Dobio Nobelovu nagradu.

Na početku primjene metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, u reakcijsku smjesu bilo je potrebno dodati DNA polimerazu, budući da se ona tijekom visoka temperatura potrebno za odvajanje lanaca spirale DNA. Postupak reakcije bio je relativno neučinkovit, zahtijevajući puno vremena i enzima. Godine 1986. metoda lančane reakcije polimerazom značajno je unaprijeđena. Predloženo je korištenje DNA polimeraza iz termofilnih bakterija. Ovi enzimi su se pokazali termostabilnima i mogli su izdržati mnoge reakcijske cikluse. Njihova uporaba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedna od prvih termostabilnih DNA polimeraza izolirana je iz bakterija Thermus aquaticus i imenovani Taq-polimeraza. Nedostatak ove polimeraze je što je vjerojatnost uvođenja pogrešnog nukleotida prilično velika, budući da ovom enzimu nedostaju mehanizmi za ispravljanje pogrešaka (3" → 5" egzonukleazna aktivnost). Polimeraze pfu i Pwo, izolirani iz arheja, imaju takav mehanizam, njihovom uporabom značajno se smanjuje broj mutacija u DNK, ali je brzina njihovog rada (procesivnost) manja od Taq. Trenutno koriste mješavine Taq i pfu kako bi se postigla visoka brzina polimerizacije i visoka preciznost kopiranje.

U vrijeme izuma metode, Cary Mullis je radio kao sintetički kemičar (sintetizirao je oligonukleotide, koji su zatim korišteni za otkrivanje točkastih mutacija hibridizacijom s genomskom DNK) u tvrtki Cetus Corporation, koja je patentirala PCR metodu. Godine 1992. Cetus je prodao prava na metodu i patent za korištenje Taq tvrtka za polimerazu Hoffman-La Roche za 300 milijuna dolara. Međutim, pokazalo se da Taq-polimerazu okarakterizirali su sovjetski biokemičari A. Kaledin, A. Slyusarenko i S. Gorodetsky 1980. godine, a također 4 godine prije ove sovjetske publikacije, odnosno 1976. godine, američki biokemičari Alice Chien, David B. Edgar i John M. Trela. S tim u vezi, tvrtka Promega (Promega) pokušala je na sudu prisiliti Roche da se odrekne ekskluzivnih prava na ovaj enzim. Američki patent za PCR metodu istekao je u ožujku 2005. godine.

Provođenje PCR-a

Metoda se temelji na opetovanom selektivnom kopiranju određenog dijela DNK uz pomoć enzima u umjetnim uvjetima (in vitro). U tom se slučaju kopira samo ono područje koje zadovoljava navedene uvjete i to samo ako je prisutno u uzorku koji se proučava. Za razliku od umnožavanja DNA u živim organizmima (replikacija), relativno kratki dijelovi DNA umnožavaju se pomoću PCR-a. U konvencionalnom PCR procesu, duljina repliciranih DNA regija nije veća od 3000 parova baza (3 kbp). Uz pomoć mješavine različitih polimeraza, uz korištenje aditiva i pod određenim uvjetima, duljina PCR fragmenta može doseći 20-40 tisuća parova baza. To je još uvijek puno manje od duljine kromosomske DNA eukariotske stanice. Na primjer, ljudski genom dugačak je otprilike 3 milijarde parova baza.

Komponente reakcije

Za PCR, u najjednostavnijem slučaju, potrebne su sljedeće komponente:

• DNK predložak, koji sadrži dio DNK koji treba umnožiti.
• Dva primera, komplementarni suprotnim krajevima različitih lanaca željenog fragmenta DNA.
• termostabilan DNA polimeraza je enzim koji katalizira polimerizaciju DNA. Polimeraza za korištenje u PCR-u mora ostati aktivna na visokoj temperaturi Dugo vrijeme, stoga se koriste enzimi izolirani iz termofila - Thermus aquaticus(Taq polimeraza), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeraza), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeraza) i drugi.
• Deoksiribonukleozidni trifosfati(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Mg 2+ ioni neophodni za rad polimeraze.
• puferska otopina, osiguravajući potrebne uvjete reakcije - pH, ionsku snagu otopine. Sadrži soli, goveđi serum albumin.

Kako bi se izbjeglo isparavanje reakcijske smjese, u epruvetu se dodaje ulje visokog vrelišta, poput vazelina. Ako se koristi cikler s grijanim poklopcem, to nije potrebno.

Dodatak pirofosfataze može povećati prinos PCR reakcije. Ovaj enzim katalizira hidrolizu pirofosfata, nusproizvoda dodavanja nukleotidnih trifosfata na rastući lanac DNA, u ortofosfat. Pirofosfat može inhibirati PCR reakciju.

Primeri

Specifičnost PCR-a temelji se na stvaranju komplementarnih kompleksa između šablona i početnica, kratkih sintetskih oligonukleotida dugih 18-30 baza. Svaki od početnica komplementaran je jednom od lanaca dvolančane matrice i ograničava početak i kraj amplificirane regije.

Nakon hibridizacije predloška s primerom (žarenje), potonji služi kao primer za DNA polimerazu u sintezi komplementarnog lanca predloška (vidi).

Najvažnija karakteristika primera je talište (Tm) kompleksa primer-matrica.

T m je temperatura pri kojoj polovica DNA šablona tvori kompleks s oligonukleotidnim početnim slojem. Prosječna formula za izračunavanje T m za kratki oligonukleotid (i za duge fragmente DNA), uzimajući u obzir koncentraciju K + iona i DMSO:

gdje je L broj nukleotida u početnici, K + je molarna koncentracija kalijevih iona, G+C je zbroj svih gvanina i citozina.

Ako su duljina i nukleotidni sastav početnice ili temperatura žarenja pogrešno odabrani, moguća je tvorba djelomično komplementarnih kompleksa s drugim regijama matrice DNA, što može dovesti do pojave nespecifičnih produkata. Gornja granica temperature taljenja ograničena je optimalnom temperaturom djelovanja polimeraze, čija aktivnost opada na temperaturama iznad 80 °C.

Prilikom odabira temeljnih premaza poželjno je pridržavati se sljedećih kriterija:

pojačalo

PCR se provodi u pojačivaču - uređaju koji osigurava periodično hlađenje i zagrijavanje epruveta, obično s točnošću od najmanje 0,1 ° C. Moderni cikleri omogućuju postavljanje složenih programa, uključujući mogućnost "vrućeg pokretanja", Touchdown PCR (vidi dolje) i naknadno skladištenje umnoženih molekula na 4 °C. Za PCR u stvarnom vremenu proizvode se uređaji opremljeni fluorescentnim detektorom. Instrumenti su također dostupni s automatskim poklopcem i odjeljkom za mikropločice, što im omogućuje integraciju u automatizirane sustave.

Napredak reakcije

Fotografija gela koji sadrži marker DNA (prvi i zadnji utor) i PCR produkte

Obično se tijekom PCR-a provodi 20-35 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze (slika 2).

Denaturacija

Predložak dvolančane DNA zagrijava se na 94-96°C (ili 98°C ako se koristi posebno termostabilna polimeraza) 0,5-2 minute kako bi se omogućilo odvajanje lanaca DNA. Ova faza se zove denaturacija jer su vodikove veze između dva lanca DNA prekinute. Ponekad, prije prvog ciklusa (prije dodavanja polimeraze), reakcijska smjesa se prethodno zagrijava 2-3 minute kako bi se potpuno denaturirala šablona i primeri. Takav pristup tzv vrući početak, omogućuje smanjenje količine nespecifičnih produkata reakcije.

Žarenje

Kada su niti razdvojene, temperatura se snižava kako bi se primeri mogli vezati na jednolančani predložak. Ova faza se zove žarenje. Temperatura žarenja ovisi o sastavu temeljnih premaza i obično se bira jednaka temperaturi taljenja temeljnih premaza. Pogrešan izbor temperature žarenja dovodi ili do lošeg vezanja primera na šablonu (pri povišenoj temperaturi), ili do vezivanja na krivom mjestu i pojave nespecifičnih produkata (pri niskoj temperaturi). Vrijeme faze žarenja je 30 sekundi, u isto vrijeme, tijekom tog vremena polimeraza već ima vremena sintetizirati nekoliko stotina nukleotida. Stoga se preporuča odabir temeljnih premaza s talištem iznad 60 °C i provođenje žarenja i elongacije u isto vrijeme, na 60-72 °C.

Elongacija

DNA polimeraza replicira lanac predloška koristeći početnicu kao početnicu. Ovo je pozornica istezanje. Polimeraza započinje sintezu drugog lanca s 3" kraja početnice koji se vezao za predložak i kreće se duž predloška, ​​sintetizirajući novi lanac u smjeru od 5" do 3" kraja. 72 °C. Vrijeme elongacije ovisi o vrsti DNA polimeraze i duljini umnoženog fragmenta. Tipično, vrijeme elongacije je jedna minuta za svakih tisuću parova baza. Nakon svih ciklusa, često se provodi dodatni korak konačno produljenje dovršiti sve jednolančane fragmente. Ova faza traje 7-10 minuta.

Riža. 2: Shematski prikaz prvog PCR ciklusa. (1) Denaturacija na 94-96°C. (2) Žarenje na 68°C (na primjer). (3) Elongacija na 72°C (P=polimeraza). (4) Prvi ciklus je završen. Dva rezultirajuća DNK lanca služe kao predložak za sljedeći ciklus, tako da se količina DNK predloška udvostručuje tijekom svakog ciklusa.

Količina specifičnog produkta reakcije (ograničena početnicama) teoretski raste u odnosu na 2n - 2n, gdje je n broj reakcijskih ciklusa. U stvari, učinkovitost svakog ciklusa može biti manja od 100%, tako da je u stvarnosti P ~ (1+E) n, gdje je P količina proizvoda, E je prosječna učinkovitost ciklusa.

Broj "dugih" kopija DNK također raste, ali linearno, pa u produktima reakcije dominira određeni fragment.

Rast potrebnog proizvoda eksponencijalno je ograničen količinom reagensa, prisutnošću inhibitora i stvaranjem nusproizvoda. U posljednjim ciklusima reakcije rast se usporava, to se naziva "plato efekt".

Vrste PCR

• Ugniježđeni PCR(Nested PCR (eng.) ) - koristi se za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Upotrijebite dva para primera i provedite dvije uzastopne reakcije. Drugi par početnica pojačava regiju DNA unutar produkta prve reakcije.
• Invertirani PCR(Inverse PCR (engleski) ) - koristi se ako je poznato samo malo područje unutar željene sekvence. Ova metoda je posebno korisna kada je potrebno odrediti susjedne sekvence nakon umetanja DNK u genom. Za provedbu invertirane PCR provodi se niz rezova DNA s restrikcijskim enzimima, nakon čega slijedi povezivanje fragmenata (ligacija). Kao rezultat toga, poznati fragmenti nalaze se na oba kraja nepoznate regije, nakon čega se PCR može provesti kao i obično.
• reverzna transkripcija PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (engleski) ) - koristi se za pojačavanje, izolaciju ili identifikaciju poznate sekvence iz biblioteke RNA. Prije konvencionalne PCR, jednolančana molekula DNA se sintetizira na mRNA šabloni pomoću reversetaze i dobije se jednolančana cDNA, koja se koristi kao matrica za PCR. Ova metoda često određuje gdje i kada se ti geni izražavaju.
• Asimetrični PCR(Engleski) Asimetrični PCR) - provodi se kada je potrebno pojačati uglavnom jedan od lanaca izvorne DNA. Koristi se u nekim tehnikama analize sekvenciranja i hibridizacije. PCR se provodi kao i obično, osim što se jedan od početnica uzima u velikom višku. Modifikacije ove metode su engleske. L u uhu- A nakon- T on- E xponencijalni-PCR (LATE-PCR), koji koristi početnice s različitim koncentracijama, a početnica s niskom koncentracijom odabire se s višom (talištem) nego početnica s visokom koncentracijom. PCR se provodi na visokoj temperaturi žarenja, čime se održava učinkovitost reakcije tijekom svih ciklusa.
• Kvantitativni PCR(Kvantitativni PCR, Q-PCR) odn real time PCR- koristi se za izravno praćenje mjerenja količine specifičnog PCR produkta u svakom reakcijskom ciklusu. Ova metoda koristi fluorescentno obilježene početnice ili DNA sonde za točno mjerenje količine produkta reakcije dok se nakuplja; ili se koristi fluorescentna interkalirajuća boja Sybr Green I koji se veže za dvolančanu DNA. Sybr Green I pruža jednostavnu i ekonomičnu opciju za PCR detekciju u stvarnom vremenu i kvantifikaciju PCR proizvoda bez potrebe za specifičnim fluorescentnim probama ili primerima. Tijekom amplifikacije, boja SYBR Zelena I integrira u manji žlijeb DNA PCR proizvoda i emitira jači fluorescentni signal od nevezane boje kada se ozrači plavim laserom. SYBR Zelena I kompatibilan sa svim trenutno poznatim PCR instrumentima u stvarnom vremenu. Maksimalna apsorpcija za SYBR Zelena I je na valnoj duljini od 494 nm. Osim glavnog, postoje dva mala dodatna apsorpcijska maksimuma u spektru boje - na 290 nm i 380 nm. Maksimalna emisija za SYBR Zelena I je na valnoj duljini od 521 nm (zeleno).
• Korak PCR(Touchdown PCR (engleski) ) - korištenjem ovog pristupa smanjuje se utjecaj nespecifičnog vezanja početnica. Prvi ciklusi se izvode na temperaturi iznad optimalne temperature žarenja, zatim se svakih nekoliko ciklusa temperatura žarenja postupno smanjuje na optimalnu. Ovo je kako bi se osiguralo da početnica hibridizira s komplementarnom niti cijelom svojom duljinom; dok se na optimalnoj temperaturi žarenja početnica djelomično hibridizira s komplementarnom niti. Djelomična hibridizacija početnice na genomskoj DNA dovodi do nespecifične amplifikacije ako postoji dovoljno veznih mjesta za početnicu. U većini slučajeva, prvih deset PCR ciklusa može se provesti na temperaturi žarenja od 72-75°C, a zatim odmah spustiti na optimalnu, na primjer, na 60-65°C.
• Metoda molekularne kolonije(PCR u gelu) Kolonija-PCR kolonija) - polimerizira se akrilamidni gel sa svim PCR komponentama na površini i provodi se PCR. Na točkama koje sadrže analiziranu DNA dolazi do amplifikacije uz stvaranje molekularnih kolonija.
• PCR s brzim umnožavanjem krajeva cDNA(Engleski) Brza amplifikacija cDNA krajeva, RACE-PCR ).
• PCR dugih fragmenata(Engleski) PCR dugog dometa) - modifikacija PCR za umnožavanje proširenih segmenata DNA (10 tisuća ili više baza). Koristi se mješavina dviju polimeraza, od kojih je jedna Taq polimeraza visoke procesivnosti (to jest, sposobna sintetizirati dugi lanac DNA u jednom prolazu), a druga je DNA polimeraza s 3 "-5" eksonukleaznom aktivnošću, obično Pfu polimeraza. Druga polimeraza je neophodna kako bi se ispravile greške nastale prvom, budući da Taq polimeraza zaustavlja sintezu DNA ako je dodan nekomplementarni nukleotid. Ovaj nekomplementarni nukleotid uklanja Pfu polimeraza. Smjesa polimeraza se uzima u omjeru 50:1 ili čak manjem od 100:1, pri čemu se Taq polimeraza uzima 25-100 puta više u odnosu na Pfu polimerazu.
• RAPD(Engleski) Nasumična amplifikacija polimorfne DNA ), PCR s nasumičnim umnožavanjem polimorfne DNA - koristi se kada je potrebno razlikovati organizme slične u genetskom slijedu, na primjer, različite sorte kultivirane biljke, pasmina pasa ili blisko srodnih mikroorganizama. Ova metoda obično koristi jedan primer mala veličina(oko 10 bp). Ovaj primer će biti djelomično komplementaran nasumičnim DNK regijama organizama koji se proučavaju. Odabirom uvjeta (duljina primera, sastav primera, temperatura itd.) moguće je postići zadovoljavajuću razliku u PCR uzorku za dva organizma.
• Grupno specifična PCR(Engleski) grupno specifična PCR) - PCR za srodne sekvence unutar iste ili između različitih vrsta korištenjem konzervativnih početnica za te sekvence. Na primjer, izbor univerzalnih početnica za ribosomske 18S i 26S geni za umnažanje specifičnog za vrstu intergenskog razmaknice: sekvenca gena 18S i 26S je konzervativan između vrsta, tako da će se PCR između ovih gena odvijati za sve ispitivane vrste. Suprotno od ove metode je - jedinstveni PCR(Engleski) jedinstveni PCR), u kojem je zadatak odabrati početnice za pojačavanje samo specifične sekvence među srodnim sekvencama.
• PCR korištenjem vrućeg pokretanja(Engleski) Hot start PCR) - modifikacija PCR-a pomoću DNA polimeraze, u kojoj je aktivnost polimeraze blokirana na sobnoj temperaturi protutijelima ili malim molekulama koje oponašaju protutijela poput Affibodya, odnosno u vrijeme reakcije prije prve denaturacije u PCR-u. Obično se prva denaturacija provodi na 95°C tijekom 10 minuta.
• Virtualni PCR(eng. in silico PCR, digital PCR, electronic PCR, e-PCR) - matematička metoda za računalnu analizu teorijske lančane reakcije polimeraze pomoću popisa početnih sekvenci (ili DNA sondi) za predviđanje potencijalne amplifikacije DNA proučavanog genoma. , kromosoma, kružne DNK ili bilo kojeg drugog dijela DNK.

Ako je nukleotidni slijed predloška djelomično poznat ili uopće nije poznat, može se koristiti degenerirani početnici, čiji niz sadrži degenerirane pozicije, koje mogu sadržavati bilo koje baze. Na primjer, niz primera može biti: …ATH…, gdje je N - A, T ili C.

Primjena PCR-a

PCR se koristi u mnogim područjima za analizu iu znanstvenim eksperimentima.

Kriminalistika

PCR se koristi za usporedbu takozvanih "genetičkih otisaka". Potreban je uzorak genetskog materijala s mjesta zločina - krvi, sline, sperme, kose itd. Uspoređuje se s genetskim materijalom osumnjičenika. Dovoljna je vrlo mala količina DNK, teoretski – jedna kopija. DNK se reže na fragmente, zatim umnožava PCR-om. Fragmenti se odvajaju DNA elektroforezom. Dobivena slika rasporeda vrpci DNA naziva se genetski otisak prsta(Engleski) genetski otisak prsta).

Utvrđivanje očinstva

Riža. 3: Rezultati elektroforeze fragmenata DNA umnoženih PCR-om. (1) Otac. (2) Dijete. (3) Majka. Dijete je naslijedilo neke značajke genetskog otiska oba roditelja, što je dalo novi, jedinstveni otisak.

Iako su "genetski otisci prstiju" jedinstveni (osim u slučaju jednojajčanih blizanaca), obiteljske veze ipak se mogu uspostaviti izradom nekoliko takvih otisaka (slika 3). Ista se metoda može primijeniti, uz male modifikacije, za uspostavljanje evolucijskih odnosa među organizmima.

Medicinska dijagnostika

PCR omogućuje znatno ubrzanje i olakšavanje dijagnostike nasljednih i virusnih bolesti. Željeni gen se umnožava PCR-om pomoću odgovarajućih početnica, a zatim se sekvencira kako bi se odredile mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, tjednima ili mjesecima prije pojave simptoma bolesti.

Personalizirana medicina

Ponekad su lijekovi toksični ili alergeni za neke pacijente. Razlozi tome dijelom leže u individualnim razlikama u osjetljivosti i metabolizmu lijekova i njihovih derivata. Te su razlike određene na genetskoj razini. Na primjer, kod jednog pacijenta određeni citokrom (protein jetre odgovoran za metabolizam stranih tvari) može biti aktivniji, kod drugog - manje. Kako bi se utvrdilo kakvu vrstu citokroma ima određeni pacijent, predlaže se provesti PCR analizu prije uporabe lijeka. Ova analiza se naziva preliminarna genotipizacija. prospektivna genotipizacija).

Kloniranje gena

Kloniranje gena (ne brkati s kloniranjem organizama) je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacija genetskog inženjeringa, dobivanje velike količine produkta određenog gena. PCR se koristi za umnožavanje gena, koji se zatim umeće u vektor- fragment DNA koji prenosi strani gen u isti ili drugi organizam pogodan za uzgoj. Kao vektori koriste se, na primjer, plazmidi ili virusna DNA. Umetanje gena u strani organizam obično se koristi za dobivanje produkta tog gena - RNK ili, najčešće, proteina. Na taj način se dobivaju mnoge bjelančevine u industrijskim količinama za upotrebu u poljoprivredi, medicini itd.

Riža. četiri: Kloniranje gena pomoću plazmida.
(1) Kromosomska DNA organizma A. (2) PCR. (3) Višestruke kopije gena organizma A. (4) Umetanje gena u plazmid. (5) Plazmid s genom organizma A. (6) Uvođenje plazmida u organizam B. (7) Umnožavanje broja kopija gena organizma A u organizmu B.

Sekvenciranje DNA

U metodi sekvenciranja dideoksinukleotida obilježenih fluorescentnim ili radioaktivnim izotopom PCR je sastavni dio, budući da se upravo tijekom polimerizacije derivati ​​nukleotida obilježeni fluorescentnim ili radioaktivnim biljegom ugrađuju u lanac DNA. Dodavanje dideoksinukleotida sintetiziranom lancu prekida sintezu, omogućujući određivanje položaja specifičnih nukleotida nakon odvajanja u gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postao glavna metoda za provođenje mutageneze (uvođenje promjena u nukleotidnu sekvencu DNA). Primjena PCR-a omogućila je pojednostavljenje i ubrzanje postupka mutageneze, kao i njegovu pouzdanost i ponovljivost.

polimeraza lančana reakcija(PCR)

Bit PCR metode. DNA polimeraza

Lančana reakcija polimerazom je eksperimentalna metoda molekularne biologije koja omogućuje postizanje značajnog povećanja malih koncentracija određenih fragmenata nukleinskih kiselina u biološkom materijalu. Ovaj proces povećanja broja kopija DNK naziva se pojačanje. Kopiranje DNA tijekom PCR-a provodi se posebnim enzimom - polimeraza. DNA polimeraza (slika 3) je enzim uključen u replikaciju (pojačavanje DNA u živim organizmima) DNA. Enzimi ove klase kataliziraju polimerizaciju deoksiribonukleotida duž nukleotidnog lanca DNA, koje enzim "čita" i koristi kao predložak. Tip novog nukleotida određen je principom komplementarnosti s predloškom s kojeg se vrši očitavanje.

DNA polimeraza dodaje slobodne nukleotide na 3" kraj sastavljenog lanca. To dovodi do izduženja lanca u smjeru 5"-3. Nijedna od poznatih DNA polimeraza ne može stvoriti lanac "od nule": one su mogu samo dodati nukleotide već postojećoj 3"-hidroksilnoj skupini. Iz tog razloga DNA polimeraza treba početnica- kratki niz nukleotida (obično 20-25), komplementaran terminalnim dijelovima gena koji se proučava - kojemu je mogla dodati prvi nukleotid. Primeri se uvijek sastoje od DNA i RNA baza, pri čemu su prve dvije baze uvijek RNA baze. Primere sintetizira drugi enzim - primase. Drugi enzim je helikaza- neophodan za odmotavanje dvostruke spirale DNA uz stvaranje jednolančane strukture, koja osigurava replikaciju oba lanca u skladu s polukonzervativnim modelom replikacije DNA.

Neke DNA polimeraze također imaju sposobnost ispravljanja grešaka u novosastavljenom DNA lancu. Ako se otkrije pogrešan par nukleotida, DNA polimeraza se vraća jedan korak unatrag, uklanja pogrešan nukleotid iz lanca, zatim umeće ispravan na njegovo mjesto, nakon čega se replikacija nastavlja kao i obično.

Provođenje PCR-a

Lančana reakcija polimerazom (PCR) je metoda umnožavanja DNK kojom se može izolirati i umnožiti određena sekvenca DNK milijarde puta unutar nekoliko sati. Mogućnost dobivanja veliki iznos kopije jedne strogo definirane regije genoma uvelike pojednostavljuje proučavanje postojećeg uzorka DNK.

Za odvijanje lančane reakcije polimerazom moraju biti zadovoljeni brojni uvjeti. Za PCR, u najjednostavnijem slučaju, potrebne su sljedeće komponente:

Predložak DNK koji sadrži dio DNK koji treba umnožiti.

Dva primera komplementarna krajevima željenog fragmenta. (Par umjetno sintetiziranih oligonukleotida, obično veličine 15 do 30 bp, identičan odgovarajućim regijama ciljne DNA. Imaju ključnu ulogu u stvaranju produkata reakcije umnožavanja. Pravilno odabrani primeri osiguravaju specifičnost i osjetljivost testa sustav.)

Termostabilna DNA polimeraza. Polimeraza koja se koristi u PCR-u mora ostati aktivna na visokoj temperaturi dulje vrijeme, stoga se koriste enzimi izolirani iz termofila - Thermus aquaticus (Taq polimeraza) i drugi.

Deoksinukleotidni trifosfati (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Mg 2+ ioni neophodni za rad polimeraze.

Puferska otopina koja osigurava potrebne uvjete reakcije - pH, ionsku snagu otopine. Sadrži soli, serumski albumin.

Kako bi se izbjeglo isparavanje reakcijske smjese, u epruvetu se dodaje ulje visokog vrelišta, poput vazelina. Ako se koristi uređaj s grijanim poklopcem, to nije potrebno.

Dodatak pirofosfataze može povećati prinos PCR reakcije. Ovaj enzim katalizira hidrolizu pirofosfata, nusproizvoda dodavanja nukleotidnih trifosfata na rastući lanac DNA, u ortofosfat. Pirofosfat može inhibirati PCR reakciju.

Da bi se umnožio broj kopija izvorne DNK, potrebna je ciklička reakcija. U pravilu, svaki od sekvencijalno ponovljenih PCR ciklusa sastoji se od tri faze:

1. Denaturacija, odnosno "taljenje" DNK. Predložak dvolančane DNA zagrijava se na 94 - 96°C (ili 98°C ako se koristi posebno termostabilna polimeraza) 0,5 - 2 minute kako bi se omogućilo odvajanje lanaca DNA. Ovaj korak se naziva denaturacija jer se vodikove veze između dva lanca DNK prekidaju. Ponekad, prije prvog ciklusa (prije dodavanja polimeraze), reakcijska smjesa se prethodno zagrijava 2-5 minuta da se potpuno denaturiraju predložak i primeri. Ovaj pristup se zove vrući početak, omogućuje smanjenje količine nespecifičnih produkata reakcije.

2. Žarenje - vezanje početnica na DNA matrice. Nakon što se niti razdvoje, temperatura se polako snižava kako bi se primeri mogli vezati na jednolančani predložak. Temperatura žarenja ovisi o sastavu temeljnog premaza i obično se bira na 50–65°C. Vrijeme pozornice - 20 - 60 sekundi. Pogrešan izbor temperature žarenja dovodi ili do slabog vezanja primera na šablonu (pri povišenoj temperaturi) ili do vezanja na krivom mjestu i pojave nespecifičnih produkata (pri niskoj temperaturi).

3. Sinteza (produženje lanca). DNA polimeraza replicira lanac predloška koristeći početnicu kao "sjeme". Polimeraza započinje sintezu drugog lanca s 3" kraja početnice, koja se vezala za predložak i kreće se duž predloška. Temperatura elongacije ovisi o polimerazi. Često korištene Taq i Pfu polimeraze najaktivnije su na 72°C. °C duljina fragmenta koji se pojačava Tipično se uzima da je vrijeme elongacije jedna minuta za svakih tisuću parova baza Nakon što su svi ciklusi dovršeni, često se izvodi dodatni korak konačno produljenje dovršiti sve jednolančane fragmente. Ova faza traje 7 - 10 minuta.

Zatim se faze denaturacije, žarenja i elongacije ponavljaju mnogo puta (30 ili više puta). U svakom se ciklusu broj sintetiziranih kopija fragmenta DNA udvostručuje.

Sve reakcije se provode u epruvetama uronjenim u termostat. Promjena temperaturnog režima i njegovo održavanje provodi se automatski.

Da bismo točno razumjeli kako se tijekom PCR-a odvija amplifikacija određenog segmenta DNA, potrebno je jasno razumjeti položaj svih početnica i njihovih komplementarnih sekvenci u lancima koji se mogu amplificirati u svakoj rundi. U prvom krugu, svaki od novosintetiziranih lanaca mnogo je duži od udaljenosti od 3"-hidroksilne skupine svoje početnice do terminalnog nukleotida sekvence komplementarne drugoj početnici. Takvi se lanci nazivaju "dugi šabloni", to na njima će se odvijati daljnja sinteza.

U drugom krugu, dvolančana DNA, koja se sastoji od sličnih i novosintetiziranih (dugi predložak) lanaca, ponovno se denaturira i zatim žari s početnicama. Tijekom sinteze u ovom krugu ponovno se sintetiziraju "dugi predlošci", kao i određeni broj niti s početnicom na jednom kraju i sa sekvencom komplementarnom drugoj početnici na drugom ("kratki predlošci"). Tijekom trećeg kruga, svi heterodupleksi formirani ranije su istovremeno denaturirani i žareni s primerima, a zatim replicirani. U sljedećim krugovima sve je više "kratkih matrica", a do 30. kruga njihov je broj već 10 6 puta veći od broja početnih lanaca ili "dugih matrica".

Količina specifičnog produkta reakcije (ograničena početnicama) teoretski raste proporcionalno 2 n , gdje je n broj reakcijskih ciklusa. U stvari, učinkovitost svakog ciklusa može biti manja od 100%, tako da u stvarnosti:

gdje je P količina proizvoda, E je prosječna učinkovitost ciklusa.

Broj "dugih" kopija DNK također raste, ali linearno, pa u produktima reakcije dominira određeni fragment. Rast potrebnog proizvoda eksponencijalno je ograničen količinom reagensa, prisutnošću inhibitora i stvaranjem nusproizvoda.

PCR je vrlo osjetljiva metoda, stoga, ako postoji čak i beznačajna količina DNA u uzorku za testiranje koja je slučajno dospjela iz jedne reakcijske smjese u drugu, mogu se dobiti lažno pozitivni rezultati. Zbog toga je potrebno pažljivo kontrolirati sve otopine i pribor koji se koristi za PCR.

Osnovni principi odabira primera.

Prilikom izrade PCR test sustava, jedan od glavnih zadataka je pravilan odabir početnica koje moraju zadovoljiti niz kriterija:

1. Primeri moraju biti specifični. Posebna se pozornost posvećuje 3 "krajevima početnica, jer od njih Taq polimeraza počinje dovršavati komplementarni lanac DNA. Ako je njihova specifičnost nedovoljna, tada će se najvjerojatnije pojaviti neželjeni procesi u epruveti s reakcijskom smjesom , naime, sinteza nespecifične DNA (kratki ili dugi fragmenti). Vidljiva je na elektroforezi u obliku teških ili laganih dodatnih traka. To otežava procjenu rezultata reakcije, jer je lako zbuniti specifičnu produkt pojačanja sa sintetiziranom stranom DNA. Neki primeri i dNTP troše se za sintezu nespecifične DNA, što dovodi do značajnog gubitka osjeta.

2. Primeri ne bi trebali stvarati dimere i petlje, t.j. ne bi se smjele formirati stabilne dvostruke niti žarenjem primera međusobno ili međusobno.

Lančana reakcija polimerazom (PCR)- je metoda biokemijske tehnologije u molekularnoj biologiji, koja se provodi s ciljem povećanja jedne ili više kopija fragmenata DNA za nekoliko stupnjeva, što vam omogućuje stvaranje od nekoliko tisuća do milijuna kopija određene sekvence DNA.

Razvio 1983. godine Cary Mullis, PCR metoda je danas uobičajena i često nezamjenjiva metoda koja se koristi u medicinskim i biološkim istraživačkim laboratorijima za mnoge različite primjene. To uključuje kloniranje DNK za sekvenciranje, filogeniju temeljenu na DNK ili funkcionalnu analizu gena; dijagnoza nasljednih bolesti; identifikacija genetskih otisaka prstiju (koriste se u granama forenzičke znanosti i pri provođenju testova očinstva), kao i identifikacija i dijagnoza zarazne bolesti. Godine 1993. Mullis je zajedno s Michaelom Smithom dobio Nobelovu nagradu za kemiju za njihov rad na PCR-u.

Metoda se temelji na toplinskom ciklusu, koji se sastoji od ponovljenih ciklusa reakcija zagrijavanja i hlađenja za denaturaciju i replikaciju DNK pomoću enzima. Primeri, (kratki dijelovi DNK) koji sadrže sekvence koje su komplementarne ciljnom mjestu zajedno s DNK polimerazom (po kojoj je metoda dobila ime), su ključne komponente pokrenuti selektivnu i reamplifikaciju. U procesu PCR, sama sintetizirana DNA koristi se kao predložak za replikaciju, čime se pokreće lančana reakcija u kojoj se predložak DNA eksponencijalno umnožava. PCR se može značajno modificirati za izvođenje širok raspon genetske manipulacije.

Gotovo sve PCR aplikacije koriste termostabilnu DNA polimerazu kao što je Taq polimeraza, enzim izvorno izoliran iz bakterija. Termusaquaticus. Ova DNA polimeraza enzimatski sastavlja novi lanac DNA od građevnih blokova DNA - nukleotida, koristeći jednolančanu DNA kao predložak i DNA oligonukleotide (koji se nazivaju i DNA početnice) koji su potrebni za pokretanje sinteze DNA. Velika većina PCR metoda koristi termalni ciklus, tj. naizmjenično zagrijavanje i hlađenje PCR uzorka tijekom određenog niza temperaturnih koraka. Ovi koraci toplinskog ciklusa prvo su potrebni za fizičko odvajanje dvaju lanaca dvostruke spirale DNK na visokoj temperaturi u procesu koji se naziva denaturacija DNK. Na nižoj temperaturi, svaki lanac će se koristiti kao predložak u sintezi DNA pomoću DNA polimeraze kako bi se selektivno pojačala ciljna regija DNA. Selektivnost rezultata PCR-a upotrebom početnica koje su komplementarne ciljnoj regiji DNK za umnožavanje pod određenim uvjetima toplinskog ciklusa.

Principi PCR dijagnostike

PCR se koristi za umnožavanje specifičnog dijela lanca DNK (ciljane DNK). Većina PCR metoda obično pojačava fragmente DNA do ~10 000 parova baza (kb), iako neke metode dopuštaju povećanje veličine fragmenata do 40 kb. Reakcija proizvodi ograničenu količinu konačnog amplificiranog produkta, koji je kontroliran dostupnim reagensima u reakciji i povratnom inhibicijom produkata reakcije.

Osnovni PCR komplet zahtijeva nekoliko komponenti i reagensa. To uključuje:

• DNK predložak, koji sadrži ciljnu regiju DNA koju treba umnožiti.
• dva primera, komplementarni s 3' krajevima svakog od smislenih i antisense lanaca ciljne DNA.
• Taq polimeraza ili drugu DNA polimerazu koja radi na optimalnoj temperaturi od oko 70°C.
• Deoksinukleozidni trifosfati(dNTPs; trifosfatne skupine koje sadrže nukleotide), građevni blokovi iz kojih DNA polimeraza sintetizira novi DNA lanac.
• puferska otopina pružanje prikladnih kemijski uvjeti za optimalnu aktivnost i stabilnost DNA polimeraze.
• dvovalentni kationi, ioni magnezija ili mangana; Mg2+ se obično koristi, ali Mn2+ se također može koristiti za mutagenezu DNA posredovanu PCR-om, budući da veće koncentracije Mn2+ povećavaju stopu pogreške tijekom sinteze DNA.
• Jednovalentni kationi ioni kalija.

PCR se obično provodi u reakcijskom volumenu od 10-200 µl u malim reakcijskim epruvetama (volumena 0,2-0,5 ml) u termocikleru-pojačivaču. Cikler zagrijava i hladi reakcijske cijevi kako bi se postigle temperature potrebne za svaki korak reakcije. Mnogi moderni cikleri koriste Peltierov učinak, koji omogućuje zagrijavanje i hlađenje sklopa PCR cijevi jednostavnim mijenjanjem smjera električne struje. Reakcijske cijevi tankih stijenki potiču povoljnu toplinsku vodljivost kako bi se osigurala brza toplinska ravnoteža. Stariji cikleri koji nemaju grijani poklopac zahtijevaju sloj ulja na površini reakcijske smjese ili zrnca voska u bočici.

Redoslijed postupka

Tipično, PCR se sastoji od niza od 20-40 ponovljenih promjena temperature koje se nazivaju ciklusi, pri čemu se svaki ciklus obično sastoji od 2-3 diskretna temperaturna koraka, obično tri. Ciklusiranje često počinje i završava jednim temperaturnim korakom (tzv predviđanje) na visokoj temperaturi (> 90 °C) za konačnu ekspanziju proizvoda ili kratko skladištenje. Korištene temperature i trajanje njihove primjene u svakom ciklusu ovise o mnogim parametrima. To uključuje enzim koji se koristi za sintezu DNA, koncentraciju dvovalentnih iona i dNTP u reakciji i točku taljenja (Tm) početnica.

• Faza inicijalizacije: Ovaj korak sastoji se od zagrijavanja reakcije na temperaturu od 94-96°C (ili 98°C ako se koriste visoko toplinski stabilne polimeraze), koje se provodi 1-9 minuta. Korak je potreban samo za DNA polimeraze koje zahtijevaju toplinsku aktivaciju, takozvani hot start PCR.
• Korak denaturacije: To je prvi redoviti događaj toplinskog ciklusa i sastoji se od zagrijavanja reakcije na 94-98°C tijekom 20-30 sekundi. To uzrokuje cijepanje predloška DNA s razaranjem vodikovih veza između komplementarnih baza i stvaranjem jednolančanih molekula DNA.
• Korak žarenja: Reakcijska temperatura se smanji na 50-65°C tijekom 20-40 sekundi, što omogućuje vezivanje početnica na jednolančanu DNA šablonu. Tipično je temperatura žarenja oko 3-5 stupnjeva Celzijusa ispod Tm korištenih primera. Stabilne vodikove veze DNA-DNA nastaju samo kada sekvenca primera više odgovara šabloni sekvence. Polimeraza se veže na hibrid početnica i šablona i inicira sintezu DNA.
• Faza širenja/produženja: Temperatura tijekom ovog koraka ovisi o korištenoj DNA polimerazi; Taq polimeraza ima svoju optimalnu temperaturu aktivnosti na 75-80°C; za ovaj enzim obično se koristi temperatura od 72°C. U ovoj fazi, DNA polimeraza sintetizira novi DNA lanac komplementaran DNA šablonskom lancu dodavanjem dNTP-a koji su komplementarni s predloškom u smjeru od 5" do 3", povezujući 5"-fosfatnu skupinu dNTP-a s 3"-hidroksilnom skupinom. na kraju rezultirajuće (šireće) DNA. Vrijeme ekspanzije ovisi i o korištenoj DNA polimerazi i o duljini fragmenta DNA koji treba umnožiti. Tipično, na svojoj optimalnoj temperaturi, DNA polimeraza polimerizira tisuću baza u minuti. Pod optimalnim uvjetima, tj. u nedostatku ograničenja zbog ograničavajućih supstrata ili reagensa, u svakom koraku ekspanzije, količina ciljne DNA se udvostručuje, što rezultira eksponencijalnim (geometrijskim) umnožavanjem fragmenta DNA.
• Završno proširenje: Ovo je jedini korak, koji se ponekad izvodi na 70-74°C 5-15 minuta nakon posljednjeg PCR ciklusa, kako bi se osiguralo da se preostala jednolančana DNK u potpunosti produžila.
• Konačno očekivanje: Ovaj korak na 4-15 °C na neodređeno vrijeme može se koristiti kako bi reakcija bila kratka. Kako bi se provjerilo je li PCR sintetizirao očekivani fragment DNA (također se ponekad naziva "amplimer" ili "amplicon"), koristi se elektroforeza u agaroznom gelu za odvajanje PCR proizvoda po veličini. Veličina PCR proizvoda određena je usporedbom s DNA ljestvama (marker molekularne težine) koji sadrži DNA fragmente poznate veličine, a koja se izvodi na gelu zajedno s PCR produktima.

Faze lančane reakcije polimeraze

PCR proces se može podijeliti u tri koraka:

1. Eksponencijalno pojačanje: Tijekom svakog ciklusa, količina proizvoda se udvostručuje (pod pretpostavkom 100% učinkovitosti reakcije). Reakcija je vrlo osjetljiva: potrebna je samo mala količina DNK.
2. Faza izravnavanja: reakcija se usporava kako DNA polimeraza gubi aktivnost, a potrošnja reagensa kao što su dNTP i početnice uzrokuje njihovo ograničavanje .
3. Plato: Proizvod se više ne nakuplja zbog iscrpljivanja reagensa i enzima.

PCR optimizacija

U praksi PCR možda neće biti uspješan razni razlozi, posebice zbog svoje osjetljivosti na kontaminaciju, koja uzrokuje umnažanje nusproizvoda DNK. U tom smislu, razvijen je niz tehnika i postupaka za optimizaciju uvjeta PCR. Kontaminacija stranom DNK rješava se laboratorijskim protokolima i postupcima koji pročišćavaju mješavine prije PCR od potencijalnih kontaminanata DNK. To obično uključuje odvajanje PCR kompleta od područja analize ili pročišćavanja PCR proizvoda, korištenje jednokratnog plastičnog pribora i temeljito čišćenje radne površine između koraka reakcije. Tehnike dizajna primera igraju važnu ulogu u poboljšanju izolacije PCR produkata i u izbjegavanju stvaranja nusproizvoda, a upotreba alternativnih komponenti pufera ili enzima polimeraze može pomoći u amplificiranju dugih ili na drugi način problematičnih područja DNK. Dodavanje reagensa kao što je formamid puferskim sustavima može povećati specifičnost i oporavak PCR-a. Računalna simulacija teoretskih rezultata PCR-a (elektronički PCR) može se izvesti kao pomoć u dizajnu početnica.

Primjena PCR-a

Selektivna izolacija DNA

PCR omogućuje izolaciju fragmenata DNA iz genomske DNA selektivnim umnožavanjem specifične regije DNA. Ova primjena PCR-a nadopunjuje mnoge metode, kao što je stvaranje hibridizacijskih sondi za Southern ili Northern blotting i metode kloniranja DNA, koje zahtijevaju velike količine DNA koje predstavljaju određenu regiju DNA. PCR ovim metodama daje visok sadržaj čiste DNA, što omogućuje analizu uzoraka DNA, čak i s malom količinom početnog materijala.

Druge primjene PCR-a uključuju sekvenciranje DNA za identifikaciju nepoznatih sekvenci pojačanih PCR-om, u kojima se jedan od početnica za pojačanje može koristiti u Sanger sekvencioniranju, izolaciju sekvence DNA za ubrzavanje tehnologija rekombinantne DNA koje uključuju umetanje sekvence DNA u plazmid ili genetski materijal drugog organizma. Kolonije bakterija (E. coli) mogu se brzo pregledati PCR-om kako bi se ispravio vektorski dizajn DNK. PCR se također može koristiti za genetsko uzimanje otisaka; tehnika koja se koristi u sudskoj medicini za identifikaciju osobe ili organizma usporedbom eksperimentalne DNK korištenjem različitih PCR metoda.

Neke PCR metode "otiska prsta" imaju veliku diskriminatornu moć i mogu se koristiti za određivanje genetskih odnosa između pojedinaca, kao što su roditelj-dijete ili između braće i sestara, te se koriste u testiranju očinstva. Ova se tehnika također može primijeniti za određivanje evolucijskih odnosa između organizama.

Amplifikacija i kvantifikacija DNA

Budući da PCR povećava broj kopija ciljanih DNA regija, PCR se može koristiti za analizu vrlo malih količina uzorka. Ovo je često kritično za forenzičke istrage gdje su kao dokazi dostupni samo tragovi DNK. PCR se također može koristiti za analizu drevne DNK koja je stara nekoliko desetaka tisuća godina. Ove PCR metode uspješno su korištene na životinjama kao što je 40 000 godina star mamut, kao i na ljudskoj DNK, u primjenama koje variraju od analize egipatskih mumija do identifikacije ruskog cara.

Kvantitativne PCR metode procjenjuju količinu dane sekvence prisutne u uzorku, metoda koja se često koristi za kvantificiranje razine ekspresije gena. PCR u stvarnom vremenu je utvrđeni alat za kvantificiranje DNK koji mjeri nakupljanje DNK proizvoda nakon svakog ciklusa PCR amplifikacije.

PCR u dijagnostici bolesti

PCR omogućuje rana dijagnoza maligne bolesti, poput leukemije i limfoma, koji je trenutno vrlo razvijen u istraživanju raka i već se rutinski koristi. PCR se može provesti izravno na uzorcima genomske DNA za otkrivanje malignih stanica specifičnih za translokaciju s osjetljivošću koja je najmanje 10 000 puta veća od ostalih metoda.

PCR također omogućuje detekciju nekultiviranih ili sporo rastućih organizama kao što su mikobakterije, anaerobne bakterije i virusi iz kulture tkiva i životinjskih modela. Osnova PCR dijagnostičke primjene u području mikrobiologije je identifikacija uzročnika infekcije i razlikovanje nepatogenih sojeva od patogenih zbog specifičnih gena.

Virusna DNA također se može detektirati PCR-om. Početnice moraju biti specifične za ciljne DNK sekvence virusa, a PCR se može koristiti za dijagnostičke DNK testove ili sekvenciranje virusnog genoma. Visoka osjetljivost PCR-a omogućuje otkrivanje virusa ubrzo nakon infekcije, pa čak i prije početka bolesti. Ovo rano otkrivanje virusa moglo bi liječnicima dati značajne mogućnosti liječenja. Količina virusa ("viral load") u bolesnika također se može odrediti kvantitativnom PCR analizom DNA.

Varijacije osnovnih metoda lančane reakcije polimerazom

• Alel-specifična PCR: dijagnostička metoda ili metoda kloniranja temeljena na polimorfizmima jednog nukleotida (SNP) (razlike jedne baze u DNA). Zahtijeva prethodno poznavanje sekvence DNA, uključujući razlike između alela, i koristi početnice čiji 3' krajevi obuhvaćaju SNP-ove. Stroga PCR amplifikacija mnogo je manje učinkovita u prisutnosti nepodudarnosti između predloška i početnice, tako da je uspješna amplifikacija s SNP-specifičnim početni signali o prisutnosti specifičnih SNP-ova u sekvenci.
• PCR sklop ili sklop polimeraze (PCP): umjetna sinteza dugih sekvenci DNA pomoću PCR-a na skupu dugih oligonukleotida s kratkim preklapajućim segmentima. Oligonukleotidi se izmjenjuju između smislenih i antisense smjerova niti, a segmenti koji se preklapaju određuju redoslijed PCR fragmenata, čime se selektivno stvara konačni produkt duge DNK.
• Asimetrični PCR: preferirano pojačava jedan lanac DNA u dvolančanoj DNA šabloni. Koristi se u ispitivanju sekvenciranja i hibridizacije gdje je potrebno pojačanje samo jednog od dva komplementarna lanca. PCR se provodi kao i obično, ali s velikim viškom početnica za lanac namijenjen umnožavanju. Zbog spore (aritmetičke progresije) amplifikacije na kraju reakcije nakon upotrebe ograničavajućeg početnica, potrebni su dodatni PCR ciklusi. Najnovija modifikacija ovog procesa, poznata kao "LATE-PCR" (linearnost nakon eksponencijalne faze - PCR) koristi ograničavajući primer s višom talištem (Tm) od viška primera kako bi se održala učinkovitost reakcije, jer se koncentracija ograničavajućeg primera smanjuje. usred reakcije.
• Dial-out PCR: vrlo paralelna metoda za dobivanje preciznih molekula DNA za sintezu gena. Složeni skup molekula DNK modificiran je jedinstvenim bočnim oznakama u masivno paralelno sekvenciranje. Prajmeri usmjereni na oznaku zatim daju sekvencirane molekule pomoću PCR-a.
• Pojačanje ovisno o helikazi: sličan tradicionalnom PCR-u, ali zahtijeva konstantnu temperaturu nego ciklički ciklusi denaturacije i žarenja/ekspanzije. DNK helikaza, enzim koji odmotava DNK, koristi se umjesto toplinske denaturacije.
• Hot start PCR: Tehnika koja smanjuje nespecifično pojačanje tijekom početnog postavljanja PCR koraka. Može se obaviti ručno zagrijavanjem reakcijskih komponenti do temperature denaturacije (npr. 95 °C) prije dodavanja polimeraze. Razvijeni su specijalizirani enzimski sustavi koji inhibiraju aktivnost polimeraze na sobnoj temperaturi, bilo vezanjem protutijela ili u prisutnosti kovalentno vezanih inhibitora koji disociraju tek nakon koraka aktivacije na visokoj temperaturi. Vrući start/hladni završetak PCR-a postiže se novim hibridnim polimerazama koje su neaktivne na sobnoj temperaturi i trenutno se aktiviraju na temperaturi elongacije.
• Intermikrosatelitni sekvencijski specifični PCR (ISSR): PCR DNA metoda otiska prsta koja povećava broj kopija regija između jednostavnih sekvenci koje se ponavljaju kako bi se dobio jedinstveni otisak prsta iz duljine pojačanog fragmenta.
• Obrnuto PCRširoko se koristi za definiranje regija sekvenci oko genomskih umetaka. Uključuje niz cijepanja DNA i samoligacije, što rezultira poznatim sekvencama na oba kraja nepoznate sekvence.
• PCR posredovan ligacijom: Koristi male DNK poveznice povezane s DNK od interesa i nekoliko početnica povezanih s DNK poveznicama; koristi se za sekvenciranje DNK, hodanje genomom i DNK trag.
• PCR specifičan za metilaciju(MSP): Razvili su ga Stephen Bailin i Jim Herman na Medicinskom fakultetu Johns Hopkins, a koristi se za otkrivanje metilacije CpG otoka u genomskoj DNK. DNK se najprije tretira s natrijevim bisulfitom, koji pretvara nemetilirane citozinske baze u uracil, kojeg PCR početnice prepoznaju kao timin. Zatim se provode dva PCR-a na modificiranoj DNA korištenjem skupova identičnih početnica osim za bilo koji CpG otok unutar sekvence početnice. U tim točkama, jedan set početnica prepoznaje DNA s citozinima kako bi povećao broj kopija metilirane DNA, a jedan set prepoznaje DNA s uracilom ili timinom kako bi pojačao nemetiliranu DNA. MSP pomoću qPCR-a također se može provesti radi dobivanja kvantitativnih, a ne kvalitativnih informacija o metilaciji.
• Miniprimer - PCR: koriste se termostabilne polimeraze (S-Tbr), koje se mogu protezati od kratkih početnica ("smalligos"), s brojem od 9 ili 10 nukleotida. Ova tehnika omogućuje PCR-u da cilja regije povezane s manjim početnicama i koristi se za umnožavanje konzerviranih sekvenci DNA kao što je 16S (ili eukariotski 18S) rRNA gen.
• Amplifikacija sonde ovisna o multipleksnoj ligaciji (MLPA): omogućuje umnožavanje višestrukih ciljeva sa samo jednim parom početnica, čime se izbjegavaju ograničenja razlučivosti multipleksne PCR.
• Multiplex PCR sastoji se od nekoliko setova početnica u jednoj PCR smjesi kako bi se dobili amplikoni različitih veličina koji su specifični za različite sekvence DNA. Fokusiranjem na nekoliko gena u isto vrijeme, moguće je dobiti dodatne informacije tijekom jednog testa, koji bi inače zahtijevao nekoliko puta više reagensa i više vremena za dovršenje. Temperature žarenja za svaki set primera moraju biti optimizirane kako bi ispravno radile unutar jedne reakcije i s veličinama amplikona. To jest, njihova duljina para baza mora biti dovoljno različita da formiraju različite trake kada se vizualiziraju elektroforezom u gelu.
• Ugniježđeni PCR: povećava specifičnost amplifikacije DNA, smanjujući pozadinu zbog nespecifične amplifikacije DNA. Dva seta početnica koriste se u dva uzastopna PCR-a. U prvoj reakciji jedan par početnica koristi se za sintezu DNA produkata, koji se osim namjene još mogu sastojati od nespecifično umnoženih fragmenata DNA. Produkti se zatim koriste u drugom PCR-u sa skupom početnica čija su vezna mjesta potpuno ili djelomično različita od 3' krajeva svake od početnica korištenih u prvoj reakciji. Ugniježđeni PCR često je uspješniji u specifičnom pojačavanju dugih fragmenata DNA od tradicionalni PCR, ali zahtijeva detaljnije poznavanje ciljnih sekvenci.
• PCR s preklapajućim nastavcima ili spajanje s preklapajućim nastavcima(SOE): Tehnika genetskog inženjeringa koja se koristi za spajanje dva ili više dijelova DNK koji sadrže komplementarne sekvence. Koristi se za povezivanje dijelova DNK koji sadrže gene koji reguliraju sekvence ili mutacije; tehnika omogućuje stvaranje specifičnih i dugih DNA konstrukata.
• Kvantitativni PCR (QPCR): koristi se za mjerenje količine PCR produkta (obično u stvarnom vremenu). Kvantificira početne količine DNA, cDNA ili RNA. qPCR se široko koristi za određivanje prisutnosti sekvence DNK u uzorku i broja njezinih kopija u uzorku. Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu ima vrlo visok stupanj točnosti. Metode QRT-PCR (ili QF-PCR) koriste fluorescentne boje kao što su Sybr Green, EvaGreen ili DNA sonde koje sadrže fluorofore kao što je TaqMan za mjerenje količine umnoženog produkta u stvarnom vremenu. Ponekad se naziva RT-PCR (PCR u stvarnom vremenu) ili RQ-PCR. QRT-PCR ili RTQ-PCR prikladnije su kratice budući da se RT-PCR obično odnosi na PCR s obrnutom transkripcijom koji se često koristi u kombinaciji s qPCR-om.
• PCR obrnute transkripcije (RT-PCR): povećati broj kopija DNK iz RNK. Reverzna transkriptaza transkribira RNA u cDNA, koja se zatim umnožava PCR-om. RT-PCR se široko koristi u profiliranju ekspresije za otkrivanje ekspresije gena ili za određivanje sekvence RNA transkripta, uključujući mjesta početka i završetka transkripcije. Ako je poznata sekvenca genomske DNA gena, RT-PCR se može koristiti za mapiranje položaja egzona i introna u genu. 5' kraj gena (koji odgovara početnom mjestu transkripcije) obično se određuje pomoću RACE-PCR (brzo umnažanje cDNA krajeva).
• PCR čvrste faze: pokriva nekoliko značenja, uključujući "Polonia Amplification" (gdje se PCR kolonije izrađuju na gel matrici, na primjer), "Bridge PCR" (primeri su kovalentno vezani na čvrstu potpornu površinu), tradicionalni PCR na čvrstoj fazi (gdje "asimetrični PCR " koristi se u prisutnosti početnica koje nose krutu potporu sa sekvencom koja odgovara jednom od vodenih početnica) i poboljšane PCR krute faze (pri čemu se konvencionalna PCR krute faze može poboljšati upotrebom visokog Tm i ugniježđenih početnica krute potpore s mogućnost primjene toplinskog "koraka" za poticanje stvaranja temeljnih premaza uz čvrstu potporu).
• Termički asimetrični interleaved PCR (TAIL-PCR): koristi se za izolaciju nepoznate sekvence koja slijedi nakon poznate sekvence. U poznatom nizu, TAIL-PCR koristi ugniježđeni par primera s različitim temperaturama žarenja; degenerirani primer se koristi za pojačavanje u drugom smjeru od nepoznate sekvence.
• Touchdown PCR (Step PCR): PCR varijanta usmjerena na smanjenje nespecifične pozadine postupnim snižavanjem temperature žarenja kako PCR ciklusi napreduju. Temperatura žarenja u početnim ciklusima obično je nekoliko stupnjeva (3-5°C) iznad Tm korištenih primera, dok je u kasnijim ciklusima temperatura nekoliko stupnjeva (3-5°C) ispod Tm početnice. Više temperature daju veću specifičnost za vezanje primera i više niske temperature promiču učinkovitije pojačanje iz specifičnih proizvoda nastalih tijekom početnih ciklusa.
• PAN-AC: Koristi izotermne uvjete za pojačavanje i može se primijeniti na žive stanice.
• Univerzalna brza šetnja kroz genom: za hodanje po genomu i genetsko uzimanje otisaka koristeći specifičniji "dvostrani" PCR od tradicionalnih "jednostranih" pristupa (koristeći samo jedan genski specifičan primer i jedan zajednički primer - što može dovesti do umjetne "buke") zbog mehanizma , uključujući formiranje laso strukture. Pojednostavljeni derivati ​​UFW su "Lane RAGE" (laso ugniježđeni PCR za brzo umnožavanje krajeva genomske DNA), "5" RACE Lane" i "3" RACE Lane.
• UsilicoPCR(digitalni PCR, virtualni PCR, e-PCR, e-PCR) odnosi se na računalne alate koji se koriste za izračunavanje rezultata teorijske lančane reakcije polimeraze pomoću zadanog skupa početnica (sondi) za umnožavanje sekvenci DNK iz sekvenciranog genoma ili transkriptoma.

Povijest PCR-a

U članku u Journal of Molecular Biology iz 1971., Kleppe i njegovi suautori prvi su opisali metodu koja koristi enzimatsku analizu za repliciranje kratke DNK šablone s početnicama pod uvjetima iz epruvete. Međutim, ova rana manifestacija osnovnog principa PCR-a nije dobila mnogo pozornosti, a izum lančane reakcije polimeraze 1983. općenito se pripisuje Karyju Mullisu.

Kada je Mullis 1983. godine razvio PCR, radio je u Emeryvilleu u Kaliforniji za Cetus Corporation, ranu biotehnološku tvrtku. Tamo je bio odgovoran za sintezu kratkih lanaca DNK. Mullis je napisao da je osmislio PCR dok se jedne noći vozio autocestom duž pacifičke obale. Poigrao se u svom umu s novim načinom analiziranja promjena (mutacija) u DNK kada je shvatio da je umjesto toga izumio metodu za povećanje broja kopija bilo kojeg dijela DNK kroz ponovljene cikluse duplikacije uzrokovane DNK polimerazom. U časopisu Scientific American, Mullis je sažeo proceduru: “Počevši od jedne molekule DNK genetskog materijala, PCR može generirati 100 milijardi takvih molekula u jednom danu. Ovu reakciju je lako izvesti. Ne zahtijeva više od epruvete, nekoliko jednostavnih reagensa i izvora topline.” Dobio je Nobelovu nagradu za kemiju 1993. za svoj izum, sedam godina kasnije kada su on i njegovi kolege iz Cetusa prvi put proveli svoj prijedlog u praksi. Međutim, ostaju neke kontroverze o intelektualnom i praktičnom doprinosu drugih znanstvenika Mullisovom radu, te o tome je li on bio jedini izumitelj PCR principa.

Metoda PCR temelji se na upotrebi odgovarajuće DNA polimeraze koja može izdržati visoke temperature >90°C (194°F) potrebne za cijepanje dvaju lanaca DNA u dvostrukoj spirali DNA nakon svakog ciklusa replikacije. DNA polimeraze, izvorno korištene za in vitro pokuse, predodređene PCR-om, nisu mogle izdržati tako visoke temperature. Stoga su rani postupci replikacije DNA bili vrlo neučinkoviti i dugotrajni, te su zahtijevali velike količine DNA polimeraze i kontinuiranu obradu tijekom cijelog procesa.

Otkriće 1976. Taq polimeraze, DNA polimeraze izolirane iz termofilne bakterije, Termusaquaticus, koji prirodno živi u vrućim (50 do 80°C (122 do 176°F)) okruženjima kao što su topli izvori, otvorio je put dramatičnom poboljšanju PCR metode. DNA polimeraza izolirana iz T.Aquaticus, stabilan je na visokim temperaturama i ostaje aktivan čak i nakon denaturacije DNA, čime se eliminira potreba za dodavanjem novih DNA polimeraza nakon svakog ciklusa. To je omogućilo automatizaciju procesa umnožavanja DNK na temelju termalnog ciklera.

Patentni ratovi

Predloženu PCR metodu patentirao je Carey Mullis i zaslužna je za Cetus Corporation gdje je Mullis radio kada je izumio tehniku ​​1983. godine. Enzim Taq polimeraza također je zaštićen patentima. Bilo je nekoliko visokoprofilnih tužbi povezanih s metodologijom, uključujući neuspješnu tužbu koju je podnio DuPont. farmaceutska tvrtka Hoffmann-La Roche stekao je prava na patente 1992. godine i trenutno drži one koji su još uvijek zaštićeni.

Slična bitka za patent oko enzima Taq polimeraze još uvijek traje u nekim jurisdikcijama diljem svijeta između Rochea i Promege. Pravni argumenti nadilaze uvjete originalnih patenata za PCR i Taq polimerazu, koji su istekli 28. ožujka 2005.

Međutim, u to je vrijeme ova ideja ostala nezahtjevana. Lančanu reakciju polimeraze ponovno je otkrio Kary Mullis 1983. Njegov je cilj bio stvoriti metodu koja bi omogućila umnožavanje DNA tijekom višestrukih uzastopnih duplikacija izvorne molekule DNA pomoću enzima DNA polimeraze. 7 godina nakon objave ove ideje, 1993., Mullis je za nju dobio Nobelovu nagradu.

Na početku korištenja metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, DNA polimeraza je morala biti dodana u reakcijsku smjesu, jer je bila brzo inaktivirana na visokoj temperaturi potrebnoj za odvajanje lanaca DNA spirale. Postupak je bio vrlo neučinkovit, zahtijevao je puno vremena i enzima. Godine 1986. znatno je poboljšan. Predloženo je korištenje DNA polimeraza iz termofilnih bakterija. Ovi enzimi su se pokazali termostabilnima i mogli su izdržati mnoge reakcijske cikluse. Njihova uporaba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedna od prvih termostabilnih DNA polimeraza izolirana je iz bakterija Thermus aquaticus i imenovani Taq-polimeraza. Nedostatak ove polimeraze je što je vjerojatnost uvođenja pogrešnog nukleotida prilično velika, budući da ovom enzimu nedostaju mehanizmi za ispravljanje pogrešaka (3" → 5" egzonukleazna aktivnost). Polimeraze pfu i Pwo, izolirani iz arheja, imaju takav mehanizam, njihovom uporabom značajno se smanjuje broj mutacija u DNK, ali je brzina njihovog rada (procesivnost) manja od Taq. Trenutno koriste mješavine Taq i pfu kako bi se postigla visoka brzina polimerizacije i visoka točnost kopiranja.

U vrijeme izuma metode, Mullis je radio za tvrtku Cetus (en: Cetus Corporation), koja je patentirala PCR metodu. Godine 1992. Cetus je prodao prava na metodu i patent za korištenje Taq-kompanija za polimerazu Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) za 300 milijuna dolara. Međutim, pokazalo se da Taq-polimerazu okarakterizirao je ruski biokemičar Aleksej Kaledin 1980. godine, u vezi s čime je tvrtka Promega (Promega) sudskim putem pokušala prisiliti Roche da se odrekne ekskluzivnih prava na ovaj enzim. Američki patent za PCR metodu istekao je u ožujku 2005. godine.

Provođenje PCR-a

Metoda se temelji na višestrukom selektivnom kopiranju određene regije DNK uz pomoć enzima u umjetnim uvjetima ( in vitro). U tom se slučaju kopira samo ono područje koje zadovoljava navedene uvjete i to samo ako je prisutno u uzorku koji se proučava. Za razliku od umnožavanja DNA u živim organizmima (replikacija), relativno kratki dijelovi DNA umnožavaju se pomoću PCR-a. U konvencionalnom PCR procesu, duljina repliciranih DNA regija nije veća od 3000 parova baza (3 kbp). Uz pomoć mješavine različitih polimeraza, uz korištenje aditiva i pod određenim uvjetima, duljina PCR fragmenta može doseći 20-40 tisuća parova baza. To je još uvijek puno manje od duljine kromosomske DNA eukariotske stanice. Na primjer, ljudski genom dugačak je otprilike 3 milijarde parova baza.

Komponente reakcije

Za PCR, u najjednostavnijem slučaju, potrebne su sljedeće komponente:

• DNK predložak, koji sadrži dio DNK koji treba umnožiti.
• Dva primera, komplementarni suprotnim krajevima različitih lanaca željenog fragmenta DNA.
• termostabilan DNA polimeraza je enzim koji katalizira polimerizaciju DNA. Polimeraza za korištenje u PCR mora ostati aktivna na visokoj temperaturi dulje vrijeme, stoga se koriste enzimi izolirani iz termofila - Thermus aquaticus(Taq polimeraza), Pyrococcus furiosus(Pfu polimeraza), Pyrococcus woesei(Pwo-polimeraza) i drugi.
• Deoksinukleozidni trifosfati(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Mg 2+ ioni neophodni za rad polimeraze.
• puferska otopina, osiguravajući potrebne uvjete reakcije - pH, ionsku snagu otopine. Sadrži soli, goveđi serum albumin.

Kako bi se izbjeglo isparavanje reakcijske smjese, u epruvetu se dodaje ulje visokog vrelišta, poput vazelina. Ako se koristi cikler s grijanim poklopcem, to nije potrebno.

Dodatak pirofosfataze može povećati prinos PCR reakcije. Ovaj enzim katalizira hidrolizu pirofosfata, nusproizvoda dodavanja nukleotidnih trifosfata na rastući lanac DNA, u ortofosfat. Pirofosfat može inhibirati PCR reakciju.

Primeri

Specifičnost PCR-a temelji se na stvaranju komplementarnih kompleksa između šablona i početnica, kratkih sintetskih oligonukleotida dugih 18-30 baza. Svaki od početnica komplementaran je jednom od lanaca dvolančane matrice i ograničava početak i kraj amplificirane regije.

Nakon hibridizacije predloška s primerom (žarenje), potonji služi kao primer za DNA polimerazu u sintezi komplementarnog lanca predloška (vidi).

Najvažnija karakteristika primera je talište (Tm) kompleksa primer-matrica. T m je temperatura pri kojoj polovica DNA uzorka tvori kompleks s oligonukleotidnom početnicom. Talište se može približno odrediti formulom, gdje je n X broj X nukleotida u početnici. Ako su duljina i nukleotidni sastav početnice ili temperatura žarenja pogrešno odabrani, moguća je tvorba djelomično komplementarnih kompleksa s drugim regijama matrice DNA, što može dovesti do pojave nespecifičnih produkata. Gornja granica temperature taljenja ograničena je optimalnom temperaturom djelovanja polimeraze, čija aktivnost opada na temperaturama iznad 80 °C.

Prilikom odabira temeljnih premaza poželjno je pridržavati se sljedećih kriterija:

pojačalo

Riža. jedan: PCR cikler

PCR se provodi u pojačivaču - uređaju koji osigurava periodično hlađenje i zagrijavanje epruveta, obično s točnošću od najmanje 0,1 ° C. Moderni cikleri omogućuju postavljanje složenih programa, uključujući mogućnost "vrućeg pokretanja", Touchdown PCR (vidi dolje) i naknadno skladištenje umnoženih molekula na 4 °C. Za PCR u stvarnom vremenu proizvode se uređaji opremljeni fluorescentnim detektorom. Instrumenti su također dostupni s automatskim poklopcem i odjeljkom za mikropločice, što im omogućuje integraciju u automatizirane sustave.

Napredak reakcije

Fotografija gela koji sadrži marker DNA (1) i produkte PCR reakcije (2,3). Brojevi pokazuju duljinu fragmenata DNA u parovima nukleotida.

Tipično, kada se provodi PCR, provodi se 20-35 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze (slika 2).

Denaturacija

Predložak dvolančane DNA zagrijava se na 94-96°C (ili 98°C ako se koristi posebno termostabilna polimeraza) 0,5-2 minute kako bi se omogućilo odvajanje lanaca DNA. Ova faza se zove denaturacija jer su vodikove veze između dva lanca DNA prekinute. Ponekad se prije prvog ciklusa (prije dodavanja polimeraze) reakcijska smjesa prethodno zagrijava 2-5 minuta. za potpunu denaturaciju šablona i primera. Takav pristup tzv vrući početak, omogućuje smanjenje količine nespecifičnih produkata reakcije.

Žarenje

Kada su niti razdvojene, temperatura se snižava kako bi se primeri mogli vezati na jednolančani predložak. Ova faza se zove žarenje. Temperatura žarenja ovisi o sastavu temeljnih premaza i obično se bira 4-5°C ispod njihove točke tališta. Vrijeme faze - 0,5-2 min. Pogrešan izbor temperature žarenja dovodi ili do lošeg vezanja primera na šablonu (pri povišenoj temperaturi), ili do vezivanja na krivom mjestu i pojave nespecifičnih produkata (pri niskoj temperaturi).

Elongacija

Vrste PCR

• „Ugniježđeni“ PCR (Nested PCR (eng.)) – koristi se za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Upotrijebite dva para primera i provedite dvije uzastopne reakcije. Drugi par početnica pojačava regiju DNA unutar produkta prve reakcije.
• "Invertirani" PCR (Inverse PCR (eng.)) - koristi se ako je poznato samo malo područje unutar željene sekvence. Ova metoda je posebno korisna kada je potrebno odrediti susjedne sekvence nakon umetanja DNK u genom. Za provedbu invertirane PCR provodi se niz rezova DNA s restrikcijskim enzimima, nakon čega slijedi povezivanje fragmenata (ligacija). Kao rezultat toga, poznati fragmenti nalaze se na oba kraja nepoznate regije, nakon čega se PCR može provesti kao i obično.
• Reverzna transkripcija PCR (RT-PCR) koristi se za pojačavanje, izolaciju ili identifikaciju poznate sekvence iz biblioteke RNA. Prije konvencionalne PCR, jednolančana molekula DNA se sintetizira na mRNA šabloni pomoću reversetaze i dobije se jednolančana cDNA, koja se koristi kao matrica za PCR. Ova metoda često određuje gdje i kada se ti geni izražavaju.
• asimetrični PCR. Asimetrični PCR) - provodi se kada je potrebno pojačati uglavnom jedan od lanaca izvorne DNA. Koristi se u nekim tehnikama analize sekvenciranja i hibridizacije. PCR se provodi kao i obično, osim što se jedan od početnica uzima u velikom višku.
• Kvantitativni PCR (Q-PCR) koristi se za brzo mjerenje količine specifične DNA, cDNA ili RNA u uzorku.
• Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu - ova metoda koristi fluorescentno obilježene reagense za precizno mjerenje količine produkta reakcije kako se nakuplja.
• Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR(engleski) ) - ovom metodom smanjuje se utjecaj nespecifičnog vezanja početnica na stvaranje produkta. Prvi ciklusi se izvode na temperaturi iznad temperature žarenja, zatim se svakih nekoliko ciklusa temperatura smanjuje. Na određenoj temperaturi, sustav će proći kroz pojas optimalne specifičnosti primera za DNA.
• Metoda molekularne kolonije (PCR u gelu) Polony-PCR kolonija) - polimerizira se akrilamidni gel sa svim PCR komponentama na površini i provodi se PCR. Na točkama koje sadrže analiziranu DNA dolazi do amplifikacije uz stvaranje molekularnih kolonija.
• PCR s brzim umnožavanjem krajeva cDNA Brza amplifikacija cDNA krajeva, RACE-PCR )
• PCR dugih fragmenata PCR dugog dometa) - modifikacija PCR za umnožavanje proširenih segmenata DNA (10 tisuća baza ili više). Koriste se dvije polimeraze, od kojih je jedna Taq polimeraza visoke procesivnosti (tj. sposobna sintetizirati dugi lanac DNA u jednom prolazu), a druga je DNA polimeraza s 3'-5' endonukleaznom aktivnošću. Druga polimeraza je potrebna kako bi se ispravile pogreške nastale prvom.
• RAPD-PCR Nasumična amplifikacija polimorfne DNA PCR , PCR s nasumičnim umnožavanjem polimorfne DNA - koristi se kada je potrebno razlikovati organizme koji su bliski u genetskom slijedu, na primjer, različite sorte kultiviranih biljaka, pasmina pasa ili blisko srodnih mikroorganizama. Ova metoda obično koristi jedan mali primer (20-25 bp). Ovaj primer će biti djelomično komplementaran nasumičnim DNK regijama organizama koji se proučavaju. Odabirom uvjeta (duljina primera, sastav primera, temperatura itd.) moguće je postići zadovoljavajuću razliku u PCR uzorku za dva organizma.

Ako je nukleotidni slijed predloška djelomično poznat ili uopće nije poznat, može se koristiti degenerirani početnici, čiji niz sadrži degenerirane pozicije, koje mogu sadržavati bilo koje baze. Na primjer, niz primera može biti: ...ATH... gdje je H A, T ili C.

Primjena PCR-a

PCR se koristi u mnogim područjima za analizu iu znanstvenim eksperimentima.

Kriminalistika

PCR se koristi za usporedbu takozvanih "genetičkih otisaka". Potreban je uzorak genetskog materijala s mjesta zločina - krvi, sline, sperme, kose itd. Uspoređuje se s genetskim materijalom osumnjičenika. Dovoljna je vrlo mala količina DNK, teoretski – jedna kopija. DNK se reže na fragmente, zatim umnožava PCR-om. Fragmenti se odvajaju DNA elektroforezom. Dobivena slika rasporeda vrpci DNA naziva se genetski otisak prsta(Engleski) genetski otisak prsta).

Utvrđivanje očinstva

Riža. 3: Rezultati elektroforeze fragmenata DNA umnoženih PCR-om. (1) Otac. (2) Dijete. (3) Majka. Dijete je naslijedilo neke značajke genetskog otiska oba roditelja, što je dalo novi, jedinstveni otisak.

Iako su "genetski otisci prstiju" jedinstveni (osim u slučaju jednojajčanih blizanaca), obiteljske veze ipak se mogu uspostaviti izradom nekoliko takvih otisaka (slika 3). Ista se metoda može primijeniti, uz male modifikacije, za uspostavljanje evolucijskih odnosa među organizmima.

Medicinska dijagnostika

PCR omogućuje znatno ubrzanje i olakšavanje dijagnostike nasljednih i virusnih bolesti. Željeni gen se umnožava PCR-om pomoću odgovarajućih početnica, a zatim se sekvencira kako bi se odredile mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, tjednima ili mjesecima prije pojave simptoma bolesti.

Personalizirana medicina

Poznato je da većina lijekova ne djeluje na sve bolesnike kojima su namijenjeni, već samo na 30-70% njihovog broja. Osim toga, mnogi lijekovi su toksični ili alergeni za neke pacijente. Razlozi tome dijelom leže u individualnim razlikama u osjetljivosti i metabolizmu lijekova i njihovih derivata. Te su razlike određene na genetskoj razini. Na primjer, kod jednog pacijenta određeni citokrom (protein jetre odgovoran za metabolizam stranih tvari) može biti aktivniji, kod drugog - manje. Kako bi se utvrdilo kakvu vrstu citokroma ima određeni pacijent, predlaže se provesti PCR analizu prije uporabe lijeka. Ova analiza se naziva preliminarna genotipizacija. prospektivna genotipizacija).

Kloniranje gena

Kloniranje gena (ne brkati s kloniranjem organizama) je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacija genetskog inženjeringa, dobivanje velike količine produkta određenog gena. PCR se koristi za umnožavanje gena, koji se zatim umeće u vektor- fragment DNA koji prenosi strani gen u isti ili drugi organizam pogodan za uzgoj. Kao vektori koriste se, na primjer, plazmidi ili virusna DNA. Umetanje gena u strani organizam obično se koristi za dobivanje produkta tog gena - RNK ili, najčešće, proteina. Na taj način se dobivaju mnoge bjelančevine u industrijskim količinama za upotrebu u poljoprivredi, medicini itd.

Riža. četiri: Kloniranje gena pomoću plazmida. .
(1) Kromosomska DNA organizma A. (2) PCR. (3) Višestruke kopije gena organizma A. (4) Umetanje gena u plazmid. (5) Plazmid s genom organizma A. (6) Uvođenje plazmida u organizam B. (7) Umnožavanje broja kopija gena organizma A u organizmu B.

Sekvenciranje DNA

U metodi sekvencioniranja obilježenih fluorescentnom oznakom ili radioaktivnim izotopom dideoksinukleotida PCR je sastavni dio, budući da se tijekom polimerizacije derivati ​​nukleotida obilježeni fluorescentnom ili radioaktivnom oznakom umeću u lanac DNA. Ovo zaustavlja reakciju, omogućujući određivanje položaja specifičnih nukleotida nakon odvajanja sintetiziranih niti u gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postala glavna metoda mutageneze. Primjena PCR-a omogućila je pojednostavljenje i ubrzanje postupka mutageneze, kao i njegovu pouzdanost i ponovljivost.

Često se koristi kao brza metoda za indikaciju i identifikaciju virusa.

Ovu metodu prvi je razvio C. Mullis (SAD) 1983. godine. Zbog svoje visoke osjetljivosti, specifičnosti i jednostavnosti primjene, široko se koristi u genetici, sudskoj medicini, dijagnostici i drugim područjima.

Bit metode je amplifikacija, tj. povećanje broja kopija strogo definiranih fragmenata molekule DNA in vitro. U ovoj metodi djeluje matrični mehanizam i princip komplementarnosti. Dva jednostruka polinukleotidna lanca (nukleinske kiseline) sposobna su voditi vodikovu vezu u jedan dvolančani lanac ako se nukleotidne sekvence jednog točno podudaraju s nukleotidnim slijedom drugog tako da njihove dušične baze mogu tvoriti parove adenin-timin i gvanin-citozin.

PCR se temelji na amplifikaciji DNA pomoću termostabilne DNA polimeraze, koja sintetizira međusobno komplementarne DNA lance, počevši od dva početnica. Primer je dio DNK koji se sastoji od 20-30 nukleotida. Ovi prajmeri (primeri) su komplementarni suprotnim lancima DNA. Tijekom sinteze DNA, početnice se umeću u lanac novosintetiziranih molekula DNA.

Obično se PCR postavlja u 25-40 ciklusa. Svaki ciklus uključuje tri faze: prva je denaturacija na 92-95 °C. U ovom slučaju, dva lanca DNK se razilaze; drugi - žarenje ili dodavanje temeljnih premaza na 50-65 ° C; treći je elongacija, odnosno polimerizacija na 68-72 °C, dok DNA polimeraza provodi komplementarno dovršavanje DNA predloških lanaca pomoću četiri vrste nukleotida. Kao rezultat jednog ciklusa, željeni genetski materijal se udvostručuje. Niti DNK formirani u prvom ciklusu služe kao predlošci za drugi ciklus itd. Nakon prvog ciklusa samo se fragment između dva prajmera umnožava. Dakle, broj kopija amplificirane regije se udvostručuje, što omogućuje sintetiziranje milijuna (2 n) fragmenata DNA u 25-40 ciklusa - količina dovoljna da ih indicira različitim metodama (metodom hibridizacijskih sondi koje sadrže određena oznaka, elektroforeza itd.) . Češće se u tu svrhu koristi elektroforeza u agaroznom gelu s bojanjem etidijevim bromidom.

U PCR-u se koriste početnice iz dijelova DNA patogena, koji imaju jedinstvenu nukleotidnu sekvencu karakterističnu samo za određeni patogen.

Metoda postavljanja PCR-a je sljedeća: DNA šablona se izolira iz ispitivanog materijala; izolirana DNA se kombinira u epruveti sa smjesom za umnožavanje, koja uključuje DNA polimerazu, sva 4 tipa nukleotida, 2 tipa početnica, MgCl, pufer, deioniziranu vodu i mineralno ulje. Zatim se epruvete stavljaju u cikler, a amplifikacija se provodi u automatskom načinu rada prema zadanom programu koji odgovara vrsti patogena. Rezultati se češće bilježe elektroforezom u 1-2% agaroznom gelu u prisutnosti etidijevog bromida, koji se spaja s fragmentima DNA i detektira kao svjetleće trake kada se gel ozrači UV zrakama na transiluminatoru. Svi PCR postupci traju 1-2 radna dana.

Kako bi se povećala specifičnost i osjetljivost PCR-a, razne opcije: ugniježđeni PCR; PCR s "hot startom" pomoću parafinskog sloja ili blokadom aktivnih mjesta polimeraze s monoklonskim protutijelima. Osim toga, neke tvrtke proizvode liofilizirane kitove za umnožavanje DNA, koji mogu ubrzati PCR proces i smanjiti mogućnost lažno pozitivnih rezultata.

Trenutno se provodi nova tehnologija PCR-PCR u stvarnom vremenu (Real-Time PCR). Njegova temeljna značajka je praćenje i kvantitativna analiza nakupljanja produkata lančane reakcije polimeraze te automatska registracija i interpretacija dobivenih rezultata. Ova metoda ne zahtijeva korak elektroforeze, što smanjuje laboratorijske zahtjeve za PCR. PCR u stvarnom vremenu koristi fluorescentno obilježene oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK tijekom amplifikacije. PCR u stvarnom vremenu omogućuje kompletnu analizu uzorka unutar 20-60 minuta i teoretski način otkrivanja čak i jedne molekule DNA ili RNA u uzorku.

Sustav za detekciju proizvoda u lančanoj reakciji polimeraze u stvarnom vremenu (praćenje PCR-a) omogućuje vam praćenje nakupljanja umnožene DNK ciklus po ciklus. Sustav uključuje oligonukleotidnu sondu koja se može vezati (hibridizirati) na unutarnji segment ciljne DNA. Na 5' kraju sonda je obilježena fluorescentnom reporterskom bojom, a na 3' kraju blokatorom (gasiteljska boja). Kako se PCR produkt nakuplja, sonda se hibridizira s njim, ali ne dolazi do sjaja zbog blizine između reportera i blokera. Kao rezultat kopiranja sekvence, polimeraza dospijeva do 5' kraja sonde. Aktivnost 5'-3'-egzonukleaze polimeraze odvaja fluorescentnu oznaku s 3'-kraja sonde, oslobađajući tako fluorescentni reporter od njegovog vezanja na blokator signala, što dovodi do povećanja fluorescencije. Razina fluorescencije je stoga proporcionalna količini specifičnog produkta reakcije. Važno je da se rezultati PCR-a bilježe prisutnošću fluorescencije u zatvorenim epruvetama i time je riješen jedan od glavnih problema ove metode - problem kontaminacije amplikona.

Prednosti PCR-a: brza analiza; visoka osjetljivost i specifičnost; minimalna količina proučavanog materijala; jednostavnost implementacije i mogućnost potpune automatizacije.

Budući da PCR može biti jednako osjetljiv kao otkrivanje jedne kopije uzorka DNK, postoji visok rizik od lažno pozitivnih rezultata. Stoga, prilikom postavljanja PCR-a, genetski dijagnostički laboratorij mora postojano ispunjavati posebne zahtjeve za rasporedom i načinom rada.

PCR je jedna od komplementarnih metoda koje postoje u virološkoj dijagnostici. Ova reakcija je vrlo važna za dijagnozu virusnih infekcija kada se virusni antigeni ili virus-specifična antitijela ne mogu detektirati i kada prisutnost virusne nukleinske kiseline može biti jedini dokaz infekcije, posebno kod latentnih i miješanih infekcija.

Ako pronađete grešku, označite dio teksta i kliknite Ctrl+Enter.