo sumažėjimo ilgai auginant mikroorganizmus. Atsparumo vaistams molekulinių mechanizmų tyrimas M. tuberculosis ir kai kurie kiti patogenai leido sukurti PGR pagrįstus metodus greitam atsparumo genetinių žymenų aptikimui.

Tokiai analizei dažniausiai naudojama grynoje kultūroje išskirto patogeno DNR arba RNR. Tačiau kai kuriais atvejais yra galimybė atlikti tiesioginę PGR analizę dėl atsparumo antibiotikams iš anksto neauginant patogeno. Ištirtas klinikinės medžiagos mėginys naudojamas kaip tikslinės DNR šaltinis PGR, o nukopijuotas PGR produktas analizuojamas, siekiant nustatyti mutacijas, susijusias su atsparumu antibiotikams. Pavyzdžiui, buvo sukurtas metodas, leidžiantis naudojant PGR nustatyti tuberkulioziniu meningitu sergančių pacientų patogeno atsparumą rifampicinui.

Tačiau yra natūralių genetinių metodų naudojimo apribojimų, skirtų įvertinti mikroorganizmų atsparumą vaistams:

Duomenų apie specifinius genetinius atsparumo mechanizmus gali nebūti;

Atsparumas tam tikriems vaistams dažnai siejamas su skirtingais mechanizmais ir skirtingų genų mutacijomis, kurios nepriklausomai įtakoja fenotipą.

Pavyzdžiui, gramneigiamų bakterijų atsparumą aminoglikozidų grupės antibiotikams gali sukelti įvairių aminoglikozidus modifikuojančių fermentų gamyba arba ląstelės sienelės pralaidumo pokyčiai. Šiuo atveju PGR analizės rezultatai, kurie visada apibūdina griežtai apibrėžtą specifinę DNR sritį, negali būti pagrindu vertinant viso mikroorganizmo jautrumą.

Be to, tarptautinių standartų ir rekomendacijų dėl PGR naudojimo jautrumui antimikrobinėms medžiagoms nustatyti nebuvimas yra papildomas veiksnys, ribojantis platų šio metodo taikymą praktinėje diagnostikoje.

PGR analizė yra modernus ir labai tikslus diagnostikos metodas, leidžiantis nustatyti infekcijos sukėlėją, nepriklausomai nuo patologijos stadijos. Šiandien šis tyrimo metodas yra pripažintas patikimiausiu, nes jis neleidžia gauti klaidingų duomenų dėl didelio specifiškumo.

PGR metodo esmė

PGR analizė – polimerazės grandininė reakcija, leidžianti pakartotinai padidinti mikrobinės aplinkos tūrį ir nustatyti patogeną. PGR fenomeną XX amžiuje atrado amerikiečių mokslininkas Kary Mullisas, todėl tikslios diagnozės nustatymo laikas gerokai sutrumpėjo, todėl gydytojai pradėjo greičiau skirti tinkamas gydymo priemones.

PGR analizės esmė – padauginti patogeno DNR fragmentus, gautus iš paciento biologinių mėginių (šlapimo, kraujo, seilių ir kitų). Ši technika leidžia dirbtinėje aplinkoje specialių fermentų pagalba padidinti tam tikras genetinės medžiagos dalis, be to, tiriamų fragmentų skaičius išauga tiek, kad juos būtų galima apžiūrėti vizualiai.

Pažymėtina, kad PGR analizės metu nukopijuojami tik tam tikri regionai, kurie atlieka svarbų vaidmenį diagnozuojant. Jei paciento organizme jų yra nežymiai, tada ši analizė galės juos nustatyti.

PGR technika aktyviai naudojama medicinos praktikoje tiriant infekcines ir paveldimas ligas, nes ji ne tik padidina genetinės medžiagos kiekį (amplifikacija), bet ir leidžia sujungti atskirus DNR fragmentus ir įvesti mutacijas, kontroliuojančius susirūpinimą keliančius genus.

Ką atskleidžia PGR analizė?

PGR analizė plačiai naudojama įvairiose medicinos srityse. Žinoma, ji dažniausiai naudojama ginekologijoje ir urologijoje, tačiau technika aktuali ir pulmonologijos, ftiziologijos, gastroenterologijos, onkologijos ir kitose srityse.

PGR analizė leidžia nustatyti virusus įvairiose ligos stadijose, taip pat gali aptikti paslėptus ar „snaudžiančius“ mikroorganizmus, kurie nesukelia klinikinių požymių:

• įvairių tipų žmogaus papilomos virusas (ŽPV);
• Chlamidija;
• Trichomonas;
• Gonorėjos sukėlėjas;
• mikoplazmos;
• Ureaplazma;
• Gardnerella;
• Candida grybai;
• Tuberculosis mikrobakterijos;
• Hepatito A, B ir C virusai;
• helikobakterijos;
• herpeso virusai;
• citomegalovirusai (CMV);
• Epstein-Barr virusai.

PGR analizės privalumai

1. Didelis analizės tikslumas: rizika gauti klaidingai neigiamus rezultatus yra minimali;
2. Technikos specifika: PGR analizė leidžia išskirti konkretų infekcijos sukėlėją, jo tipą ir tipą;
3. Padidėjęs jautrumas: PGR analizė aptinka net kelis mikroorganizmo DNR fragmentus;
4. Galimybę tirti skirtingas organizmo biologines aplinkas;
5. Rezultatų gavimo greitis: juos galima gauti praėjus 4-5 valandoms po procedūros;
6. Galimybė aptikti kelis mikroorganizmus iš vieno biologinės medžiagos mėginio.

PGR analizę aktyviai taiko įvairių specialybių gydytojai, o kiti diagnostikos metodai nustumiami į antrą planą. Pažymėtina, kad ši procedūra leidžia nustatyti infekcijos nešiotojus ir latentines ligos formas, kuriose nėra klinikinės apraiškos, tačiau šie sukėlėjai neigiamai veikia bendrą organizmo būklę ir jo funkcionalumą, o pacientai kelia pavojų aplinkiniams.

PGR analizės paruošimas ir atlikimas

Mikroorganizmų DNR fragmentai randami skirtingose ​​paciento biologinėse aplinkose. Gydytojai patys nustato PGR analizės medžiagos paėmimo vietas, kurios priklauso nuo ligos tipo ir jos lokalizacijos. Jeigu kreiptasi į venerologą dėl lytiniu keliu plintančių infekcijų (LPI) nustatymo, tuomet bus tiriamos išskyros iš lytinių organų (tepinėlių ar įbrėžimų iš gimdos kaklelio, makšties) ir šlaplės, taip pat kraujas ir šlapimas.

Herpes infekcijos ir mononukleozė diagnozuojamos remiantis paciento burnos ertmės tepinėlių analize. CMV patvirtinama atlikus šlapimo tyrimą, cerebrospinalinis skystis. Pulmonologijos skyriuje paimami skrepliai ir turinys PGR analizei. pleuros ertmė. Nėščiosioms, įtarus intrauterines vaisiaus infekcijas, tiriami vaisiaus vandenys ir placentos audiniai.

Siekiant pašalinti klaidingų rezultatų galimybę ir padidinti PGR analizės tikslumą, prieš pateikiant biologinę medžiagą reikia laikytis paprastų rekomendacijų:

• Dauguma mikrobų išplaunami su šlapimu, todėl prieš imant tepinėlį iš šlaplės šlapintis nereikėtų;
• Per 3-5 dienas turėtumėte susilaikyti nuo lytinių santykių;
• PGR analizė neatliekama iš karto pasibaigus menstruacijoms, reikia palaukti 5-7 dienas;
• Likus 4 valandoms iki seilių donorystės būtina nutraukti vaistų ir maisto vartojimą, o prieš procedūrą rekomenduojama išskalauti burną vandeniu ir atlikti lengvą masažą skruostų srityje;
• Šlapimą reikia rinkti ryte į sterilų indą, kad medžiaga neužterštų, prieš imant jį nuplauti, moterims į makštį įkišti sterilų tamponą, o vyrams apyvarpės raukšlę ištraukti iki galo. kaip įmanoma;
• Likus dienai iki medžiagos pristatymo, turite susilaikyti nuo alkoholio, aštraus maisto ir karštų procedūrų (saunos, vonios ir kt.);
• Likus 2 savaitėms iki PGR analizės, būtina nutraukti antibakterinių medžiagų vartojimą;
• Nustokite vartoti likus savaitei iki tyrimo intymūs geliai, tepalai ir makšties žvakutės.

Tai gana paprastos taisyklės, tačiau jos padės gauti patikimiausius rezultatus ir sumažins diagnozės klaidų riziką.

PGR analizės iššifravimas

PGR tyrimo rezultatai gali būti teigiami arba neigiami. Neigiamas tyrimo rezultatas rodo, kad biologinėse medžiagose nėra infekcijos.

Teigiamas rezultatas patvirtina mikroorganizmų buvimą, tačiau norint tiksliai diagnozuoti, būtina informacija apie jų skaičių. Iš tiesų, mūsų organizme yra oportunistinių mikrobų, kurie tampa ligų priežastimis tik dėl aktyvaus augimo ir dauginimosi. Remdamasis kiekybiniais PGR analizės duomenimis, gydytojas gali nustatyti vystymosi stadiją patologinis procesas, jo veikla, pasirinkite konkretų vaistas ir jo dozavimas.

PGR analizė nėštumo metu

Nėštumas yra ypatingas laikotarpis kiekvienos moters gyvenime. Šiuo metu daugelis LPI ar latentinių infekcijų gali būti itin pavojingos kūdikiui ir sukelti priešlaikinį gimdymą, persileidimą, apsigimimus ir vystymosi anomalijas. Todėl PGR analizė atliekama visoms nėščiosioms planingai, daugiausia ankstyvos datos(iki 12 sav.), bet kartais skiriama ir 2 trimestrą.

Medžiaga paimama iš gimdos kaklelio kanalo ir šlaplės, procedūra neskausminga ir nekelia grėsmės. Daugeliu atvejų PGR analizė atliekama dėl chlamidijų, ureaplazmų, mikoplazmų, citomegaloviruso, herpeso ir ŽPV. Būtent šie mikroorganizmai kelia grėsmę nėštumo metu. Tačiau kartais moterims atliekama išsami PGR analizė, kuri apima daugelio mikroorganizmų (12 ar daugiau) tyrimą.

PGR (polimerazės grandininė reakcija) yra molekulinės biologijos pasiekimas, vienas pagrindinių XX amžiaus pabaigos ir XXI amžiaus pradžios klinikinės laboratorinės diagnostikos metodų, atnešantis didelė naudaįvairiose medicinos mokslo srityse.

Taigi, net jei tarp milijonų žmogaus kūno ląstelių prarandamas ne pats gyvas virusas, o tik jo DNR dalelė, PGR, jei niekas jai netrukdys, greičiausiai susidoros su užduotimi ir praneš apie „svetimo“ pasilikimas su teigiamu rezultatu. Tai yra PGR esmė ir pagrindinis jos pranašumas.

Privalumai ir trūkumai

PGR diagnostiką atliekančiai laboratorijai keliami aukščiausi reikalavimai įrangai, tyrimų sistemoms ir medicinos personalo kvalifikacijai. Tai aukštųjų technologijų laboratorija, turinti itin jautrių ir labai specifinių reagentų arsenalą, todėl neturi ypatingų trūkumų. Nebent tai duoda teigiamą rezultatą, kai nėra klinikinių apraiškų, ir taip klinicistui iškyla dilema: ar verta pradėti gydymą, ar ne?

Pacientą stebintis gydytojas pradeda abejoti tyrimo rezultatų patikimumu, nes nemato jokių ligos požymių. Tačiau vis dėlto, atsižvelgiant į didelį PGR sistemos jautrumą, reikia atsiminti, kad ji aptinka patogeną net ikiklinikinėje stadijoje, o teigiamas rezultatas šiuo atveju yra daugiau privalumas nei trūkumas. Remdamasis tuo, gydantis gydytojas turi pats nuspręsti dėl terapijos tinkamumo, atsižvelgdamas į kitus argumentus „už“ ir „prieš“.

Diagnostikos, naudojant polimerazės grandininę reakciją, pranašumai yra akivaizdūs:

• Didelis specifiškumas, pasiekiantis 100 %, nes pasirinktame mėginyje yra nukleorūgščių dalelių, būdingų konkrečiam organizmui, bet svetimų žmogui;
• Didelis našumas, nes PGR yra aukštųjų technologijų automatizuota technika, kuri suteikia galimybę atlikti tyrimus medžiagos mėginių ėmimo dieną ir taip išlaisvinti pacientą nuo nereikalingų rūpesčių;
• PGR, dirbant su vienu mėginiu, gali atlikti keletą tyrimų ir apie aptikti kelis patogenus jei ji turi tokią užduotį. Pavyzdžiui, diagnozuojant chlamidinę infekciją, kai PGR yra vienas pagrindinių metodų, kartu su chlamidijomis galima aptikti ir Neisseria (gonokoką) – sukėlėją. Be to, tai neturi neigiamos įtakos rezultatų patikimumui;
• PGR tyrimas yra pavojingas mikroorganizmas inkubacinis periodas kai jie dar nespėjo padaryti apčiuopiamos žalos kūnui, tai yra, ankstyva diagnostikaįspėja apie artėjantį patologinio proceso vystymąsi, o tai leidžia jam pasiruošti ir visiškai apsiginkluoti.

Be to, siekiant išvengti kartais diagnostikos metu iškylančių nesusipratimų, PGR apsisaugo ir tuo, kad jo rezultatus galima įrašyti (nuotrauka, kompiuteris), kad prireikus būtų galima panaudoti ekspertiniams tikslams.

PGR atsakymų norma laikoma neigiamu rezultatu., rodantis, kad nėra svetimų nukleorūgščių fragmentų, teigiamas atsakymas parodys, kad organizme yra infekcija, skaitmeninės reikšmės rodo viruso būklę ir jo koncentraciją tyrimo metu. Tačiau visą analizės nuorašą atlieka gydytojas, praėjęs specialų mokymą tema „PGR“. Bandymas interpretuoti rezultatus patiems nėra prasmės, nes gali būti, kad taip nutiks, neteisingai suprasti ir pradėti nerimauti iš anksto.

Kas yra PGR „bijo“, ką jis gali padaryti ir kaip jam pasiruošti?

Kaip ir atliekant bet kurį kitą tyrimą, kartais testo rezultatai būna klaidingai teigiami arba klaidingai neigiami kur PGR nėra išimtis. Tai gali atsitikti šiais atvejais:

1. Technologinio proceso pažeidimai viename iš reakcijos etapų;
2. Medžiagos surinkimo, saugojimo ar transportavimo taisyklių nesilaikymas;
3. Pašalinių priemaišų buvimas medžiagoje.

Tai rodo, kad PGR – infekcijų diagnozė turi būti vertinama atsargiai, kruopščiai ir tiksliai, kitaip medžiagos mėginiai gali pakeisti savo struktūrinę struktūrą ar net sugriūti.

PGR diagnostikos etapai. Klaidingi rezultatai gali sukelti pažeidimų bet kuriame tyrimo etape

Infekcijų PGR diagnostika tarp kitų laboratorinių metodų priskiriama „auksinių standartų“ kategorijai, todėl ją galima naudoti ieškant daugelio ligų, kurios iš pirmo žvilgsnio neturi nieko bendro, sukėlėjų:

• Tuberkuliozė skirtinga lokalizacija, pneumonija (įskaitant netipinę, sukeltą chlamidijų);
• Vaikų infekcijos (tymų raudonukė, parotitas, tymai);
• difterija;
• salmoneliozė;
• Zoonozinė infekcinė liga – listeriozė (liga pasižymi įvairiais simptomais, kai pažeidžiami limfmazgiai, centrinė nervų sistema, vidaus organai);
• Ligos, kurias sukelia Epstein-Barr viruso įsiskverbimas (infekcinė mononukleozė ir kt.);
• Onkologinė patologija, kurią išprovokavo papilomos viruso infekcija (ŽPV ir jos rūšys);
• boreliozė (Laimo liga, erkinis encefalitas);
• Helicobacter pylori infekcija, kurios sukėlėjas yra žmogaus skrandyje gyvenantis mikrobas Helicobacter pylori. Įrodyta, kad Helicobacter sukelia skrandžio ar dvylikapirštės žarnos vėžio vystymąsi;
• ir praktiškai viskas.

Lytiniu keliu plintančių infekcijų PGR diagnostika yra ypač svarbi, nes tokiu būdu sukeliamos ligos dažnai būna ilgas laikas atsiranda be jokių klinikinių apraiškų, tačiau nėštumo metu jie pradeda suaktyvėti ir taip kelti grėsmę kūdikio sveikatai ir net gyvybei. Ir elgiasi panašiai. Kai kurios iš jų („žibintuvėlis“) taip pat yra susijusios su LPI, todėl pastarąsias reikia apsvarstyti išsamiau. Su populiariausiais metodais skaitytojas galės susipažinti kitose straipsnio dalyse.

Kaip tinkamai pasiruošti, kad rezultatas būtų patikimas?

Iš karto pažymime, kad pasiruošimas PGR yra gana paprastas, nereikalaujantis ypatingų paciento pastangų. Jums tereikia atlikti tris paprastas užduotis:

1. Neturėti lytinių santykių 24 valandas prieš atliekant tyrimą;
2. Norėdami paimti ir analizuoti kraują iš venos, turite ateiti tuščiu skrandžiu, beje, jūs taip pat negalite gerti;
3. Šlapimą reikia išleisti naktį (ryte - steriliame indelyje, pirktame prieš dieną vaistinėje).

PGR gali veikti bet kurioje biologinėje aplinkoje

PGR metodas nėra „kraujo ištroškęs“, todėl priima bet kokią biologinę aplinką, kurioje yra įtariamas infekcijos sukėlėjas. pasirinkimas – ką reikia pasiimti tyrimams, lieka gydytojui.

Taigi, ieškant patogeno, be kraujo tyrimo (nors jis taip pat tinka ir daugeliu atvejų imamas lygiagrečiai su kita medžiaga), galite naudoti:

• (urogenitalinio trakto išskyros);
• Gleivių įbrėžimas burnos ertmė, junginės, nosiaryklės, lytinių takų (moterims jie paimami iš gimdos kaklelio ir makšties, vyrams – iš šlaplės);
• seilės;
• sperma;
• prostatos sultys;
• Placentos audiniai ir vaisiaus vandenys (amniono skystis);
• Šlapimo nuosėdos (po centrifugavimo), pavyzdžiui, tam tikroms LPI ir Mycobacterium tuberculosis aptikti;
• skrepliai ir pleuros skystis tam pačiam tikslui;
• eksudatai;
• Smegenų skystis įtarus infekcinį centrinės nervų sistemos pažeidimą;
• Biopsijos medžiaga (biopsija), paimta iš kepenų, dvylikapirštės žarnos, skrandžio ir kt.

Prie to, kas pasakyta, noriu pridurti, kad visais atvejais, net ir nuotrupuose bei išskyrose, medžiagos tyrimui užteks, kadangi PGR tyrimui atlikti nereikia didelių kiekių, analizei pakanka kelių mikrolitrų, kurie dažniausiai paimami į Eppendorf tipo mikrovamzdelį ir išsiųstas tirti.

Ligos ir PGR naudojimas

ŽIV ir polimerazės grandininė reakcija

Paprastai, praeinant anoniminį tyrimą, esant teigiamiems imunoblotingo rezultatams, diagnozė kartojama dar kartą. Jei diagnozė patvirtinama, pacientui skiriami papildomi tyrimai:

1. Imunologinėmis reakcijomis nustatomos absoliučios CD 4 limfocitų (imunokompetentingų ląstelių - T pagalbininkų arba pagalbininkų), kuriuos infekcija pirmiausia užkrečia, skaičiaus, po kurio jie praranda savo pagrindines savybes ir negali atskirti " savas“ ir „svetimas“. Jie paima kraujo plazmoje cirkuliuojančio viruso RNR normalios ląstelės organizmą ir į juos nereaguoti;
2. Viruso RNR aptikimas PGR metodu ir viruso dalelių koncentracijos apskaičiavimas, siekiant remiantis šiais duomenimis nustatyti patologinio proceso stadiją, sunkumą ir prognozę.. Žinoma, žodis „norma“ šiuo atžvilgiu neegzistuoja, nes reakcija visada yra teigiama, o skaitmeninių verčių dekodavimas priklauso gydytojo kompetencijai.

PGR ir hepatitas

PGR metodu galima aptikti patogenus, dažniausiai tyrimas naudojamas diagnozuojant hepatitą C, kuris kitais metodais aptinkamas menkai.

Hepatito C virusas (turintis RNR) savo elgesiu žmogaus organizme primena ŽIV. Įsišaknijęs į kepenų ląstelių (hepatocitų) genomą, jis lieka ten laukti sparnuose, kurie gali ateiti mažiausiai po 2 metų, mažiausiai po 20 metų, todėl gydytojai jį pavadino „švelniuoju žudiku“. Hepatitas C sukelia piktybinio proceso susidarymą kepenų parenchimoje, kuris pasireiškia vėlesnėse stadijose. Imuninė sistema nepastebi visų šių įvykių, painiodama virusą su hepatocitu. Tiesa, tam tikri kiekiai gaminami antikūnų prieš virusą, tačiau jie nesuteikia tinkamo imuninio atsako. Diagnozuojant hepatitą C, ELISA nėra labai informatyvus, nes rodo, kad virusas paliko pėdsakus, o ar pats pasiliko – nežinoma. Su HCV yra žinomi savaiminio išgydymo atvejai, o antikūnai prieš virusą išlieka ir cirkuliuoja visą gyvenimą (imunologinė atmintis). PGR pastebimai lenkia antikūnų susidarymą ir gali aptikti viruso dalelę jau po 1–1,5 savaitės, o antikūnai gali atsirasti nuo 2 mėnesių iki šešių mėnesių.

PGR diagnostika, įtarus, kad žmogaus organizme siaučia hepatito C virusas, yra optimaliausias tyrimo metodas, nes tik jis gali atpažinti „švelniojo priešo“ buvimą paciento kraujyje ar kepenų biopsijoje.

Tačiau kartais būna atvejų, kai AT būna teigiami, o PGR rezultatas – neigiamas. Taip kartais nutinka, kai viruso kiekis yra labai mažas arba kai jis neveikia kepenyse ir nepatenka į kraują. Tam, kad vis tiek būtų atrasta tiesa, pacientas analizuojamas iš naujo arba net ne vienas.

Papilomos viruso infekcija

Jei savaiminis išgydymas neįvyksta, jis taip pat gali, nepasirodydamas, ilgai išlikti šeimininko organizme, kuris to net neįtaria, nes nebuvo atlikta PGR ir nebuvo jokių ligos simptomų. Tačiau papilomos viruso infekcija, nors ir latentinė, toli gražu nėra abejinga žmonių sveikatai, nes kai kurios viruso rūšys sukelia onkologinės ligos(16, 18 tipai).

Dažniau pusė gyventojų kenčia nuo ŽPV, nes virusas labiau myli moterų lytinių organų sritį, o ypač gimdos kaklelį, kur kai kurių tipų virusai prisideda prie displazijos procesų vystymosi, o tada gimdos kaklelio vėžys, jei displazija nėra. gydomas ir virusas išsiskiria. Taigi, polimerazės grandininė reakcija aptiks viruso DNR ir tada nurodys moters organizme įsitvirtintą „blogąjį“ arba „gerąjį“ (onkogeninį ar neonkogeninį) tipą.

Kitos LPI ir TORCH infekcijos

Akivaizdu, kad polimerazės grandininė reakcija gali rasti bet kokią svetimą struktūrą, susidedančią iš nukleino rūgščių, todėl duotas testas tinka visų lytiniu keliu plintančių ligų ir TORCH infekcijų aptikimui, tačiau ne visada naudojamas. Kam, tarkime, atlikti tokius brangius tyrimus, kad aptiktų ar gonokoką, jei yra įperkamesnių ir pigesnių?

TORCH infekcijos ir LPI yra taip tarpusavyje susijusios, kad kartais sunku nustatyti, kuriai grupei reikėtų priskirti konkretų patogeną. Apskritai juos suprasti gali būti sunku, nes tai gana įvairios mikroorganizmų grupės, kurios visada gali būti lytiškai plintančios arba tik tam tikromis sąlygomis (imunodeficitas) ir gali būti įdomios tik nėštumo metu dėl galimo neigiamo poveikio. jos eiga ir vaisius.

PGR yra pagrindinis latentinių infekcijų nustatymo metodas

Klinikinių apraiškų vystymasis grindžiamas įvairiais patogenais, kuriuos galima rasti tik PGR, kuris yra pagrindinė jo užduotis, kartais kartu su ELISA, o kartais kaip vienintelis patvirtinantis tyrimas, ypač jei nėra ligos simptomų. Tokią sudėtingą situaciją gali sukurti polimikrobinė infekcija, kuri, be akivaizdžių patogenų, apima ir oportunistinius patogenus.

Ureaplazma dažnai pastebima kartu su mikoplazma. Ir tai nėra atsitiktinumas. Šios rūšys, kaip ir chlamidijos, nėra nei virusai, nei bakterijos, jos gyvena ląstelių viduje ir priklauso LPI, nors jų yra Sveikas kūnas taip pat nėra neįprasta. Taigi, norint atskirti sveiką nešiotoją nuo sergančio, reikalingi specialūs metodai, kur PGR yra laikomas patikimiausiu, nes dėl šių mikroorganizmų sandaros ir elgesio ypatumų kiti tyrimai yra neveiksmingi.

Kalbant apie (1, 2 tipo) ir, taip pat priklausančius herpeso virusams (5 tipas), situacija čia taip pat dviprasmiška. Pasaulio gyventojų užsikrėtimo lygis artėja prie 100 proc., todėl šiuo atveju labai svarbus viruso identifikavimas ir jo dozės nustatymas, o tai ypač svarbu nėštumo metu, nes suaugusiam žmogui virusas, įsišaknijęs jo kūne. organizmas dažnai nesukelia jokių rūpesčių ir neduoda ligos požymių.

Todėl nereikėtų ignoruoti tokio gydytojo paskirto tyrimo, nes kai kuriais atvejais polimerazės grandininė reakcija yra privalomas ir būtinas laboratorinės diagnostikos metodas, galintis apsaugoti ne tik moterį, bet ir mažą, dar negimusį vyrą nuo rimtų komplikacijų.

Baigdamas norėčiau pažymėti, kad toks nuostabus metodas kaip PGR tarnauja žmonijai daugiau nei 30 metų. Tuo pačiu metu tyrimo užduotys neapsiriboja infekcinių ligų sukėlėjų paieška. Polimerazės grandininė reakcija, gimusi molekulinės biologijos dirvožemyje, yra neatsiejamai susijusi su genetika. sėkmingai naudojamas kriminalistikoje asmens tapatybei nustatyti, teismo medicinoje tėvystei nustatyti, veterinarijoje, jei gyvūnų klinika turi galimybę įsigyti brangios įrangos, taip pat kitose srityse (pramonėje, Žemdirbystė ir tt).

Vaizdo įrašas: PGR - esmė ir taikymas