Federalna agencija za obrazovanje

država obrazovna ustanova

Vrhovni strukovno obrazovanje

"Karelijska državna pedagoška akademija"

Tečajni rad na temu:

polimeraza lančana reakcija(PCR) i njegova primjena

Izvršila: studentica Koryagina Valeria Aleksandrovna

Provjerila: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Uvod

Poglavlje 1 Pregled literature

1.5.4 Efekt platoa

1.5.6 Pojačavanje

Zaključak

Uvod

Posljednjih dvadesetak godina obilježeno je raširenim uvođenjem molekularno-genetičkih metoda u biološke, medicinske i poljoprivredne znanosti.

Do ranih 1970-ih činilo se da je molekularna biologija dosegla određeni stupanj savršenstva. U tom su razdoblju mikroorganizmi bili glavni predmet molekularno-genetičkih istraživanja. Prijelaz na eukariote stavio je pred istraživače potpuno nove probleme koji se nisu mogli riješiti metodama genetske analize koje su postojale u to vrijeme. Proboj u razvoju molekularne genetike postao je moguć zahvaljujući pojavi novog eksperimentalnog alata - restrikcijskih endonukleaza. Sljedećih godina, broj izravnih metoda analize DNA temeljenih na kvalitativno drugačijim pristupima počeo je brzo rasti.

U mnogim slučajevima suvremene tehnologije omogućile su dublje proučavanje fine strukturne i funkcionalne organizacije nuklearnih i ekstranuklearnih genoma različitih organizama. To je bilo od posebne važnosti za razvoj novih metoda dijagnostike i liječenja raznih bolesti. Ne manje važna bila je i mogućnost korištenja dostignuća molekularne genetike u populacijskoj biologiji i oplemenjivanju za identifikaciju i analizu genetske varijabilnosti populacija, sorti i sojeva, identifikaciju i certificiranje ekonomski vrijednih jedinki, stvaranje genetski modificiranih organizama i rješavanje drugih problema.

Svaka metoda ima svoje prednosti i nedostatke. Ne postoji univerzalna metoda koja bi mogla riješiti sve probleme koji se pojave. Stoga je odabir određene metode za istraživanje koje je u tijeku jedna od najvažnijih faza svakog znanstvenog rada.

Poglavlje 1 Pregled literature

1.1 Povijest otkrića lančane reakcije polimerazom (PCR)

Godine 1983. K.B. Mullis i dr. objavili su i patentirali metodu lančane reakcije polimerazom (PCR), kojoj je suđeno da ima dubok utjecaj na sva područja istraživanja i primjene nukleinskih kiselina. Značenje ove metode za molekularnu biologiju i genetiku pokazalo se toliko velikim i očiglednim da je sedam godina kasnije autor dobio Nobelovu nagradu za kemiju.

Na početku primjene metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, u reakcijsku smjesu morala se dodavati DNA polimeraza, budući da je bila inaktivirana na visokoj temperaturi potrebnoj za odvajanje lanaca DNA spirale. Postupak reakcije bio je relativno neučinkovit, zahtijevajući puno vremena i enzima. Godine 1986. metoda lančane reakcije polimerazom značajno je unaprijeđena. Predloženo je korištenje DNA polimeraza iz termofilnih bakterija. Ovi enzimi su se pokazali termostabilnima i mogli su izdržati mnoge reakcijske cikluse. Njihova uporaba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedna od prvih termostabilnih DNA polimeraza izolirana je iz bakterija Thermus aquaticusi imenovani Taq-polimeraza.

Mogućnost umnožavanja bilo kojeg segmenta DNA čiji je slijed nukleotida poznat, te dobivanje istog nakon PCR-a u homogenom obliku i preparativnoj količini, čini PCR alternativnom metodom molekularnog kloniranja kratkih fragmenata DNA. U tom slučaju nema potrebe za primjenom složenih metodoloških tehnika koje se koriste u genetičkom inženjeringu u konvencionalnom kloniranju. Razvoj PCR metode uvelike je proširio metodološke mogućnosti molekularne genetike, a posebice genetskog inženjerstva, toliko da je radikalno promijenio i ojačao znanstveni potencijal mnogih njezinih područja.

1.2 Vrste lančane reakcije polimerazom (PCR)

· Ugniježđeni PCR- koristi se za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Upotrijebite dva para primera i provedite dvije uzastopne reakcije. Drugi par početnica pojačava regiju DNA unutar produkta prve reakcije.

· Invertirani PCR- koristi se kada je poznato samo malo područje unutar željenog niza. Ova metoda je posebno korisna kada je potrebno odrediti susjedne sekvence nakon umetanja DNK u genom. Za provedbu invertirane PCR provodi se serija rezova DNA - restrikcijskim enzimima<#"justify">početnica lančane reakcije polimeraze

· Grupno specifična PCR- PCR za rodbinu<#"center">1.3 Lančana reakcija polimerazom

Otkrivena sredinom 1980-ih, lančana reakcija polimerazom (PCR) može povećati broj kopija originalnog uzorka milijune puta unutar nekoliko sati. Tijekom svakog ciklusa reakcije iz originalne molekule nastaju dvije kopije. Svaka od sintetiziranih kopija DNK može poslužiti kao predložak za sintezu novih kopija DNK u sljedećem ciklusu. Dakle, opetovano ponavljanje ciklusa dovodi do eksponencijalnog povećanja broja kopija. Iz izračuna proizlazi da čak i ako postoji 30 ciklusa, broj kopija originalne molekule bit će veći od 1 milijarde. Čak i ako uzmemo u obzir da se svi amplikoni ne dupliciraju tijekom svakog ciklusa, ukupan broj kopija, unatoč tome, prilično je velika brojka.

Svaki ciklus lančane reakcije polimerazom (PCR) sastoji se od sljedećih koraka:

· Denaturacija - Povećanje temperature uzrokuje odmotavanje dvolančane molekule DNA i cijepanje na dvije jednolančane;

· Žarenje - Snižavanje temperature omogućuje pričvršćivanje početnica na komplementarne regije molekule DNA;

· Elongacija – enzim DNA polimeraza dovršava komplementarni lanac.

Za amplifikaciju odabranog fragmenta koriste se dva oligonukleotidna početnica (seeds) koja flankiraju određenu regiju DNA. Primeri usmjereni 3 - završavaju jedan prema drugom i u smjeru niza koji treba pojačati. DNA polimeraza provodi sintezu (dovršavanje) međusobno komplementarnih lanaca DNA, počevši od početnica. Tijekom sinteze DNA, početnice se fizički umeću u lanac novosintetiziranih molekula DNA. Svaki lanac molekule DNA formiran korištenjem jednog od početnica može poslužiti kao predložak za sintezu komplementarnog lanca DNA korištenjem drugog početnica.

1.4 Provođenje lančane reakcije polimerazom (PCR)

Lančana reakcija polimeraze provodi se u posebnim polipropilenskim epruvetama tankih stijenki, kompatibilnih veličine s korištenim termociklerom (pojačivačem) ​​- uređajem koji kontrolira temperaturne i vremenske karakteristike faza lančane reakcije polimeraze (PCR) .

1.5 Princip metode lančane reakcije polimerazom

Lančana reakcija polimerazom (PCR) in vitro je metoda umnožavanja DNK koja može izolirati i umnožiti specifičnu sekvencu DNK milijarde puta unutar nekoliko sati. Mogućnost dobivanja ogromnog broja kopija jedne strogo definirane regije genoma uvelike pojednostavljuje proučavanje postojećeg uzorka DNK.

Za izvođenje lančane reakcije polimerazom potrebno je ispuniti nekoliko uvjeta:

1.5.1 Prisutnost niza komponenata u reakcijskoj smjesi

Glavne komponente reakcijske (PCR) smjese su: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, mješavina nukleotid trifosfata (ATP, GTP, CTP, TTP), početnice (oligonukleotidi), analizirani DNA preparat, termostabilna DNA polimeraza. Svaka od komponenti reakcijske smjese izravno je uključena u lančanu reakciju polimeraze (PCR), a koncentracija reagensa izravno utječe na tijek amplifikacije.

· Tris-HCl - određuje pH reakcijske smjese, stvara puferski kapacitet. Aktivnost DNA polimeraze ovisi o pH medija, pa vrijednost pH izravno utječe na tijek lančane reakcije polimeraze. Obično je pH vrijednost u rasponu od 8 - 9,5. Visok pH je zbog činjenice da kako temperatura raste, pH Tril-HCl pufera pada.

· KCl - koncentracija kalijevog klorida do 50 mM utječe na tijek procesa denaturacije i žarenja, koncentracija iznad 50 mM inhibira DNA polimerazu.

· MgCl 2- jer je DNA polimeraza Mg 2+- ovisan enzim, tada koncentracija magnezijevih iona utječe na aktivnost enzima (Mg 2+tvori komplekse s NTP – upravo su ti kompleksi supstrat za polimerazu). Visoka koncentracija dovodi do povećanja nespecifične amplifikacije, a niska dovodi do inhibicije reakcije, optimalna (za različite polimeraze) je u području od 0,5 - 5 mM. Osim toga, koncentracija magnezijevih soli utječe na tijek procesa denaturacije i žarenja - povećanje koncentracije Mg 2+uzrokuje povećanje temperature taljenja DNA (tj. temperature pri kojoj se 50% dvolančanih DNA lanaca razbija u jednolančane).

· NTP - nukleotidni trifosfati su izravni monomeri nukleinskih kiselina. Kako bi se spriječio prekid lanca, preporučuje se jednaki omjer sva četiri nukleotidna trifosfata. Niska koncentracija ovih komponenti u reakcijskoj smjesi povećava vjerojatnost pogrešaka u konstrukciji komplementarnog DNA lanca.

· Primeri - Najoptimalnije je korištenje temeljnih premaza s razlikom tališta ne većom od 2 - 4 o C. Ponekad tijekom dugotrajnog skladištenja na temperaturi od 4 o S, ili nakon velikog broja smrzavanja - odmrzavanja, primeri formiraju sekundarne strukture - dimere, smanjujući učinkovitost PCR-a. Otklanjanje ovog problema svodi se na inkubaciju u vodenoj kupelji (T=95 o C) 3 minute i zatim brzo hlađenje na 0° IZ.

· DNA preparati - količina i kvaliteta DNA preparata (matrice) izravno utječe na tijek i parametre lančane reakcije polimeraze. Višak uzorka DNK inhibira lančanu reakciju polimeraze (PCR). Nečistoće raznih tvari u preparatu DNA također mogu smanjiti učinkovitost lančane reakcije polimerazom (PCR): natrijev acetat, natrijev klorid, izopropanol, etanol, heparin, fenol, urea, hemoglobin itd.

· DNA polimeraza - kada se koristi mala količina DNA polimeraze, uočava se smanjenje sinteze konačnog proizvoda izravno proporcionalno veličini fragmenata. Višak polimeraze za 2 - 4 puta dovodi do pojave difuznih spektara, a za 4 - 16 puta - nespecifičnih spektra niske molekularne težine. Raspon korištenih koncentracija je 0,5 - 1,5 jedinica aktivnosti u odnosu na 25 µl PCR smjese.

Uz glavne komponente PCR smjese, koriste se brojne dodatne tvari koje poboljšavaju kvalitativne i kvantitativne pokazatelje PCR: acetamid (5%) - povećanje topljivosti glavnih komponenti; betain (natrijeva sol) - stabilizacija DNA polimeraze, snižavanje tališta DNA, izjednačavanje tališta; goveđi albumin (10-100 μg / ml) - stabilizacija DNA polimeraze; dimetil sulfoksid (1-10%) - povećanje topljivosti glavnih komponenti; formamid (2-10%) - povećanje specifičnosti žarenja; glicerol (15-20%) - povećanje toplinske stabilnosti enzima, smanjenje temperature denaturacije uzorka DNA; amonijev sulfat - snižavanje temperature denaturacije i žarenja.

1.5.2 Ciklus i temperatura

Opći obrazac Programi lančane reakcije polimerazom (PCR) su sljedeći:

pozornici. Produžena primarna denaturacija DNA preparata.1 ciklus

pozornici. Brza denaturacija DNK preparata. Primer žarenja. Elongacija.30 - 45 ciklusa.

pozornici. Produljeno produljenje. Hlađenje reakcijske smjese 1 ciklus.

Svaki element faze - denaturacija, žarenje, elongacija - ima individualne karakteristike temperature i vremena. Parametri temperature i vremena protoka svakog elementa odabrani su empirijski, u skladu s kvalitativnim i kvantitativnim pokazateljima proizvoda pojačanja.

Denaturacija. Tijekom ovog elementa lančane reakcije polimeraze, dvolančana molekula DNA se dijeli na dvije jednolančane. Temperaturni parametri denaturacije su u rasponu od 90 - 95 o C, ali u slučaju uzorka DNA s visokim sadržajem gvanina i citozina, temperaturu treba povećati na 98 o C. Temperatura denaturacije trebala bi biti dovoljna za potpunu denaturaciju - cijepanje DNA lanaca i izbjegavanje "naglog hlađenja" ili brzog žarenja, međutim, termostabilna DNA polimeraza je manje stabilna na visokim temperaturama. Stoga je odabir optimalnih parametara temperature denaturacije za omjer primer/uzorak (priprema DNA) važan uvjet za amplificiranje. Ako je temperatura denaturacije u prvom koraku iznad 95 o C, preporuča se dodavanje DNA polimeraze u reakcijsku smjesu nakon primarne denaturacije. Trajanje ovog elementa faze tijekom lančane reakcije polimeraze (PCR) trebalo bi biti dovoljno za potpunu denaturaciju DNA, ali u isto vrijeme ne bi značajno utjecalo na aktivnost DNA polimeraze na danoj temperaturi.

Žarenje. Temperatura žarenja (T a ) jedan je od najvažnijih parametara lančane reakcije polimeraze. Temperatura žarenja za svaki specifični temeljni premaz odabire se pojedinačno. Ovisi o duljini i nukleotidnom sastavu početnice. Obično je niža za 2 - 4 o Od vrijednosti tališta (T m ) temeljni premaz. Ako je temperatura žarenja sustava ispod optimalne, tada se povećava broj nespecifičnih amplificiranih fragmenata i, obrnuto, viša temperatura smanjuje broj amplificiranih produkata. U tom slučaju, koncentracija specifičnih amplikona može se naglo smanjiti, sve do inhibicije lančane reakcije polimeraze (PCR). Povećanje vremena žarenja također dovodi do povećanja broja nespecifičnih amplikona.

Elongacija. Tipično, svaki tip termostabilne DNA polimeraze ima individualni temperaturni optimum aktivnosti. Brzina sinteze komplementarnog lanca DNK pomoću enzima također je vrijednost specifična za svaku polimerazu (u prosjeku je 30-60 nukleotida u sekundi, ili 1-2 tisuće baza u minuti), pa se vrijeme elongacije odabire ovisno o o vrsti DNA polimeraze i duljini umnožene regije.

1.5.3 Osnovna načela odabira primera

Prilikom izrade PCR test sustava, jedan od glavnih zadataka je pravilan odabir početnica koje moraju zadovoljiti niz kriterija:

Primeri moraju biti specifični. Posebna pažnja posvećena je 3 - krajevi početnica, jer od njih Taq polimeraza počinje dovršavati komplementarni lanac DNA. Ako je njihova specifičnost nedovoljna, tada će se vjerojatno dogoditi neželjeni procesi u epruveti s reakcijskom smjesom, naime sinteza nespecifične DNA (kratki ili dugi fragmenti). Vidljivo je na elektroforezi u obliku teških ili laganih dodatnih traka. To otežava procjenu rezultata reakcije, budući da je lako zamijeniti određeni produkt pojačanja sa sintetiziranom stranom DNA. Dio početnica i dNTP-a troši se za sintezu nespecifične DNA, što dovodi do značajnog gubitka osjetljivosti.

Primeri ne bi trebali stvarati dimere i petlje, t.j. ne bi se smjele formirati stabilne dvostruke niti žarenjem primera međusobno ili međusobno.

1.5.4 Efekt platoa

Valja napomenuti da proces nakupljanja specifičnih proizvoda pojačanja eksponencijalno traje samo ograničeno vrijeme, a zatim njegova učinkovitost kritično opada. To je zbog takozvanog "plato" efekta.

termin učinak plato koristi se za opisivanje procesa nakupljanja PCR produkata u posljednjim ciklusima amplifikacije.

Ovisno o uvjetima i broju ciklusa reakcije pojačanja, u trenutku kada je učinak postignut plato korištenje supstrata (dNTP i primeri), stabilnost reaktanata (dNTP i enzim), broj inhibitora, uključujući pirofosfate i DNA duplekse, natjecanje za reaktante s nespecifičnim produktima ili primer-dimerima, koncentracija specifičnog proizvoda i nepotpuna denaturacija pri visokim koncentracijama proizvoda pojačanja.

Što je niža početna koncentracija ciljne DNA, to je veći rizik od reakcije plato". Ova se točka može dogoditi prije nego što je broj specifičnih proizvoda pojačanja dovoljan za analizu. To mogu izbjeći samo dobro optimizirani testni sustavi.

1.5.5 Priprema uzorka biološkog materijala

Za ekstrakciju DNK koriste se različite tehnike, ovisno o zadacima. Njihova bit leži u ekstrakciji (ekstrakciji) DNA iz biološkog proizvoda i uklanjanju ili neutralizaciji stranih nečistoća kako bi se dobio pripravak DNA čistoće prikladne za PCR.

Metoda dobivanja čistog preparata DNK, koju je opisao Marmur, smatra se standardnom i već je postala klasična. Uključuje enzimatsku proteolizu nakon koje slijedi deproteinizacija i ponovno taloženje DNA alkoholom. Ova metoda omogućuje dobivanje čistog preparata DNK. Međutim, to je prilično naporno i uključuje rad s tako agresivnim i oštrim tvarima kao što su fenol i kloroform.

Jedna od trenutno popularnih metoda je metoda ekstrakcije DNK koju su predložili Boom i sur. Ova metoda se temelji na upotrebi jakog kaotropnog agensa, gvanidin tiocijanata (GuSCN), za lizu stanica i naknadnu sorpciju DNA na nosaču (staklene kuglice, dijatomejska zemlja, stakleno mlijeko, itd.). Nakon ispiranja, DNA ostaje u uzorku adsorbirana na nosaču, s kojeg se lako može ukloniti pomoću pufera za ispiranje. Metoda je praktična, tehnološki napredna i prikladna za pripremu uzorka za amplificiranje. Međutim, mogući su gubici DNA zbog ireverzibilne sorpcije na nosaču, kao i tijekom brojnih ispiranja. Ovo je osobito važno kada se radi s malim količinama DNK u uzorku. Štoviše, čak i tragovi GuSCN-a mogu inhibirati PCR. Stoga je pri korištenju ove metode vrlo važan točan izbor sorbenta i pažljivo poštivanje tehnoloških nijansi.

Druga skupina metoda pripreme uzoraka temelji se na upotrebi ionskih izmjenjivača tipa Chilex, koji, za razliku od stakla, ne apsorbiraju DNA, već obrnuto, nečistoće koje ometaju reakciju. Ova tehnologija u pravilu uključuje dvije faze: kuhanje uzorka i adsorpciju nečistoća na ionskom izmjenjivaču. Metoda je izuzetno atraktivna zbog svoje jednostavnosti izvedbe. U većini slučajeva pogodan je za rad s kliničkim materijalom. Nažalost, ponekad postoje uzorci s nečistoćama koje se ne mogu ukloniti pomoću ionskih izmjenjivača. Osim toga, neki se mikroorganizmi ne mogu uništiti jednostavnim kuhanjem. U tim slučajevima potrebno je uvesti dodatne faze obrade uzorka.

Stoga bi izbor metode pripreme uzorka trebao biti tretiran s razumijevanjem svrhe namjeravane analize.

1.5.6 Pojačavanje

Za provođenje reakcije amplifikacije potrebno je pripremiti reakcijsku smjesu i dodati joj analizirani uzorak DNK. U ovom slučaju, važno je uzeti u obzir neke značajke žarenja temeljnog premaza. Činjenica je da, u pravilu, u analiziranom biološkom uzorku postoje različite molekule DNA, s kojima početnice korištene u reakciji imaju djelomičnu, au nekim slučajevima i značajnu homologiju. Osim toga, primeri se mogu međusobno žariti kako bi formirali primer-dimere. Oba dovode do značajne potrošnje početnica za sintezu sporednih (nespecifičnih) produkata reakcije i, kao rezultat, značajno smanjuju osjetljivost sustava. Zbog toga je teško ili nemoguće očitati rezultate reakcije tijekom elektroforeze.

1.6 Sastav standardne PCR reakcijske smjese

x PCR pufer (100 mM otopina Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM otopina KCl, 25 mM otopina MgCl2 ) …….2,5 µl

Voda (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Mješavina nukleotidnih trifosfata (dNTP)

mM otopine svakog…………………………………………….……….0,5 µl

Primer 1 (10 mM otopina) ………………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM otopina) ………………………………………….….1 µl

DNA polimeraza (5 jedinica / µl) ……………………………………………0,2 µl

DNK uzorak (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Procjena rezultata reakcije

Kako bi se ispravno procijenili rezultati PCR-a, važno je razumjeti da ova metoda nije kvantitativna. Teoretski, produkti amplifikacije pojedinačnih ciljnih molekula DNA mogu se detektirati elektroforezom već nakon 30-35 ciklusa. Međutim, u praksi se to radi samo u slučajevima kada se reakcija odvija u uvjetima bliskim idealnim, što se ne susreće često u životu. Osobito veliki utjecaj na učinkovitost umnožavanja ima stupanj čistoće preparata DNA; prisutnost određenih inhibitora u reakcijskoj smjesi, kojih se u nekim slučajevima može vrlo teško riješiti. Ponekad, zbog njihove prisutnosti, nije moguće amplificirati čak ni desetke tisuća ciljnih molekula DNA. Stoga često ne postoji izravan odnos između početne količine ciljne DNA i konačne količine proizvoda amplifikacije.

Poglavlje 2: Primjena lančane reakcije polimeraze

PCR se koristi u mnogim područjima za analizu iu znanstvenim eksperimentima.

Kriminalistika

PCR se koristi za usporedbu takozvanih "genetičkih otisaka". Trebamo uzorak genetskog materijala s mjesta zločina - krv, slinu, sjeme, kosu itd. Uspoređuje se s genetskim materijalom osumnjičenika. Dovoljna je vrlo mala količina DNK, teoretski – jedna kopija. DNK se reže na fragmente, zatim umnožava PCR-om. Fragmenti se odvajaju DNA elektroforezom. Rezultirajuća slika položaja DNK traka naziva se genetski otisak prsta.

Utvrđivanje očinstva

Rezultati elektroforeze fragmenata DNA umnoženih PCR-om. Otac. Dijete. Majka. Dijete je naslijedilo neke značajke genetskog otiska oba roditelja, što je dalo novi, jedinstveni otisak.

Iako su "genetski otisci" jedinstveni, obiteljske veze ipak se mogu uspostaviti izradom nekoliko takvih otisaka. Ista se metoda može primijeniti, uz male modifikacije, za uspostavljanje evolucijskih odnosa među organizmima.

Medicinska dijagnostika

PCR omogućuje znatno ubrzanje i olakšavanje dijagnostike nasljednih i virusne bolesti. Gen od interesa umnožava se PCR-om pomoću odgovarajućih početnica, a zatim se sekvencira kako bi se odredile mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, tjednima ili mjesecima prije pojave simptoma bolesti.

Personalizirana medicina

Ponekad su lijekovi toksični ili alergeni za neke pacijente. Razlozi tome dijelom leže u individualnim razlikama u osjetljivosti i metabolizmu lijekova i njihovih derivata. Te su razlike određene na genetskoj razini. Na primjer, kod jednog pacijenta određeni citokrom može biti aktivniji, kod drugog - manje. Kako bi se utvrdilo kakvu vrstu citokroma ima određeni pacijent, predlaže se provesti PCR analizu prije uporabe lijeka. Ova analiza se naziva preliminarna genotipizacija.

Kloniranje gena

Kloniranje gena je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacija genetskog inženjeringa, dobivanje velike količine produkta određenog gena. PCR se koristi za umnožavanje gena, koji se zatim umeće u vektor, dio DNK koji prenosi strani gen u isti organizam ili drugi organizam koji se lako uzgaja. Kao vektori koriste se, na primjer, plazmidi ili virusna DNA. Umetanje gena u strani organizam obično se koristi za dobivanje produkta tog gena - RNK ili, najčešće, proteina. Tako se mnogi proteini dobivaju u industrijskim količinama za upotrebu u poljoprivredi, medicini itd.

Sekvenciranje DNA

U metodi sekvencioniranja obilježenih fluorescentnom oznakom ili radioaktivnim izotopom dideoksinukleotida PCR je sastavni dio, budući da se tijekom polimerizacije derivati ​​nukleotida obilježeni fluorescentnom ili radioaktivnom oznakom umeću u lanac DNA. Ovo zaustavlja reakciju, omogućujući određivanje položaja specifičnih nukleotida nakon odvajanja sintetiziranih niti u gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postala glavna metoda mutageneze. Primjena PCR-a omogućila je pojednostavljenje i ubrzanje postupka mutageneze, kao i njegovu pouzdanost i ponovljivost.

Metoda PCR omogućila je analizu prisutnosti sekvenci humanog papiloma virusa u biopsijskim dijelovima ljudskih cervikalnih neoplazmi ugrađenih u parafin 40 godina prije ove studije. Štoviše, uz pomoć PCR-a bilo je moguće umnožiti i klonirati fragmente mitohondrijske DNA iz fosilnih ostataka ljudskog mozga starog 7 tisuća godina!

Sposobnost simultane analize dvaju lokusa smještenih na različitim nehomolognim kromosomima dokazana je na lizatima pojedinačnih ljudskih spermija. Ovaj pristup pruža jedinstvenu priliku za finu genetsku analizu i proučavanje kromosomske rekombinacije, polimorfizma DNA itd. Metoda analize pojedinačnih spermija odmah je našla praktičnu primjenu u sudskoj medicini, budući da HLA tipizacija haploidnih stanica omogućuje određivanje očinstva ili identifikaciju kriminalac (HLA kompleks je skup gena ljudskog glavnog histokompatibilnog kompleksa; lokusi HLA kompleksa su najpolimorfniji od svih poznatih kod viših kralježnjaka: unutar vrste, na svakom lokusu, postoji neobično velik broj različiti aleli – alternativni oblici istog gena).

Pomoću PCR-a moguće je otkriti ispravnost integracije stranih genetskih struktura u unaprijed određeno područje genoma proučavanih stanica. Ukupna stanična DNA žari se s dva oligonukleotidna početnica, od kojih je jedan komplementaran mjestu DNA domaćina u blizini točke umetanja, a drugi sekvenci integriranog fragmenta u antiparalelnom lancu DNA. Lančana reakcija polimerazom u slučaju nepromijenjene strukture kromosomske DNA na predloženom mjestu insercije dovodi do stvaranja jednolančanih fragmenata DNA neodređene veličine, a u slučaju planirane insercije, dvolančanih fragmenata DNA poznatih veličina, određena udaljenošću između mjesta žarenja dvaju primera. Štoviše, stupanj pojačanja analizirane regije genoma u prvom slučaju bit će linearno ovisan o broju ciklusa, au drugom - eksponencijalno. Eksponencijalno nakupljanje amplificiranog fragmenta unaprijed određene veličine tijekom PCR-a omogućuje vizualno promatranje istog nakon elektroforetske frakcioniranja preparata DNA i donošenje nedvosmislenog zaključka o umetanju strane sekvence u određeno područje kromosomske DNA.

Zaključak

PCR metoda trenutno je najraširenija metoda za dijagnosticiranje raznih zaraznih bolesti. PCR vam omogućuje prepoznavanje etiologije infekcije, čak i ako uzorak uzet za analizu sadrži samo nekoliko molekula DNA patogena. PCR se široko koristi u ranoj dijagnostici HIV infekcija, virusnog hepatitisa itd. Do danas gotovo da nema infektivnog agensa koji se ne može otkriti pomoću PCR-a.

Popis korištene literature

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metode molekularno-genetske analize. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 str.

2.PCR "u realnom vremenu" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. i tako dalje.; izd. b. n. D.V. Rebrikov; predgovor LA. Osterman i akad. RAS i RAAS E.D. Sverdlov; 2. izdanje, rev. i dodatni - M.: BINOM. Laboratorij znanja, 2009. - 223 str.

.Patrushev L.I. Umjetni genetski sustavi. - M.: Nauka, 2005. - U 2 tone

.B. Glick, J. Pasternak Molekularna biotehnologija. Načela i primjena 589 str., 2002

5.Ščelkunov S.N. genetski inženjering. - Novosibirsk: Sib. sveuč. izdavačka kuća, 2004. - 496 str.

Uredio A.A. Vorbjeva "Lančana reakcija polimerazom i njezina primjena u dijagnostici u dermatovenerologiji"; Medicinska novinska agencija - 72 stranice

http://ru. wikipedia.org

http://znanstvenik. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - medicinski časopis

Podučavanje

Trebate li pomoć u učenju teme?

Naši stručnjaci će vam savjetovati ili pružiti usluge podučavanja o temama koje vas zanimaju.
Pošaljite prijavu naznačite temu upravo sada kako biste saznali o mogućnosti dobivanja konzultacija.

SEI HPE "Krasnoyarsk State Medical Academy

nazvan po Yasenetsky Savezna agencija za zdravstveni i socijalni razvoj »

Zavod za medicinsku genetiku i kliničku neurofiziologiju IPO

GLAVNI PRINCIPI METODE

LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE

Metodički priručnik za studente 3-4 kolegija

u specijalnosti opće medicine (060101) i

Krasnojarsk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Osnovna načela metode lančane reakcije polimerazom. Metodički priručnik za izvannastavni rad studenata 3-4 kolegija specijalnosti opće medicine (060101) i pedijatrije (060103). - Krasnojarsk: Izdavačka kuća GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42 str.

Metodološki priručnik u potpunosti je u skladu sa zahtjevima Državnog standarda (2000) i odražava glavne aspekte moderna metoda dijagnostika nasljedne bolesti ljudski - metoda lančane reakcije polimeraze, obrazovni materijal prilagođen je obrazovnim tehnologijama, uzimajući u obzir specifičnosti obuke u 3-4 tečaja medicinskih i pedijatrijskih fakulteta.

Recenzenti: Voditelj Odsjeka za medicinsku genetiku Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja

"Novosibirsko državno medicinsko sveučilište Savezne agencije za zdravstvo i društveni razvoj”, doktor medicinskih znanosti, prof.;

replikacija DNK

Predmet proučavanja ove metode je deoksiribonukleinska kiselina (DNK). DNA je univerzalni nositelj genetskih informacija u svim organizmima koji postoje na Zemlji (osim mikroorganizama koji sadrže RNA). DNK je dvostruki lanac upleten u spiralu. Svaki lanac sastoji se od nukleotida povezanih u seriju. Lanci DNA imaju suprotan smjer: 5'-kraj jednog lanca odgovara 3'-kraju drugog lanca. Jedinstveno svojstvo DNK je njena sposobnost da se umnožava. Ovaj proces se zove replikacija. Replikacija molekule DNA događa se tijekom sintetskog razdoblja interfaze. Svaki od dva lanca "roditeljske" molekule služi kao predložak za "kćer". Nakon replikacije, novosintetizirana molekula DNA sadrži jedan "majčin" lanac, a drugi - "kćer", novo sintetiziran (polukonzervativna metoda). Za šablonsku sintezu nove molekule DNA potrebno je despiralizirati i rastegnuti staru molekulu. Replikacija počinje na nekoliko mjesta u molekuli DNA. Odsjek molekule DNA od početka jedne replikacije do početka druge naziva se replikon.

Aktivira se početak replikacije početnice(sjemenke), koje se sastoje od 100-200 parova baza. Enzim DNA helikaza odmotava i dijeli matičnu spiralu DNA u dvije niti, na koje se, prema principu komplementarnosti, uz sudjelovanje enzima DNA polimeraze, sklapaju niti “kćeri” DNA. Da bi enzim započeo s radom, potrebna je prisutnost početnog bloka - malog početnog dvolančanog fragmenta. Početni blok nastaje kada početnica stupi u interakciju s komplementarnom regijom odgovarajućeg lanca roditeljske DNA. U svakom replikonu, DNA polimeraza se može kretati duž "majčinskog" lanca samo u jednom smjeru (5`=>3`).

Na vodećoj niti, kako se replikon odmotava, lanac "kćer" postupno kontinuirano raste. Na lancu koji zaostaje, lanac kćer također se sintetizira u smjeru (5`=>3`), ali u zasebnim fragmentima kako se replikon odmotava.

Dakle, pričvršćivanje komplementarnih nukleotida "kćeri" niti ide u suprotnim smjerovima (antiparalelno). Replikacija u svim replikonima događa se istovremeno. Fragmenti i dijelovi lanaca "kćeri" sintetizirani u različitim replikonima povezuju se u jedan lanac pomoću enzima ligaze. Replikaciju karakterizira polukonzervacija, antiparalelizam i diskontinuitet. Cijeli genom stanice replicira se jednom u vremenskom razdoblju koje odgovara jednom mitotičkom ciklusu. Kao rezultat procesa replikacije, dvije molekule DNA nastaju iz jedne molekule DNA, u kojoj je jedan lanac iz roditeljske molekule DNA, a drugi, kći, novosintetiziran (slika 1).

Riža. jedan. Dijagram replikacije molekule DNA.

Dakle, ciklus replikacije DNK uključuje tri glavne faze:

1. odmotavanje spirale DNA i divergencija lanaca (denaturacija);

2. pričvršćivanje početnica;

3. završetak lanca dječje niti.

Princip PCR metode

Replikacija DNK bila je osnova PCR-a. U PCR-u se gore navedeni procesi provode u epruveti u cikličkom načinu rada. Prijelaz iz jednog stupnja reakcije u drugi postiže se promjenom temperature inkubacijske smjese. Kada se otopina zagrije na 93-95°C, dolazi do denaturacije DNA. Za prelazak na sljedeći korak - dodavanje ili "žarenje" primera - inkubacijska smjesa se ohladi na 50-65°C. Zatim se smjesa zagrijava na 70-72°C - optimalni rad taq-DNA polimeraze - u ovoj fazi se dovršava novi lanac DNA. Zatim se ciklus ponovno ponavlja. Drugim riječima PCR metoda je višestruko povećanje broja kopija (pojačanje) specifični dio DNK kataliziran enzimom DNK polimeraza.

Produženje kćerinskih DNK lanaca mora se dogoditi istovremeno na oba lanca majčine DNK, tako da replikacija drugog lanca također zahtijeva vlastiti početni. Tako se u reakcijsku smjesu uvode dva primera: jedan za "+"-lanac, drugi za "-"-lanac. Spajajući se na suprotne niti molekule DNA, početnice se ograničavaju na onaj njezin dio, koji će se naknadno opetovano udvostručiti ili pojačati. Duljina takvog fragmenta, koji se naziva amplikon, obično je nekoliko stotina nukleotida.

PCR koraci

Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 faze koje se odvijaju pri različitim temperaturnim uvjetima (slika 2).

· Faza 1: denaturacija DNK . Teče na 93-95° 30-40 sekundi.

· Faza 2: temeljno žarenje . Pričvršćivanje primera događa se komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNK na granicama specifičnog mjesta. Svaki par primera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Vrijeme žarenja 20-60 sek.

· Faza 3: produljenje DNA lanaca. Komplementarno produljenje DNA lanaca događa se od 5" kraja do 3" kraja lanca u suprotnim smjerovima, počevši od mjesta vezanja početnica. Materijal za sintezu novih DNA lanaca su deoksiribonukleozid trifosfati dodani otopini. Proces sinteze katalizira enzim taq-polimeraza i odvija se na temperaturi od 70-72°C. Vrijeme sinteze - 20-40 sek.

Novi DNA lanci formirani u prvom ciklusu amplifikacije služe kao predlošci za drugi ciklus amplifikacije, u kojem se formira specifični fragment DNA amplikona (slika 3). U sljedećim ciklusima amplifikacije, amplikoni služe kao predložak za sintezu novih lanaca.

Dakle, amplikoni se nakupljaju u otopini prema formuli 2", gdje je n broj ciklusa amplifikacije. Prema tome, čak i ako je samo jedna dvolančana molekula DNA inicijalno bila u početnoj otopini, oko 108 molekula amplikona nakuplja se u otopini u 30-40 ciklusa.Ova količina je dovoljna za pouzdanu vizualnu detekciju ovog fragmenta elektroforezom u agaroznom gelu.

Proces pojačanja provodi se u posebnom programabilnom termostatu ( biciklista), koji prema zadanom programu automatski mijenja temperature prema broju ciklusa pojačanja.

Za pojačanje su potrebne sljedeće komponente:

· DNK predložak(DNA ili njezin dio koji sadrži željeni specifični fragment);

· Primeri(sintetski oligonukleotidi (20-30 parova nukleotida) komplementarni DNA sekvencama na granicama specifičnog fragmenta koji se određuje). Odabir specifičnog fragmenta i odabir početnica imaju veliku ulogu u specifičnosti amplifikacije, što utječe na kvalitetu analize.

· Mješavina deoksinukleotid trifosfata (dNTP)(mješavina četiri dNTP-a, koji su materijal za sintezu novih komplementarnih DNA lanaca u ekvivalentnim koncentracijama od 200-500 mikrona)

· EnzimTaq-polimeraza(termostabilna DNA polimeraza koja katalizira produljenje početnih lanaca sekvencijalnim dodavanjem nukleotidnih baza rastućem lancu sintetizirane DNA, 2-3 mm).

· puferska otopina(reakcijski medij koji sadrži ione Mg2+ potrebne za održavanje aktivnosti enzima, PH 6,8-7,8).

Da bi se odredile specifične regije genoma RNA virusa, prvo se dobije kopija DNA iz RNA predloška pomoću reakcije reverzne transkripcije (RT) koju katalizira enzim reverzna transkriptaza (reverzna transkriptaza).

Riža. 2. Amplifikacija (1. ciklus).

Riža. 3. Amplifikacija (2. ciklus).

Glavne primjene PCR-a

klinička medicina:

o dijagnoza infekcija,

o otkrivanje mutacija, uključujući dijagnostiku nasljednih bolesti,

o genotipizacija, uključujući HLA genotipizaciju,

o stanične tehnologije

ekologija (kao način praćenja stanja i kakvoće okolišnih objekata i hrane)

definicija transgenih organizama (GMO)

Osobna identifikacija, očinstvo, forenzika

opća i posebna biologija,

Osnovni principi

organizacija dijagnostičkih laboratorija

Rad u PCR laboratoriju provodi se u skladu s "Pravilima za dizajn, sigurnost, industrijsku sanitariju, protuepidemijski režim i osobnu higijenu pri radu u laboratorijima (odjelima, odjelima) sanitarnih i epidemioloških ustanova zdravstvenog sustava.

Kontaminacija DNK uzoraka

Provođenje PCR dijagnostike povezano je s problemom koji uzrokuje visoka osjetljivost metode – mogućnost kontaminacija. Ako tragovi pozitivne DNA uđu u reakcijsku epruvetu (specifični produkti amplifikacije DNA – amplikoni; DNA standard koji se koristi kao pozitivna kontrola; pozitivna DNA kliničkog uzorka) dolazi do amplifikacije specifičnog fragmenta DNA tijekom PCR-a i, kao rezultat, pojava lažno pozitivnih rezultata.

Tijekom rada možete se sresti dvije vrste kontaminacije:

1. unakrsne kontaminacije od uzorka do uzorka (tijekom obrade kliničkih uzoraka ili prilikom vađenja reakcijske smjese), što dovodi do pojave sporadičnih lažno pozitivnih rezultata;

2. amplification product kontaminacija(amplikoni), što je od najveće važnosti jer se tijekom PCR procesa amplikoni nakupljaju u ogromnim količinama i idealni su produkti za reamplifikaciju.

Kontaminacija posuđa, automatskih pipeta i laboratorijske opreme, površine laboratorijskih stolova ili čak površine kože laboratorijskih radnika dovodi do sustavnih lažno pozitivnih rezultata. Utvrđivanje izvora kontaminacije može biti vrlo teško i zahtijeva značajno ulaganje vremena i novca. Dosadašnje iskustvo u radu laboratorija koji koriste PCR metodu za dijagnostiku omogućuje nam formuliranje osnovnih zahtjeva za organizaciju takvih laboratorija i provođenje samih analiza. Usklađenost s ovim zahtjevima eliminira mogućnost kontaminacije i dobivanja lažno pozitivnih rezultata.

Faze PCR analize

Geografski odvojeni, postavljajući ih u zasebne prostorije (Sl. 4.5):

· Pre-PCR soba, gdje se vrši obrada kliničkih uzoraka, ekstrakcija DNA, priprema reakcijske smjese za PCR i PCR (ukoliko postoje uvjeti, zadnja dva koraka se također preporuča provesti u dodatnoj zasebnoj prostoriji). U tim prostorijama zabranjeno je obavljanje svih drugih vrsta rada s ispitivanim uzročnicima čija se PCR dijagnostika provodi u ovom laboratoriju.

· Post-PCR soba, gdje se provodi detekcija proizvoda amplifikacije. Druge metode detekcije mogu se koristiti u ovoj sobi. Poželjno je prostoriju za detekciju produkata umnožavanja smjestiti što dalje od prostorija prije PCR-a.

Radne prostorije su opremljene ultraljubičastim svjetiljkama s maksimalnim zračenjem u području od 260 nm (tip DB-60) u iznosu od 2,5 W po 1 m3. Lampe su postavljene tako da su površine radnih stolova, opreme i materijala s kojima operater dolazi u kontakt tijekom PCR analize izloženi izravnom zračenju. Zračenje se provodi 1 sat prije početka rada i 1 sat nakon završetka rada.

Laboratorijski liječnici rade u posebnoj laboratorijskoj odjeći, koja se mijenja pri prelasku iz jedne prostorije u drugu, te u jednokratnim rukavicama. Obrada odjeće iz različitih prostorija provodi se odvojeno. Na različite faze PCR analizu provode različiti djelatnici.

Za rad se koriste odvojeni setovi dozatora, plastičnog i staklenog posuđa, laboratorijske opreme, ogrtača i rukavica, koji su predviđeni za različite faze analize i ne mogu se prenositi iz jedne prostorije u drugu. Oprema, materijali i inventar u svakoj prostoriji označeni su na odgovarajući način.

Sve faze rada provode se samo uz korištenje potrošnog materijala za jednokratnu upotrebu: vrhovi za automatske pipete, epruvete, rukavice itd. Svakako promijenite vrhove kada prelazite s uzorka na uzorak. Potrebno je koristiti vrhove s filtrom za aerosolnu barijeru kako bi se spriječilo ulazak mikrokapljica otopine u pipetu. Iskorištene epruvete i vrhovi odlažu se u posebne spremnike ili spremnike s otopinom za dezinfekciju. Klinički uzorci pohranjuju se odvojeno od reagensa.

Za obradu i čišćenje radnog mjesta svaka soba ima štapiće (salvete), pincete, dezinfekcijska i inaktivirajuća otopina.

U PCR dijagnostičkom laboratoriju isključeni su poslovi koji se odnose na proizvodnju (kloniranje) i izolaciju rekombinantnih plazmida koji sadrže sekvence DNA ili genske fragmente patogena koji se dijagnosticiraju u ovom laboratoriju.

Prikupljanje kliničkog materijala

Proučavani materijal za PCR može biti strugotina epitelnih stanica, krvi, plazme, seruma, pleuralne i cerebrospinalne tekućine, urina, sputuma, sluzi i drugih bioloških izlučevina, uzoraka biopsije.

Uzorkovanje materijala provodi se u uvjetima prostorije za tretman odgovarajućeg profila. Nakon uzorkovanja, uzorke je potrebno što prije odnijeti u PCR dijagnostički laboratorij.

Uzorkovanje se mora provesti sterilnim, po mogućnosti jednokratnim, instrumentima samo u jednokratnim sterilnim plastičnim ili staklenim epruvetama, prethodno tretiranim jedan sat smjesom kroma, temeljito ispranim destiliranom vodom i kalciniranim u pećnici na temperaturi od 150 °C za 1 sat.

Zona detekcije (drugi kat ili druga zgrada).

Riža. četiri. PCR laboratorijski uređaj s detekcijom elektroforezom.

Zona detekcije (drugi kat ili zgrada)

Riža. 5. PCR laboratorijski uređaj s fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza).

Riža. 6. Soba za ekstrakciju DNK. Prikazana je stolna kutija s baktericidnom lampom.

Riža. 7. soba za pojačanje.

Riža. osam. Soba za detekciju.

Riža. 9. Uzorci krvi za DNA dijagnostiku nasljednih bolesti.

Čuvanje i transport uzoraka

Za dijagnostiku nasljednih bolesti uzorci krvi čuvaju se na posebnim papirnatim obrascima ili u epindorfima (plastične epruvete) u smrznutom stanju dulje vrijeme (slika 9).

Za dijagnostiku zaraznih bolesti uzorci se čuvaju na sobnoj temperaturi najviše 2 sata. Ako je potrebno dulje skladištenje, uzorci se mogu staviti u hladnjak na temperaturu od 2-8°C na razdoblje ne duže od 24 sata. Dulje skladištenje (do 2 tjedna) prihvatljivo je zamrznuto zamrzivač na temperaturi od minus 20°C. Ponovljeno zamrzavanje-odmrzavanje uzoraka nije dopušteno.

Ako su PCR dijagnostički laboratorij i proceduralna soba za uzorkovanje geografski odvojeni, tada se uzorci trebaju transportirati u termosicama ili termospremnicima u skladu s pravilima za čuvanje uzoraka i pravilima za transport zaraznih materijala.

Ekstrakcija DNA iz uzoraka

Metoda sorpcije na čvrstoj fazi, koja se sastoji u dodavanju sredstva za liziranje koje sadrži otopinu gvanidina, sorpcije DNA na sorbentu, ponovljenog ispiranja i resorpcije DNA puferskom otopinom, postala je široko rasprostranjena. U slučaju obrade seruma, plazme ili cijele krvi obično se koristi metoda fenolne ekstrakcije. Metoda uključuje deproteinizaciju s fenolom/kloroformom nakon čega slijedi taloženje DNA (ili RNA) s etanolom ili izopropanolom. Obrada se provodi u mikrocentrifugalnim epruvetama tipa Eppendor P volumena 1,5 ml. Vrijeme obrade je 1,5-2 sata (slika 10).

Riža. deset. Izolacija DNA.

Provođenje PCR-a

Određena količina uzorka iz obrađenog kliničkog uzorka prenosi se u specijalnu epruvetu za mikrocentrifugiranje tipa Eppendorf volumena 0,2 ili 0,5 ml, u koju se dodaje smjesa za umnožavanje koja se sastoji od vode, PCR pufera, otopine dNTP, otopine primera i otopine. ista epruveta. Taq-polimeraza (dodaje se posljednja u smjesu. Obično je volumen reakcijske smjese 25 µl. Zatim se u svaku epruvetu doda jedna kap mineralnog ulja kako bi se spriječilo isparavanje reakcijske smjese tijekom amplifikacije. Epruvete su prenosi se u programabilni termostat (pojačalo), gdje se pojačanje provodi u automatskom načinu rada prema zadanom programu (slika 11).

Riža. jedanaest. pojačalo" Termocikler ».

Vrijeme reakcije, ovisno o zadanom programu, je 2-3 sata. Paralelno s eksperimentalnim uzorcima postavljaju se kontrolni uzorci: pozitivna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali umjesto materijala kliničkog uzorka uvodi se kontrolni DNA pripravak proučavanog gena. Negativna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto kliničkog materijala ili preparata DNK dodaje odgovarajuća količina deionizirane vode ili ekstrakta koji ne sadrži ispitivanu DNK. Negativna kontrola je neophodna kako bi se provjerilo da komponente reakcije ne sadrže DNK zbog kontaminacije i isključili lažno pozitivne rezultate.

Prijava rezultata

Umnoženi specifični fragment DNA detektira se elektroforezom u agaroznom gelu u prisutnosti etidijevog bromida. Etidijev bromid tvori stabilan intersticijski spoj s fragmentima DNA, koji se pojavljuju kao svjetleće trake kada se gel ozrači UV zračenjem valne duljine od 290-330 nm. Ovisno o veličini dobivenih PCR amplikona, koristi se gel koji sadrži 1,5% do 2,5% agaroze. Za pripremu agaroznog gela smjesa agaroze, pufera i vode se otopi u mikrovalnoj pećnici ili u vodenoj kupelji i doda se otopina etidijevog bromida. Ohlađena na 50-60°C smjesa se izlije u kalup u sloju debljine 4-6 mm, te se posebnim češljevima u gelu izrađuju džepovi za nanošenje uzorka. Češljevi su postavljeni tako da između dna jažica i baze gela ostane sloj agaroze 0,5-1 mm. Nakon što se gel stvrdne, na džepove se nanosi amplifikat u količini od 5-15 µl. Preporuča se provoditi elektroforezu mješavine markera duljine fragmenata DNA paralelno s kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Tipično, takva smjesa sadrži deset DNA fragmenata 100, 200, 300, itd. dugih parova baza.

Postavljanje takvog uzorka omogućuje provjeru duljine amplikona u kontrolnom i pokusnom uzorku. Gel s nanesenim uzorkom se prenosi u komoru za elektroforezu napunjenu puferom, komora se spaja na izvor napajanja i provodi se elektroforetska separacija produkata amplifikacije 30-45 minuta pri jakosti električnog polja od 10-15 V/cm. U tom slučaju prednja strana boje, koja je dio reakcijske smjese, mora proći najmanje 3 cm.

Nakon završetka elektroforeze, gel se prenese na staklo transiluminatora i promatra u ultraljubičastom svjetlu. Za dokumentaciju gel se fotografira na Mikrat 300 film ili snima video sustavom spojenim na računalo.

Prvo se ocjenjuju kontrolni uzorci. U elektroforetskoj traci koja odgovara pozitivnoj kontroli trebala bi biti prisutna narančasta svjetleća traka. Njegova elektroforetska pokretljivost treba odgovarati duljini amplikona navedenoj u uputama.

U elektroforetskoj stazi koja odgovara negativnoj kontroli takva traka ne bi trebala biti prisutna. Prisutnost takve vrpce u negativnoj kontroli ukazuje na kontaminaciju - kontaminaciju reagensa korištenih s ispitivanom DNK ili amplikonom. Ispitni uzorci ocjenjuju se prisutnošću trake u odgovarajućoj stazi koja se nalazi na istoj razini kao i traka u uzorku pozitivne kontrole. Intenzitet sjaja trake odgovara količini DNA koja se proučava u uzorku, što omogućuje polukvantitativnu procjenu PCR-a. Obično se pozitivni rezultati ocjenjuju na ljestvici od četiri točke. Ako je sjaj trake u pokusnom uzorku vrlo slab, tada bi takav uzorak trebalo preurediti (slika 12).

Riža. 12. Elektroforeza u agaroznom gelu.

PCR aplikacije zadijagnostika točkastih mutacija i polimorfizama gena

Jedno od vodećih područja primjene PCR-a u praktičnom zdravstvu je dijagnostika točkastih mutacija i polimorfizama gena. . Postoje izravne i neizravne metode DNA dijagnostike. U situacijama kada je poznat gen čije oštećenje dovodi do razvoja nasljedne bolesti, to se oštećenje može otkriti molekularno-genetičkim metodama. Takve se metode nazivaju izravnim. Izravnim metodama otkrivaju se poremećaji u primarnom slijedu nukleotida DNA (mutacije i njihove vrste). Izravne metode karakteriziraju točnost koja doseže gotovo 100%.

Međutim, u praksi se ove metode mogu primijeniti pod određenim uvjetima.:

s poznatom citogenetičkom lokalizacijom gena odgovornog za razvoj nasljedne bolesti;

Gen bolesti mora biti kloniran i njegova nukleotidna sekvenca poznata.

Cilj izravne DNA dijagnostike je identificirati mutirane alele.

Dakle, u situacijama kada se zna kakvo oštećenje DNK dovodi do nasljedne bolesti, izravno se ispituje fragment DNK koji sadrži oštećenje, odnosno koristi se izravna metoda DNK dijagnostike.

Međutim, do danas geni mnogih bolesti nisu mapirani, njihova egzon-intronska organizacija je nepoznata, a mnoge nasljedne bolesti karakterizira izrazita genetska heterogenost, što ne dopušta punu primjenu izravnih DNA dijagnostičkih metoda. Stoga se u slučajevima kada lokalizacija oštećenja nije poznata koristi drugačiji pristup, povezan s proučavanjem blizine gena odgovornog za gensku bolest, u kombinaciji s obiteljskom analizom, odnosno indirektnim metodama molekularne genetske dijagnostike. nasljednih bolesti koriste se.

Za otkrivanje točkastih mutacija i malih delecija mogu se koristiti različite metode, no sve se temelje na korištenju PCR metode. Ova reakcija vam omogućuje opetovano umnožavanje sekvence nukleotida DNA, a zatim traženje mutacija. Metode traženja DNA fragmenata koji nose mutacije temelje se na usporednoj analizi mutantnih i normalnih nukleotidnih sekvenci DNA.

Analiza PCR proizvoda

u procesu izravne DNA dijagnostike

Uključuje proučavanje specifičnih značajki pojačane regije gena. Dakle, u bolestima uzrokovanim ekspanzijom trinukleotidnih ponavljanja, produkti amplifikacije razlikuju se po svojoj duljini (što odražava različit broj tripleta u proučavanoj genskoj regiji) i, kao rezultat toga, po brzini kretanja u gelu. Time se postiže jasno elektroforetsko razdvajanje normalnih i mutantnih alela i točna determinacija patološki izduženog fragmenta, odnosno DNK dijagnostika bolesti (slika 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Riža. četrnaest. Dijagnoza brisanja GEG u genu DYT 1 u bolesnika s distonijom neovisnom o dopi (elektroforeza u poliakrilamidnom gelu). Pjesme 2,3,6 - bolesni; trake 1,4,5 - kontrola. Tanka strelica označava normalni alel, podebljana strelica označava mutirani kraći alel (delecija tri nukleotida).

Ako je područje DNA koje se proučava u cijelosti uključeno u proširenu deleciju, tada se PCR amplifikacija DNA iz ovog izbrisanog alela neće provesti zbog nedostatka mjesta za hibridizaciju početnica. U ovom slučaju, homozigotna delecija će se dijagnosticirati na temelju potpunog odsustva PCR produkta reakcije (sinteza DNA je nemoguća iz obje kopije gena). S heterozigotnom delecijom moguće je identificirati PCR produkt sintetiziran iz normalnog (sigurnog) alela, no za pouzdanu dijagnozu takve mutacije potrebno je koristiti sofisticiranije metode vizualizacije DNA koje omogućuju procjenu doze konačni PCR proizvod.

Za otkrivanje točkastih mutacija (najčešće nukleotidnih supstitucija) na određenim mjestima koristi se PCR metoda u kombinaciji s drugim metodama molekularne genetičke analize. Ako su mjesto lokalizacije i priroda predložene točkaste mutacije točno poznati, tada za svrhovito otkrivanje takve mutacije, restrikcijske endonukleaze (restriktaze) su posebni stanični enzimi izolirani iz različitih sojeva bakterija.

Ovi enzimi prepoznaju specifične nukleotidne sekvence u rasponu duljine od četiri do deset nukleotida. Zatim se vrši restrikcija (lat. (rezanje)) ovih sekvenci u sklopu dvolančane molekule DNA.Svaki restrikcijski enzim prepoznaje i reže na fiksnom mjestu strogo definiran, specifičan slijed nukleotida - restrikcijsko mjesto (mjesto prepoznavanja).

U slučajevima kada točkasta mutacija mijenja prirodno mjesto prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim, taj enzim neće moći odcijepiti mutirani fragment pojačan PCR-om. U nekim slučajevima, mutacija dovodi do pojave novog mjesta prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim, koji je odsutan u normi.

U obje situacije, mutirani i normalni PCR produkti tretirani odabranim restrikcijskim enzimom dat će restrikcijske fragmente različitih duljina, koji se mogu lako detektirati elektroforezom (slika 15).

Stoga, ako je potrebno brzo detektirati bilo koju točkastu mutaciju, zadatak se svodi na traženje odgovarajućeg restrikcijskog enzima, čije je mjesto prepoznavanja lokalizirano na mjestu poremećene sekvence nukleotida. Obrada PCR proizvoda ovim restrikcijskim enzimom omogućit će lako razlikovanje normalnih i mutantnih alela. Restrikcijska analiza uvelike pojednostavljuje detekciju poznatih točkastih mutacija i trenutno se naširoko koristi za izravnu DNK dijagnostiku nasljednih bolesti.

završna faza molekularno genetička analiza mutacija je određivanje nukleotidnog slijeda proučavanog fragmenta DNA (sekvenciranje), koji se uspoređuje s normom i formulira se konačna genetska dijagnoza. Zahvaljujući napretku molekularne genetike, danas su razvijene DNK dijagnostičke metode za više od 400 nasljednih bolesti.

Riža. petnaest. Detekcija točkaste mutacije korištenjem restrikcijske analize: A - područje gena koje se može pojačati i koje sadrži restrikcijsko mjestoAGCTza restrikcijsku endonukleazuAlu ja. MutacijaG→ Amijenja ovu nukleotidnu sekvencu, što rezultira restrikcijskim enzimomAluiblokiran; B - elektroferogram restrikcijskih produkata: traka 1 - homozigotnost za normalni alel; traka 2, homozigotnost za mutaciju; traka 3 - heterozigotno stanje (normalni alel + mutacija).

Dijagnostika nasljednih bolesti temeljena na izravnom ispitivanju mutantnih alela kod pacijenata, članova njihovih obitelji ili pretpostavljenih heterozigotnih nositelja patoloških mutacija prikladna je za presimptomatsku i prenatalnu dijagnostiku, koja se može primijeniti u najranijim fazama fetalnog razvoja, prije pojave bilo kakve kliničke ili biokemijske simptome.bolest.

Bez obzira na metodu otkrivanja mutacije, točna molekularna karakterizacija svake mutacije može se dobiti samo izravnim sekvenciranjem. Da biste automatizirali ovaj proces u posljednjih godina Naširoko se koriste posebni uređaji - sekvenceri, koji omogućuju značajno ubrzanje procesa čitanja DNK informacija.

Put široj primjeni molekularno-bioloških istraživanja u kliničkim dijagnostičkim laboratorijima otvara se ubrzanjem analitičkog procesa izvođenjem svih postupaka u jednom kontinuumu, bez prijenosa uzorka, stvaranjem uvjeta za sprječavanje kontaminacije tijekom paralelnog ispitivanja većeg broja analita i objektivnom registracijom. rezultata u svakom ciklusu.

Glavne modifikacije PCR metode

Koristi se za brzo skeniranje i traženje poznatih genskih mutacija.

Multiplex (multiprimer) PCR

Ova se metoda temelji na istodobnoj amplificiranju nekoliko egzona proučavanog gena u jednoj reakciji. To omogućuje ekonomičan brzi pregled najčešćih mutacija. Na primjer, kako bi se brzo dijagnosticirao prijenos delecija u genu za distrofin u bolesnika s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom, provodi se simultana amplifikacija skupa eksona ovog gena koji najčešće mutiraju. Budući da su ove bolesti naslijeđene u X-vezanom recesivnom tipu i povezane su s oštećenjem jedinog kromosoma X u dječaka, u slučaju produljene delecije, elektroforeza produkata reakcije otkrit će odsutnost jednog ili više fragmenata DNA (egzona). ), što može poslužiti kao molekularna potvrda dijagnoze. Osim toga, odabirom specifičnih genskih regija za PCR amplificiranje, moguća je prilično točna procjena ukupne duljine delecije i točaka prekida gena (do egzona).

Kombinirana uporaba nekoliko multipleksnih reakcija omogućuje dijagnosticiranje do 98% svih delecija koje se javljaju u bolesnika s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom. To je otprilike 60% od ukupnog broja poznatih mutacija u genu distrofina i ukazuje na vrlo visoka efikasnost ova metoda probira za DNA dijagnozu distrofinopatije (slika 16).

Riža. 16. Izravna DNA dijagnostika Duchenneove mišićne distrofije primjenom multipleksne PCR (elektroforeza u agaroznom gelu). Kod svake od ispitivanih osoba istodobno su amplificirana četiri egzona gena za distrofin (egzoni 17, 19, 44 i 45; strelicama su označeni odgovarajući produkti amplifikacije). Traka 1 - kontrola, staza 2-5 - pacijenti s Duchenneovom mišićnom distrofijom s različitim delecijama gena za distrofin (staza 2 i 5 - delecija eksona 45, staza 3 - delecija egzona 44, staza 4 - delecija egzona 17 i 19 ).

Alel-specifična amplifikacija

Metoda se temelji na upotrebi dva neovisna para početnica za određenu regiju gena: jedna početnica u oba para je zajednička, a druga početnica u svakom paru ima drugačiju strukturu i komplementarna je normalnim ili mutantnim sekvencama DNK . Kao rezultat takve reakcije u otopini, mogu se istovremeno sintetizirati dvije vrste PCR proizvoda - normalni i mutant. Štoviše, dizajn upotrijebljenih primera omogućuje jasno razlikovanje normalnih i mutantnih proizvoda pojačanja prema njihovoj molekularnoj veličini. Ova metoda je vrlo jasna i omogućuje vam provjeru homo- i heterozigotnog nosioca mutantnog alela.

Metoda za mjesto usmjerenu modifikaciju amplificirane DNA

Metoda se temelji na upotrebi u PCR tzv. mismatch primera (koji nije u potpunosti komplementaran s predloškom), koji se razlikuje od slijeda DNA predloška za jedan nukleotid. Kao rezultat uključivanja navedene početnice u sastav mutantnog PCR produkta, u njemu se formira umjetno stvoreno restrikcijsko mjesto za jednu od restrikcijskih endonukleaza, što omogućuje izravnu DNK dijagnostiku određene poznate mutacije pomoću restrikcijske analize. Stvaranje takvog umjetnog restrikcijskog mjesta može biti potrebno ako pretraga nije otkrila postojanje poznatog i dostupnog enzima, čije je "prirodno" restrikcijsko mjesto pogođeno kao rezultat pojave proučavane mutacije u molekuli DNA .

PCR metoda reverzne transkriptaze (RT- PCR)

Ova se metoda koristi u slučajevima kada je prikladnije koristiti ne genomsku DNA kao predmet proučavanja, već kompaktniju i informacijama bogatiju cDNA dobivenu nakon odgovarajuće obrade uzoraka tkiva, na primjer, biopsijski materijal ili stanične linije limfocita, fibroblasti, itd. Ovdje je važan uvjet ekspresija (barem minimalna) željenog gena u tkivu koje se proučava.

U prvoj fazi provodi se reverzna transkripcija mRNA, a rezultirajuće molekule cDNA služe kao predložak za PCR. Zatim se kritična cDNA regija umnožena u dovoljnoj količini podvrgava sekvencioniranju i drugim metodama pretraživanja mutacija, izravnoj elektroforetskoj studiji (otkrivanje delecija, insercija itd.) ili integraciji u sustav ekspresije kako bi se dobilo proteinski proizvod i njegovu izravnu analizu.

Ova metoda je posebno učinkovita za otkrivanje mutacija koje dovode do sinteze "skraćenog" proteina (nonsense mutacije, splacing mutacije, velike delecije) - takozvana PTT analiza (Protein Truncation Test). PTT analiza se obično koristi kada se ispituju prošireni multi-egzonski geni, kao što je gen za Duchenne/Beckerovu mišićnu distrofiju, ataksiju-telangiektaziju ili neurofibromatozu tipa 1.

real time PCR(PCR u stvarnom vremenu)

Svake godine u praktičnom zdravstvu PCR u realnom vremenu postaje sve popularnija dijagnostička metoda. Njegova temeljna značajka je praćenje i kvantitativna analiza nakupljanja produkata lančane reakcije polimeraze te automatska registracija i interpretacija rezultata. Ova metoda ne zahtijeva korak elektroforeze, što smanjuje zahtjeve za PCR laboratorij. Zahvaljujući uštedama u proizvodnom prostoru, smanjenju broja osoblja i potražnji za kvantifikacijom DNA/RNA, ova se metoda posljednjih godina uspješno primjenjuje u najvećim sanitarno-epidemijskim, dijagnostičkim i istraživačkim centrima u razvijenim zemljama svijeta, zamjenjujući PCR u sadašnjem ("klasičnom") formatu.

PCR u stvarnom vremenu koristi fluorescentno obilježene oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK tijekom amplifikacije. PCR u stvarnom vremenu omogućuje kompletnu analizu uzorka unutar 20-60 minuta i teoretski je sposoban otkriti čak i jednu molekulu DNA ili RNA u uzorku.

Riža. 17. PCR u stvarnom vremenu.

PCR u stvarnom vremenu koristi sustav TaqMan za kontrolu kinetike PCR-a izravno tijekom pojačanja pomoću rezonantnog gašenja fluorescencije. Za detekciju se koristi sonda koja nosi fluorofor i gasitelj koji je komplementaran srednjem dijelu amplificiranog fragmenta. Kada su fluorofor i gasitelj vezani za oligonukleotidnu sondu, opaža se samo mala količina fluorescentne emisije. Tijekom procesa pojačanja, zbog aktivnosti 5'-egzonukleaze Taq polimeraze, fluorescentna oznaka prelazi u otopinu, oslobađajući se iz blizine prigušivača i stvara fluorescentni signal koji se povećava u stvarnom vremenu proporcionalno nakupljanju pojačati (slika 17).

Glavne prednosti PCR-Real-Time u odnosu na PCR s gel elektroforezom:

Cijela metoda odvija se u jednoj epruveti;

· Metoda traje 1 sat;

Dovoljno 1-2 radne sobe;

Uz kvalitativnu procjenu rezultata, moguće je kvantificirati rezultat (na primjer, kada se propisuje antivirusna terapija za AIDS ili virusni hepatitis potrebno je znati virusno opterećenje, tj. količinu virusa po 1 jedinici, što daje PCR u realnom vremenu);

· Dramatično smanjuje rizik od kontaminacije.

Zaključak

PCR metoda jedna je od najčešćih metoda molekularno bioloških istraživanja. Ovu metodu kliničari bi trebali smisleno koristiti, a liječnik koji se odluči koristiti PCR u svom radu mora imati određena znanja o značajkama i mogućnostima ove metode. Drugo, mora postojati bliska povratna veza između kliničara i PCR laboratorija, što je neophodno za analizu složenih slučajeva i razvoj ispravne dijagnostičke strategije. Treće, PCR analiza nije panaceja u dijagnozi (prije svega zaraznih bolesti) i ne zamjenjuje postojeće metode istraživanja, već ih samo nadopunjuje. I što je najvažnije, PCR ne može zamijeniti intuiciju i analitičko razmišljanje koje treba imati liječnik koji očekuje uspjeh.

P . S . Molekularno-biološka istraživanja - promjena referentnih točaka dijagnostike i liječenja. Primjena molekularno bioloških metoda povezana je s perspektivom radikalne promjene naglaska u laboratorijskoj dijagnostici. Možemo govoriti ne samo o pravovremenoj informaciji, već io njezinom prethodnom primitku. Ako se sada laboratorijske studije u većini slučajeva provode već s uznapredovalom bolešću i započetim liječenjem, onda se očekuje da će molekularno-biološki laboratorijski podaci omogućiti prepoznavanje sklonosti osobe određenim vrstama patologije i stupnja osjetljivosti na određene lijekove, koji omogućit će potkrijepljenje prediktivnog, preventivnog i personaliziranog karaktera medicine budućnosti.

PROMJENA TEŽIŠTA DIJAGNOZE I LIJEČENJA

NASLJEDNE BOLESTI

Danas U budućnosti

Dijagnoza Genetska putovnica

8. Koliko je radnih prostorija potrebno za PCR laboratorij s fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza, Real-Time PCR)?

9. Što je detekcija?

10. Koje se metode DNA dijagnostike razlikuju?

11. Koji enzim djeluje na temelju PCR?

12. Zašto zona detekcije mora biti odvojena od ostalih radnih zona?

13. Što je restrikcijsko mjesto?

14. Koja je razlika između izravne metode DNA dijagnostike i neizravne?

15. Što je sekvenciranje?

16. Što je multipleks PCR?

17. Koje vrste mutacija se određuju PCR-om?

18. Što je kontaminacija?

19. Što je bit metode alel-specifične amplifikacije?

20. Uvjeti čuvanja PCR materijala?

21. Koji se uređaj koristi za pojačavanje?

22. Što je metoda PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR)?

23. Što je materijal za PCR dijagnostiku?

24. Nabrojite vrste kontaminacije?

Testovi za samostalno učenje

1. Restrikcijske endonukleaze:

a) enzimi koji "razbijaju" DNK na strogo određenim mjestima;

b) enzimi koji šiju prekide u molekuli DNA;

c) enzimi koji osiguravaju spojeve koji provode popravak DNA.

2. Amplifikacija gena:

3. Koja se od metoda molekularne genetike koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih mutiranim genom poznatog slijeda?

a) korištenje specifične restriktaze;

b) izravna detekcija korištenjem specifičnih molekularnih sondi;

c) obiteljska analiza distribucije polimorfizma duljine normalnih restrikcijskih fragmenata.

4. Sekvenciranje DNK:

a) identifikacija sekvence baze DNA;

b) opetovano ponavljanje bilo kojeg segmenta DNA;

c) izolacija fragmenta DNA koji sadrži proučavani gen.

5. Uzorci DNK mogu se dobiti pomoću :

b) korionske resice;

c) amnionska tekućina;

d) stanice amnionske tekućine;

e) biopsije kože, mišića, jetre,

e) sve je točno, osim točke "c",

g) sve je točno, osim točke "d",

h) Sve gore navedeno je točno.

6. Koje se mutacije dijagnosticiraju PCR-om?

a) genomski;

b) kromosomski;

c) gen (točka).

7. Primer je:

a) komplementarni dio DNK;

b) sintetski oligonukleotid označen (radioaktivno ili fluorescentno) slijed komplementaran mutantnom ili normalnom genu;

c) oligonukleotid koji djeluje kao "sjeme" i inicira sintezu polinukleotidnog lanca na šabloni DNA ili RNA.

8. Tko je razvio princip PCR metode?

b) K. Mullis

9. Koristi li se PCR metoda za dijagnosticiranje ekspanzije trinukleotidnih ponavljanja (dinamički tip mutacija)?

10. U kojim područjima se koristi PCR?

a) klinička medicina;

b) definicija transgenih organizama (GMO)

c) identifikacija osobe, utvrđivanje očinstva, kriminalistika

d) sve navedeno

d) ništa od navedenog.

Primjeri odgovora: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - u; 7 - u; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Glavni

1. Bočkovljeva genetika. Moskva. GEOTAR, 2002. (enciklopedijska natuknica).

Dodatni

1., Bakharev i liječenje kongenitalnih i nasljednih bolesti u djece. - Moskva, 2004.

2. DNA dijagnostika i medicinsko genetsko savjetovanje. - Moskva, 2004.

3. Ginterova genetika. - Moskva, 2003.

4. Gorbunovljeve osnove medicinske genetike. - St. Petersburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekularna klinička dijagnostika. – Svijet, 1999.

6. Menjšikov - biološka istraživanja u kliničkoj laboratorijskoj dijagnostici: mogućnosti problema (predavanja). Kliničko-laboratorijska dijagnostika, broj 3, 2006.

7. Kornienko o radu PCR laboratorija tijekom in-line analize biološkog materijala. Kliničko-laboratorijska dijagnostika, broj 10, 2006.

8. Organizacija rada PCR laboratorija. Metodičke upute. MU 1.3.1794-03. Glavni sanitarni liječnik Ruske Federacije, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu. Genome Res. - broj 6, 1996.

GLAVNI PRINCIPI METODE

LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE

Metodički priručnik za izvannastavni rad studenata 3-4 kolegija specijalnosti opće medicine (060101) i pedijatrije (060103).

SEI HPE "Krasnojarska državna medicinska akademija Savezne agencije za zdravstveni i socijalni razvoj"

Rusija, Krasnojarsk,

S.V. Pospelova, M.V. Kuznjecova

lančana reakcija polimeraze

S.V. Pospelova– kand. med. znanosti, izvanredni profesor, Zavod za mikrobiologiju, virusologiju i imunologiju, M.V. Kuznjecova– kand. biol. Sci., zaposlenik IEGM UB RAS

Pospelova, S.V.

Namijenjen za samostalan rad studenata svih fakulteta: medicinskog, pedijatrijskog, medicinsko-preventivnog, stomatološkog i fakulteta za sestrinstvo (FVSO) Medicinske akademije.

Recenzent:

glava Zavod za biologiju, ekologiju i medicinsku genetiku PDM, red.prof A.B. Vinogradov

Tiskano odlukom središnje koordinacije
metodološko vijeće GOU VPO PGMA
ih. ak. E.A. Wagner Roszdrav

UDK 616-078.33

© Pospelova S.V., Kuznetsova M.V., 2007

© GOU VPO PGMA im. ak. E.A. Wagner Roszdrav, 2007

Lančana reakcija polimerazom u kliničkoj praksi
mikrobiološku dijagnostiku

Suvremena medicina uspješno koristi dostignuća prirodnih znanosti, intenzivno primjenjuje nove tehnologije za dijagnostiku i liječenje bolesti. Tradicionalnim mikrobiološkim i imunološkim metodama laboratorijske dijagnostike zaraznih bolesti u posljednje vrijeme dodaju se nove metode temeljene na korištenju molekularno-genetičkih tehnologija. Korištenje ovih metoda ne samo u znanstvene svrhe, ali iu praktičnoj laboratorijskoj dijagnostici, to je u velikoj mjeri postalo moguće zahvaljujući osmišljavanju procesa umjetnog višestrukog kopiranja DNA sredinom 80-ih godina prošlog stoljeća i daljnjem brzom razvoju ove tehnologije, danas poznate kao lančana reakcija polimeraze(PCR). U manje od 15 godina postojanja, PCR je učinio rutinskom analizu specifičnih sekvenci DNK mnogih patogena. Svestranost, visoka osjetljivost i relativna jednostavnost izvođenja učinili su PCR metodu nezamjenjivom za rješavanje raznih problema. klinička dijagnostika poput izravnog otkrivanja i identifikacije patogena, molekularne tipizacije i karakterizacije patogeni mikroorganizmi, analiza mutacija povezanih s genetskim bolestima kod ljudi, identifikacija osobnosti osobe.

Što je PCR?

lančana reakcija polimeraze(PCR) - umjetni proces ponovljenog kopiranja (pojačanja) izvedena određena sekvenca DNA in vitro(Sl. 1). Kopiranje DNA tijekom PCR-a provodi se posebnim enzimom - DNA polimeraza, kao u stanicama živih organizama. DNA polimeraza, krećući se duž jednog lanca DNA (matrice), sintetizira svoju komplementarnu sekvencu DNA. Važno je da DNA polimeraza ne može započeti sintezu lanca DNA "od nule", potreban joj je kratki "seed" lanac RNA ili DNA, na koji može početi dodavati nukleotide. Osnovno načelo PCR-a je da se reakcija polimerizacije (sinteza polimernog lanca DNA iz monomernih nukleotidnih jedinica) pokreće specifičnim početnice(kratki fragmenti "sjemena" DNA) u svakom od mnogih ponavljajućih ciklusa. Specifičnost PCR-a određena je sposobnošću početnica da "prepoznaju" strogo definiranu regiju DNA i vežu se na nju po principu molekularne komplementarnost.

U konvencionalnoj PCR reakciji koristi se par primera koji "ograničavaju" amplificiranu regiju s obje strane tako što se vežu na suprotne niti DNA šablone. Da bi se umnožio broj kopija izvorne DNK, potrebna je ciklička reakcija. U pravilu, svaki od sekvencijalno ponovljenih PCR ciklusa sastoji se od tri faze:

1)denaturacija, ili "taljenje" dvolančane DNA: prije početka reakcije ciljna DNA je dvolančana, na temperaturi 94-95 0 C komplementarni se lanci DNA razilaze - prelaze u jednolančano stanje;

2) vezivanje (žarenje) početnice: na temperaturi koja je optimalna za odabrane početnice, vežu se na komplementarnu regiju DNA uzorka;

3)produljenje, ili produljenje lanca: DNA polimeraza dodaje nukleotide početnicama, sintetizirajući nove DNA niti koje postaju mete za početnice u sljedećim PCR ciklusima.

Promjena faza svakog ciklusa provodi se promjenom temperature reakcijske smjese (vidi sliku 1).

Riža. 1. Glavni koraci PCR ciklusa

U početku se početnice mogu vezati samo na određenu sekvencu izvorne DNK, ali u sljedećim ciklusima se vežu na kopije ove sekvence sintetizirane u prethodnim ciklusima. U ovom slučaju, količina glavnog PCR produkta (kopije DNA sekvence ograničene početnicama) teoretski se udvostručuje u svakom ciklusu. Ako je u početnom ciklusu u materijalu koji se proučava bio samo jedan ciljni DNK, nakon prvog ciklusa bit će već dvije kopije, nakon dva ciklusa - 4 kopije, rezultat trećeg ciklusa bit će 8 kopija, a trideset- peti - već 68 milijardi primjeraka (slika 2).

Riža. 2. Proces višestrukog kopiranja
Ciljana DNA tijekom sekvencije
mijenjanje ciklusa

Glavna metoda analize produkata reakcije, koja se tradicionalno koristi u mnogim laboratorijima za otkrivanje umnožene DNK i određivanje njezine veličine, je metoda gel elektroforeza nakon čega slijedi bojanje bojom specifičnom za DNK, kao što je etidijev bromid (slika 3).

Kontrola - različiti fragmenti DNA s poznatim brojem svojih sastavnih nukleotida. Poznato je da udaljenost između različitih fragmenata ima logaritamsku ovisnost o njihovoj veličini i masi. Linija 1 - PCR fragmenti od približno 1850 baza su detektirani. Redak 2 i 4 su fragmenti dugi oko 800 baza.

Riža. 3. Analiza produkata reakcije metodom
gel elektroforeza

Linija 3 - željeni fragmenti nisu otkriveni, negativan rezultat reakcije. Linija 5 - višestruke linije nastale su jer su početnice komplementarne s nekoliko fragmenata DNA različitih duljina: oko 550, 800 i 1500 baza.

Unapređenje PCR tehnologije

U početku su za provođenje PCR korištene konvencionalne DNA polimeraze, koje su bile podvrgnute temperaturnoj inaktivaciji u svakom ciklusu u fazi denaturacije DNA. Polimeraza se morala više puta dodavati u reakcijsku smjesu, što je bilo prilično naporno i nije dopuštalo automatizaciju procesa.

Reakcija koristi termostabilan DNA polimeraze koje podnose visoke temperature u svim fazama PCR ciklusa nekoliko desetaka ciklusa. Broj komercijalno dostupnih termostabilnih DNA polimeraza, koje se razlikuju po nekim svojstvima, prilično je velik. Najčešće se koristi Taq polimeraza, izvorno izoliran iz termofilnog mikroorganizma Thermus aquaticus. Druge polimeraze se češće koriste za specifične PCR primjene. Suvremeni komercijalni pripravci termostabilnih polimeraza u pravilu daju stabilnu reproducibilnu aktivnost, što omogućuje korištenje PCR tehnologije u standardnoj laboratorijskoj praksi.

Tehnički dizajn promjene temperature reakcijske smjese također se brzo razvio posljednjih godina. Prvo je provedena PCR pomoću tri vodene kupelji postavljene na različite temperature: za denaturaciju DNA, žarenje primera i polimerizaciju. Epruvete su prenošene iz jedne vodene kupelji u drugu "u krug", zbog čega je dolazilo do promjene temperature u različitim fazama ciklusa. Postojale su i verzije uređaja, gdje se voda različitih temperatura naizmjenično dovodila u vodenu kupelj, u kojoj su se nalazile epruvete s reakcijskom smjesom. Promjena ciklusa u tim je slučajevima trajala dugo, a proces je bilo teško automatizirati. Za provedbu PCR-a uglavnom se koriste instrumenti (termalni cikleri), koji automatski mijenjaju temperaturu na temelju postavljenog programa. U termociklerima se epruvete s reakcijskom smjesom stavljaju u metalni blok čija se temperatura mijenja velikom brzinom, što smanjuje trajanje svakog PCR ciklusa.

Suvremeni termički cikleri prilagođeni su za korištenje specijalnih plastičnih epruveta tankih stijenki za reakcijsku smjesu, što omogućuje ubrzavanje izmjene topline između bloka uređaja i reakcijske smjese te u konačnici dodatno skraćuje vrijeme reakcije.

Tako se standardni PCR može provesti za 1-3 sata.Mnogi uređaji omogućuju programiranje posebnih kompliciranih temperaturnih profila potrebnih za specifične modifikacije PCR procesa.

Paralelno s usavršavanjem PCR tehnologije razvijale su se i metode analize produkata reakcije. metoda gel elektroforeza nakon čega slijedi bojanje bojom specifičnom za DNA, kao što je etidijev bromid, tradicionalno se koristi u mnogim laboratorijima za otkrivanje umnožene DNA i određivanje njezine veličine. Korištenje hibridizacija s unutarnjim DNA sondama omogućuje u nekim slučajevima značajno povećanje osjetljivosti i specifičnosti detekcije PCR proizvoda. Zbog nepostojanja potrebe za pripremom i provođenjem elektroforetskog odvajanja, mogućnosti automatizacije analize velikog broja uzoraka te korištenja neradioaktivnog detekcijskog formata, ova metoda postaje sve češća. U nekim slučajevima, upotreba posebnih fluorescentnih "markera" omogućuje kontrolu provođenja amplifikacije ili detekciju krajnjih proizvoda PCR-a izravno u reakcijskoj epruveti.

Korištenje PCR-a
u medicinskoj mikrobiologiji

Među mnoštvom različitih područja kliničke dijagnostike, medicinska mikrobiologija zauzima možda vodeće mjesto po broju i raznolikosti primjena PCR tehnologije. Uvođenjem ove metode u praksu, uz serološku dijagnostiku, značajno su proširene mogućnosti suvremene kliničke mikrobiologije, koja se još uvijek temelji na metodama izolacije i uzgoja mikroorganizama na umjetnim hranjivim podlogama ili u kulturi stanica.

Mogućnosti i ograničenja tradicionalnog
metode uzgoja

Tradicionalna za mikrobiološke laboratorije, kulturalna dijagnostička metoda, u pravilu, dobro se opravdava za otkrivanje i proučavanje takvih svojstava kao što su osjetljivost na antibiotike, virulencija mikroorganizama koji se lako uzgajaju. Međutim, neki mikroorganizmi (pneumokoki, hemofili, neiserije, mikoplazme, obligatni anaerobi i dr.) mogu biti izrazito osjetljivi na uvjete uzimanja uzoraka kliničkog materijala, transporta i uzgoja, prisutnost posebnih faktora rasta ili su sposobni za razmnožavanje. in vitro samo u kulturi stanica (virusi, klamidije, rikecije).

Spori rast mikroorganizama kao što su mikobakterije i gljivice na umjetnim podlogama još je jedno prirodno ograničenje povezano s uporabom metode kulture za dijagnosticiranje ovih mikroorganizama. Osim toga, rad sa živim kulturama izoliranih patogena, ne samo posebno opasnih, već ponekad i oportunističkih patogena, može predstavljati prijetnju zdravlju laboratorijskog osoblja.

Među uzročnicima ljudskih bolesti poznate su i nekultivirane vrste bakterija, npr Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, i mnoge vrste virusa, uključujući humane papiloma viruse i hepatitis C, čiji su pokušaji uzgoja u kulturi stanica do sada ostali neuspješni. Konačno, čak i uz uspješan uzgoj, postoji potreba za naknadnom identifikacijom izoliranih mikroorganizama.

Tradicionalne mikrobiološke metode identifikacije temelje se na korištenju različitih fenotipskih testova, kao što je detekcija specifične enzimske aktivnosti, sposobnost metaboliziranja šećera ili podržavanje rasta na podlogama sa selektivnim dodacima. Poteškoće standardiziranja uvjeta takvih testova, kao i prirodna fenotipska varijabilnost svojstvena mnogim mikroorganizmima, mogu biti uzrok pogrešne identifikacije.

Korištenje PCR-a za izravnu dijagnozu
i identifikacija patogena
zarazne bolesti

U slučajevima kada je uporaba metoda kulture problematična ili povezana s nedovoljnom dijagnostičkom učinkovitošću, mogućnost zamjene biološke amplifikacije (tj. rasta na umjetnim podlogama) enzimskim udvostručenjem nukleinskih kiselina in vitro sa korištenje PCR-a je posebno privlačno. postojati različiti pristupi na korištenje PCR-a za dijagnostiku uzročnika infekcije. Najčešći tip PCR-a (specifični PCR) uključuje korištenje početnica koje su komplementarne specifičan slijed DNA karakteristika strogo definirane vrste mikroorganizama. Na primjer, PCR amplifikacija specifične regije gena koji kodira glavni protein vanjske membrane (MOMP) Chlamydia trachomatis, u kombinaciji s neradioaktivnom hibridizacijom za detekciju produkata reakcije, omogućuje otkrivanje pojedinačnih kopija klamidijske DNA u ispitivanim uzorcima. U isto vrijeme, PCR je značajno superioran u dijagnostičkoj učinkovitosti u odnosu na uzgoj i metode izravne detekcije klamidijskog antigena (mikroimunofluorescencija i enzimski imunotest), koji se tradicionalno koriste za otkrivanje C. trachomatis.

Također postoji mogućnost korištenja nekoliko pari vrsta specifičnih primera odjednom u jednoj reakcijskoj epruveti za simultano umnožavanje DNA različitih patogena. Ova modifikacija se naziva višestruka PCR. (multipleks PCR). Višestrukom PCR metodom može se utvrditi etiološka uloga različitih mikroorganizama koji uzrokuju određene vrste bolesti. Na primjer, mogućnosti korištenja višestrukog PCR-a za istovremeno otkrivanje dva (C. trachomatis i N. gonorrhoeae s bolestima urogenitalnog trakta) ili čak četiri uzročnika (I. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis i A. otitidis s kroničnim gnojnim otitisom).

Alternativni pristup PCR dijagnostici povezan je s uporabom univerzalnih početnica koje omogućuju amplifikaciju genskih fragmenata prisutnih u svim mikroorganizmima određene taksonomske skupine. Broj vrsta koje se mogu identificirati ovom metodom može se ograničiti kako okvirom malih sustavnih skupina (rod, familija) tako i velikim svojtama na razini reda, razreda, tipa. U potonjem slučaju meta za PCR su najčešće ribosomski geni (16S i 23S rRNA), koji imaju sličnu strukturu u različitim prokariotskim mikroorganizmima.

Korištenje početnica komplementarnih očuvanim regijama ovih gena omogućuje umnožavanje DNA većine bakterijskih vrsta. Rezultirajući PCR ribosomski genski fragmenti mogu se zatim analizirati različitim laboratorijskim metodama za identifikaciju bakterije kojoj pripadaju. Najtočnija metoda "molekularne" identifikacije je određivanje kompletne nukleotidne sekvence (sekvenciranje) umnožene DNA i njezina usporedba s odgovarajućim sekvencama poznatih vrsta.

Unatoč dostupnosti automatiziranih sustava koji koriste opisani princip identifikacije, u praksi se obično koriste manje dugotrajne i skupe metode, koje ipak omogućuju pouzdano otkrivanje određenih razlika u slijedu fragmenata DNA. Najčešće su metode koje se temelje na analizi položaja mjesta cijepanja u DNA restrikcijskim enzimima (RFLP metoda - polimorfizam duljine restrikcijskih fragmenata), ili na određivanju elektroforetske pokretljivosti DNA u jednolančanom obliku (SSCP-metoda jednolančani konformacijski polimorfizam).

PCR pomoću univerzalnih početnica može se koristiti i za identifikaciju mikroorganizama izoliranih u čistoj kulturi i za izravno dijagnosticiranje širokog spektra patogena izravno u kliničkim uzorcima. Međutim, treba napomenuti da je osjetljivost "širokog spektra" PCR-a općenito niža od osjetljivosti testnih sustava "specifičnih za vrstu". Osim toga, PCR s univerzalnim početnicama obično se ne koristi za proučavanje uzoraka koji mogu sadržavati veliki broj različitih mikroorganizama, zbog poteškoća u analizi produkata reakcije dobivenih umnožavanjem DNA različitih vrsta.

Metode molekularne tipizacije
mikroorganizama na temelju PCR-a

PCR se naširoko koristi ne samo za dijagnozu i identifikaciju, već i za tipizaciju podvrsta i analizu genetske povezanosti (klonalnosti) izoliranih sojeva mikroorganizama, osobito pri provođenju epidemioloških studija. U usporedbi s tradicionalnim fenotipskim metodama (bio-, fago- i serotipizacija), genotipizaciju temeljenu na PCR-u karakterizira svestranost, dublja razina diferencijacije, mogućnost korištenja kvantitativnih metoda za procjenu identiteta sojeva te visoka reproduktivnost. Opisane su mnoge metode genotipizacije koje se mogu smatrati izvedenicama PCR tehnologije.

Unatoč raznolikosti metoda PCR tipizacije, većini je zajedničko korištenje gel elektroforeze za odvajanje fragmenata DNA različitih duljina dobivenih iz svakog pojedinog soja. Istodobno, komparativna analiza pojedinih elektroforetskih profila, provedena vizualno ili pomoću računala, omogućuje procjenu stupnja genetske povezanosti proučavanih sojeva.

Korištenje PCR-a za otkrivanje lijekova
otpornost mikroorganizama

Nedavno se PCR sve više koristi za proučavanje različitih svojstava patogenih mikroorganizama, posebno za identifikaciju otpornosti određenih vrsta patogena na određene lijekove. U pravilu, korištenje PCR-a za određivanje osjetljivosti mikroorganizama prikladno je samo u slučajevima kada tradicionalne fenotipske metode nisu primjenjive ili nisu dovoljno učinkovite. Na primjer, definicija osjetljivosti Mycobacterium tuberculosis na lijekove protiv tuberkuloze korištenjem metoda kulture obično traje 4 do 8 tjedana. Osim toga, rezultati fenotipskih testova u takvim slučajevima mogu biti iskrivljeni zbog smanjenja aktivnosti antimikrobnih sredstava tijekom dugotrajnog uzgoja mikroorganizama. Proučavanje molekularnih mehanizama rezistencije na lijekove M. tuberkuloza i nekih drugih patogena omogućio je razvoj metoda temeljenih na PCR-u za brzo otkrivanje genetskih markera otpornosti.

Za takvu analizu obično se koristi DNA ili RNA patogena izoliranog u čistoj kulturi. Međutim, u nekim slučajevima postoji mogućnost izravne PCR analize na otpornost na antibiotike bez prethodnog uzgoja uzročnika. Proučeni uzorak kliničkog materijala koristi se kao izvor ciljne DNA za PCR, a kopirani PCR produkt se analizira kako bi se otkrile mutacije povezane s rezistencijom na antibiotike. Na primjer, razvijena je metoda koja omogućuje korištenje PCR-a za otkrivanje rezistencije patogena na rifampicin kod pacijenata koji boluju od tuberkuloznog meningitisa.

Međutim, postoje prirodna ograničenja za korištenje genetskih metoda za procjenu rezistencije mikroorganizama na lijekove:

Podaci o specifičnim genetskim mehanizmima otpornosti možda neće biti dostupni;

Otpornost na određene lijekove često je povezana s različitim mehanizmima i mutacijama u različitim genima koji neovisno utječu na fenotip.

Na primjer, otpornost Gram-negativnih bakterija na aminoglikozidne antibiotike može biti uzrokovana proizvodnjom različitih enzima koji modificiraju aminoglikozide ili promjenama u propusnosti stanične stijenke. U ovom slučaju, rezultati PCR analize, koji uvijek karakteriziraju strogo definiranu specifičnu regiju DNA, ne mogu poslužiti kao osnova za procjenu osjetljivosti mikroorganizma u cjelini.

Osim toga, nepostojanje međunarodnih standarda i preporuka za korištenje PCR-a za određivanje osjetljivosti na antimikrobne lijekove dodatni je čimbenik koji ograničava mogućnost široke primjene ovog pristupa u praktičnoj dijagnostici.

PCR analiza je moderna i vrlo precizna dijagnostička metoda koja vam omogućuje prepoznavanje uzročnika infekcije, bez obzira na stadij patologije. Danas je ova metoda ispitivanja prepoznata kao najpouzdanija, jer isključuje primanje lažnih podataka zbog visoke razine specifičnosti.

Bit PCR metode

PCR analiza - lančana reakcija polimeraze, koja vam omogućuje opetovano povećanje volumena mikrobnog okruženja i određivanje patogena. Fenomen PCR-a otkrio je u 20. stoljeću američki znanstvenik Kary Mullis, zahvaljujući čemu je značajno smanjeno vrijeme za postavljanje točne dijagnoze, a samim time i liječnici su počeli brže propisivati ​​adekvatne terapijske mjere.

Bit PCR analize je umnožavanje fragmenata DNA patogena dobivenih iz bioloških uzoraka pacijenta (urin, krv, slina i drugi). Ova tehnika omogućuje povećanje određenih dijelova genetskog materijala u umjetnom okruženju uz pomoć posebnih enzima, osim toga, broj proučavanih fragmenata raste do te mjere da ih je moguće vizualno pregledati.

Treba napomenuti da se tijekom PCR analize kopiraju samo određene regije koje imaju važnu ulogu u dijagnostici. Ako su prisutni u tijelu pacijenta u zanemarivoj količini, tada će ih ova analiza moći identificirati.

Tehnika PCR aktivno se koristi u medicinskoj praksi za proučavanje zaraznih i nasljednih bolesti, jer osim jednostavnog povećanja količine genetskog materijala (amplifikacije), omogućuje vam spajanje pojedinačnih fragmenata DNK i uvođenje mutacija, kontrolirajući gene koji izazivaju zabrinutost.

Što otkriva PCR analiza?

PCR analiza naširoko se koristi u raznim područjima medicine. Naravno, najčešće se koristi u ginekologiji i urologiji, ali tehnika je također relevantna za pulmologiju, ftiziologiju, gastroenterologiju, onkologiju i druga područja.

PCR analiza omogućuje vam identificiranje virusa u različitim fazama bolesti, također je u stanju otkriti skrivene ili "uspavane" mikroorganizme koji ne uzrokuju pojavu kliničkih znakova:

• Humani papiloma virus različitih tipova (HPV);
• klamidija;
• Trichomonas;
• Uzročnik gonoreje;
• mikoplazme;
• ureaplazma;
• Gardnerella;
• Candida gljive;
• Microbacterium tuberculosis;
• Virusi hepatitisa A, B i C;
• Helicobacteria;
• herpes virusi;
• Citomegalovirusi (CMV);
• Epstein-Barr virusi.

Prednosti PCR analize

1. Visoka točnost analize: rizik od dobivanja lažno negativnih rezultata je minimalan;
2. Specifičnost tehnike: PCR analiza omogućuje vam izolaciju određenog infektivnog agensa, njegovu vrstu i vrstu;
3. Preosjetljivost: PCR analiza otkriva čak i nekoliko fragmenata DNA mikroorganizma;
4. Mogućnost proučavanja različitih bioloških okruženja tijela;
5. Brzina dobivanja rezultata: mogu se dobiti 4-5 sati nakon postupka;
6. Mogućnost detekcije više mikroorganizama iz jednog uzorka biološkog materijala.

PCR analizu aktivno koriste liječnici različitih specijalnosti, dok su druge dijagnostičke metode potisnute u drugi plan. Treba napomenuti da ovaj postupak omogućuje identifikaciju nositelja infekcije i latentnih oblika bolesti, u kojima nema kliničke manifestacije, ali ti patogeni negativno utječu na opće stanje tijela i njegovu funkcionalnost, a pacijenti predstavljaju opasnost za druge.

Priprema i provođenje PCR analize

Fragmenti DNA mikroorganizama nalaze se u različitim biološkim okruženjima bolesnika. Liječnici sami određuju područja za uzimanje materijala za PCR analizu, koja ovise o vrsti bolesti i njezinoj lokalizaciji. Ako ste se obratili venerologu za identifikaciju spolno prenosivih infekcija (SPI), tada će se ispitati iscjedak iz genitalnih organa (bris ili struganje iz cerviksa, vagine) i uretre, kao i krv i urin.

Herpetične infekcije i mononukleoza dijagnosticiraju se na temelju analize razmaza iz pacijentove usne šupljine. CMV se potvrđuje nakon pretrage urina, cerebrospinalna tekućina. Na odjelu pulmologije uzima se ispljuvak i sadržaj za PCR analizu. pleuralna šupljina. U trudnica, ako se sumnja na intrauterine fetalne infekcije, ispituju se amnionska tekućina i tkiva posteljice.

Kako bi se uklonila mogućnost pogrešnih rezultata i povećala točnost PCR analize, prije predaje biološkog materijala potrebno je slijediti jednostavne preporuke:

• Većina mikroba ispire se urinom, stoga ne biste trebali mokriti prije uzimanja razmaza iz uretre;
• U roku od 3-5 dana, trebali biste se suzdržati od spolnog odnosa;
• PCR analiza se ne provodi odmah nakon prestanka menstrualnog toka, trebate pričekati 5-7 dana;
• 4 sata prije davanja sline potrebno je prestati uzimati lijekove i hranu, a prije zahvata preporuča se ispiranje usta vodom i lagana masaža u području obraza;
• Urin treba skupljati ujutro u sterilnu posudicu, kako bi se izbjegla kontaminacija materijala, potrebno ga je oprati prije uzimanja, ženama staviti sterilni obrisak u rodnicu, a muškarcima povući pregib prepucija što dalje. koliko je moguće;
• Dan prije isporuke materijala morate se suzdržati od pijenja alkohola, začinjene hrane i vrućih postupaka (saune, kupke itd.);
• 2 tjedna prije PCR analize potrebno je prestati uzimati antibakterijska sredstva;
• Prestanite koristiti tjedan dana prije testa intimni gelovi, masti i vaginalni čepići.

Ovo su prilično jednostavna pravila, ali će vam pomoći da dobijete najpouzdanije rezultate i smanjite rizik od pogrešaka u dijagnozi.

Dešifriranje PCR analize

Rezultati PCR testa mogu biti pozitivni ili negativni. Negativan rezultat testa ukazuje na odsutnost infekcije u biološkim materijalima.

Pozitivan nalaz potvrđuje prisutnost mikroorganizama, ali je podatak o njihovom broju neophodan za točnu dijagnozu. Doista, u našem tijelu postoje oportunistički mikrobi koji postaju uzročnici bolesti samo kao rezultat aktivnog rasta i reprodukcije. Na temelju kvantitativnih podataka PCR analize liječnik može odrediti stupanj razvoja patološki proces, svoju aktivnost, odaberite određeni lijek i njegovu dozu.

PCR analiza tijekom trudnoće

Trudnoća je posebno razdoblje u životu svake žene. U ovom trenutku mnoge spolno prenosive bolesti ili latentne infekcije mogu biti izuzetno opasne za bebu i uzrokovati prijevremeni porod, pobačaj, malformacije i razvojne anomalije. Stoga se PCR analiza provodi planski za sve trudnice, uglavnom na rani datumi(do 12 tjedana), ali ponekad se propisuje tijekom 2. tromjesečja.

Materijal se uzima iz cervikalnog kanala i uretre, postupak je bezbolan i ne predstavlja opasnost. U većini slučajeva PCR analiza se provodi na klamidiju, ureaplazme, mikoplazme, citomegalovirus, herpes i HPV. Upravo ti mikroorganizmi predstavljaju prijetnju tijekom trudnoće. Ali ponekad žene prolaze sveobuhvatnu PCR analizu, koja uključuje studiju o velikom broju mikroorganizama (12 ili više).

PCR (lančana reakcija polimerazom) dostignuće je molekularne biologije, jedna od glavnih metoda kliničke laboratorijske dijagnostike kasnog 20. i početka 21. stoljeća, donoseći velika korist u raznim područjima medicinske znanosti.

Dakle, čak i ako među milijunima stanica ljudskog tijela nije izgubljen sam živi virus, već samo čestica njegove DNK, tada će PCR, ako ga ništa ne ometa, vjerojatno nositi sa zadatkom i prijaviti boravak "stranca" s pozitivnim rezultatom. To je bit PCR-a i njegova glavna prednost.

Prednosti i nedostatci

Laboratorij koji provodi PCR dijagnostiku podliježe najvišim zahtjevima u pogledu opreme, test sustava i osposobljenosti medicinskog osoblja. Ovo je visokotehnološki laboratorij koji ima arsenal visokoosjetljivih i visoko specifičnih reagensa, tako da nema posebnih nedostataka. Osim ako daje pozitivan rezultat u odsutnosti kliničkih manifestacija, i time stavlja kliničara pred dilemu: isplati li se započeti liječenje ili ne?

Liječnik koji promatra pacijenta počinje sumnjati u pouzdanost rezultata testa, jer ne vidi nikakve znakove bolesti. Ali ipak, s obzirom na visoku osjetljivost PCR sustava, treba imati na umu da detektira patogen čak iu pretkliničkoj fazi, a pozitivan rezultat u ovom slučaju više je prednost nego nedostatak. Na temelju toga, liječnik mora sam odlučiti o prikladnosti terapije, uzimajući u obzir druge argumente za i protiv.

Prednosti dijagnostike pomoću lančane reakcije polimeraze su očite:

• Visoka specifičnost, dosežući 100%, zbog prisutnosti u odabranom uzorku čestica nukleinske kiseline svojstvenih određenom organizmu, ali stranih ljudima;
• Visoke performanse, budući da je PCR automatizirana tehnika visoke tehnologije koja pruža mogućnost provođenja testiranja na dan uzorkovanja materijala i na taj način oslobađa pacijenta nepotrebnih briga;
• PCR, radeći na jednom uzorku, može provesti nekoliko studija i oko otkriti više patogena ako ona ima takav zadatak. Primjerice, kod dijagnosticiranja klamidijske infekcije, gdje je PCR jedna od glavnih metoda, uz klamidiju se može otkriti i Neisseria (gonokok) - uzročnik. Štoviše, to ne utječe negativno na pouzdanost rezultata;
• PCR testiranje je opasan mikroorganizam trajanje inkubacije kada još nisu imali vremena uzrokovati opipljivu štetu tijelu, tj. rana dijagnoza upozorava na nadolazeći razvoj patološkog procesa, što omogućuje pripremu za njega i potpuno naoružanje.

Osim toga, kako bi se izbjegli nesporazumi koji ponekad nastaju tijekom dijagnostike, PCR se štiti i time što se njegovi rezultati mogu snimiti (fotografija, računalo) kako bi se po potrebi mogli koristiti u stručne svrhe.

Norma u PCR odgovorima smatra se negativnim rezultatom., što ukazuje na odsutnost fragmenata stranih nukleinskih kiselina, pozitivan odgovor će ukazivati ​​na prisutnost infekcije u tijelu, digitalne vrijednosti pokazuju stanje virusa i njegovu koncentraciju u vrijeme testiranja. Međutim, potpuni prijepis analize provodi liječnik koji je prošao posebnu obuku na temu "PCR". Pokušati sami protumačiti rezultate nema smisla, jer je moguće, što će se vjerojatno dogoditi, krivo shvatiti i početi brinuti unaprijed.

Čega se PCR “boji”, što može učiniti i kako se za njega pripremiti?

Kao i kod svake druge studije, ponekad su rezultati testa lažno pozitivni ili lažno negativni gdje PCR nije iznimka. To se može dogoditi u sljedećim slučajevima:

1. Povrede tehnološkog procesa u jednoj od faza reakcije;
2. Nepoštivanje pravila prikupljanja materijala, njegovog skladištenja ili prijevoza;
3. Prisutnost stranih nečistoća u materijalu.

To sugerira da se PCR-u – dijagnostici infekcija mora pristupiti oprezno, oprezno i ​​precizno, jer u suprotnom uzorci materijala mogu promijeniti svoju strukturnu strukturu ili čak propasti.

Faze PCR dijagnostike. Lažni rezultati mogu dati kršenja u bilo kojoj fazi studije

PCR dijagnostika infekcija spada među ostale laboratorijske metode u kategoriju "zlatnog standarda", pa se njome mogu tražiti uzročnici mnogih bolesti koje na prvi pogled nemaju ništa zajedničko:

• Tuberkuloza različita lokalizacija, upala pluća (uključujući atipične, uzrokovane klamidijom);
• Infekcije u djetinjstvu (ospice, rubeola, parotitis, ospice);
• Difterija;
• salmoneloza;
• Zoonotska zarazna bolest - listerioza (bolest je karakterizirana nizom simptoma s oštećenjem limfnih čvorova, središnjeg živčanog sustava, unutarnjih organa);
• Bolesti uzrokovane prodorom Epstein-Barr virusa (infektivna mononukleoza, itd.);
• Onkološka patologija izazvana infekcijom papiloma virusom (HPV i njegove vrste);
• Borrelioza (lajmska bolest, encefalitis koji prenose krpelji);
• Infekcija Helicobacter pylori, čiji je uzročnik mikrob koji živi u ljudskom želucu Helicobacter pylori. Dokazano je da Helicobacter uzrokuje razvoj raka želuca ili dvanaesnika;
• i praktički sve.

Posebno je važna PCR dijagnostika spolno prenosivih infekcija, jer su tako uzrokovane bolesti česte Dugo vrijeme odvijaju se bez ikakvih kliničkih manifestacija, ali tijekom trudnoće počinju se aktivirati i time prijete zdravlju, pa čak i životu djeteta. I ponašati se slično. Neki od njih ("baklja") su istovremeno povezani sa SPI, tako da potonje zahtijevaju detaljnije razmatranje. Čitatelj će se moći upoznati s najpopularnijim metodama u sljedećim odjeljcima članka.

Kako se pravilno pripremiti da biste dobili pouzdan rezultat?

Odmah napominjemo da je priprema za PCR vrlo jednostavna i ne zahtijeva posebne napore od strane pacijenta. Trebate izvršiti samo tri jednostavna zadatka:

1. Nemojte imati spolni odnos 24 sata prije uzimanja testa;
2. Da biste uzeli i analizirali krv iz vene, morate doći na prazan želudac, usput, ne možete ni piti;
3. Urin treba dati noću (ujutro - u sterilnu staklenku kupljenu dan prije u ljekarni).

PCR može raditi u bilo kojem biološkom okruženju

PCR metoda nije "krvoločna", stoga prihvaća svako biološko okruženje koje sadrži sumnjivi infektivni agens. Obično izbor - što trebate poduzeti za istraživanje, ostaje liječniku.

Dakle, u potrazi za patogenom, osim testa krvi (iako je također prikladan iu većini slučajeva uzima se paralelno s drugim materijalom), možete koristiti:

• (iscjedak iz urogenitalnog trakta);
• Struganje sluznice usne šupljine, konjunktiva, nazofarinks, genitalni trakt (kod žena se uzimaju iz cerviksa i vagine, kod muškaraca - iz uretre);
• slina;
• sjeme;
• sok prostate;
• Placentalna tkiva i amnionska tekućina (amnionska tekućina);
• Sediment urina (nakon centrifugiranja), na primjer, za otkrivanje određenih SPI i Mycobacterium tuberculosis;
• Sputum i pleuralna tekućina za istu svrhu;
• eksudati;
• Cerebrospinalna tekućina u slučaju sumnje na zaraznu leziju središnjeg živčanog sustava;
• Biopsijski materijal (biopsija) uzet iz jetre, dvanaestopalačnog crijeva, želuca itd.

Dodao bih navedenom da će u svim slučajevima, čak iu strugotinama i sekretima, biti dovoljno materijala za testiranje, jer PCR testiranje ne zahtijeva velike količine, za analizu je dovoljno nekoliko mikrolitara koji se obično uzimaju u Mikroepruveta tipa Eppendorf i poslana na proučavanje.

Bolesti i primjena PCR-a

HIV i lančana reakcija polimerazom

Obično se kod prolaska anonimnog pregleda u slučaju pozitivnih rezultata imunoblotinga dijagnoza ponovno ponavlja. Ako se dijagnoza potvrdi, pacijentu se propisuju dodatne studije:

1. Utvrđivanje imunološkim reakcijama apsolutnih vrijednosti broja CD 4 limfocita (imunokompetentnih stanica – T-helpera ili pomagača), koje infekcija najprije inficira, nakon čega gube svoja osnovna svojstva i ne mogu razlikovati “ vlastiti” i “strani”. Oni uzimaju RNK virusa koji cirkulira u krvnoj plazmi za normalne stanice organizam i ne reagiraju na njih;
2. Detekcija virusne RNA PCR-om i izračunavanje koncentracije virusnih čestica kako bi se na temelju tih podataka odredio stadij, težina patološkog procesa i prognoza. Naravno, riječ "norma" u tom pogledu ne postoji, jer je reakcija uvijek pozitivna, a dekodiranje digitalnih vrijednosti je u nadležnosti liječnika.

PCR i hepatitis

PCR metoda može otkriti patogene, najčešće se test koristi za dijagnosticiranje hepatitisa C, koji se drugim metodama slabo otkriva.

Virus hepatitisa C (koji sadrži RNA) svojim ponašanjem u ljudskom tijelu nalikuje HIV-u. Uglavivši se u genom jetrenih stanica (hepatocita), on tamo ostaje čekati svoje vrijeme, koje može doći barem za 2 godine, barem za 20 godina, pa su ga liječnici prozvali "nježnim ubojicom". Hepatitis C dovodi do stvaranja malignog procesa u jetrenom parenhimu, koji se manifestira u kasnijim fazama. Imunološki sustav ne primjećuje sve te događaje, pogrešno misleći da je virus hepatocit. Istina, antitijela na virus se proizvode u određenim količinama, ali ne daju pristojan imunološki odgovor. Za dijagnozu hepatitisa C, ELISA nije jako informativan, jer pokazuje da je virus ostavio tragove, ali nije poznato je li ostavio sam sebe. Kod HCV-a poznati su slučajevi samoizlječenja, dok antitijela protiv virusa ostaju i nastavljaju cirkulirati cijeli život (imunološka memorija). PCR je osjetno ispred stvaranja antitijela i može otkriti virusnu česticu već nakon 1-1,5 tjedana, dok se antitijela mogu pojaviti u rasponu od 2 mjeseca do šest mjeseci

PCR dijagnostika u slučaju sumnje na rašireni virus hepatitisa C u ljudskom tijelu je najoptimalnija metoda istraživanja, jer samo ona može prepoznati prisutnost "nježnog neprijatelja" u krvi ili biopsiji jetre pacijenta.

Međutim, ponekad postoje slučajevi kada su AT pozitivni, a PCR rezultat negativan. To se ponekad događa kada je količina virusa vrlo niska ili kada je u stanju mirovanja u jetri bez ulaska u krvotok. Kako bi se ipak došlo do istine, pacijent se ponovno analizira, ili čak više njih.

Infekcija papiloma virusom

Ukoliko ne dođe do samoizlječenja, može se, a da se ne pokaže, dugo zadržati u organizmu domaćina, koji to i ne sluti, budući da PCR nije učinjen, niti je bilo simptoma bolesti. Međutim, prisutnost papilomavirusne infekcije, iako latentna, nije ravnodušna za ljudsko zdravlje, gdje određene vrste virusa koji uzrokuju onkološke bolesti(tipovi 16, 18).

Ženska polovica populacije češće boluje od HPV-a, budući da virus više voli žensko spolno područje, a posebno grlić maternice, gdje neke vrste virusa pridonose razvoju displastičnih procesa, a zatim i raka vrata maternice, ako nije displazija. liječi i virus se oslobađa. Dakle, lančana reakcija polimeraze otkrit će DNK virusa, a zatim pokazati "loš" ili "dobar" (onkogeni ili neonkogeni) tip koji se smjestio u tijelu žene.

Druge SPI i TORCH infekcije

Očito, lančana reakcija polimeraze može pronaći bilo koju stranu strukturu koja se sastoji od nukleinskih kiselina, dakle dati test prikladan je za otkrivanje svih spolno prenosivih bolesti i TORCH infekcija, međutim, ne koristi se uvijek. Zašto, recimo, provoditi tako skupa istraživanja za otkrivanje gonokoka, ako postoje pristupačniji i jeftiniji?

TORCH infekcije i spolno prenosive bolesti toliko su međusobno povezane da je ponekad teško odrediti u koju skupinu treba svrstati određeni uzročnik. Općenito, može ih biti teško razumjeti, budući da se radi o dosta raznolikim skupinama mikroorganizama koji se uvijek mogu spolno prenositi ili samo pod određenim uvjetima (imunodeficijencija), a mogu biti zanimljivi samo tijekom trudnoće, zbog mogućeg negativnog utjecaja na njegov tijek i na plod.

PCR je glavna metoda za otkrivanje latentnih infekcija

Razvoj kliničkih manifestacija temelji se na različitim patogenima, koji se mogu otkriti samo PCR-om, što je njegova glavna zadaća, ponekad zajedno s ELISA-om, a ponekad kao jedini potvrdni test, osobito ako nema simptoma bolesti. Takvu tešku situaciju može stvoriti polimikrobna infekcija, koja osim očitih uzročnika uključuje i oportunističke uzročnike.

Ureaplazma se često vidi u tandemu s mikoplazmom. I to nije slučajno. Ove vrste, poput klamidije, nisu ni virusi ni bakterije, žive unutar stanica i pripadaju SPI, iako njihova prisutnost u zdravo tijelo također nije neuobičajeno. Dakle, kako bi se razlikovao zdrav nositelj od bolesne osobe, potrebne su posebne metode, gdje se PCR smatra najpouzdanijim, jer su, zbog osobitosti strukture i ponašanja ovih mikroorganizama, druge studije neučinkovite.

Što se tiče (tip 1, 2) i, koji također pripada herpes virusima (tip 5), situacija je i ovdje dvosmislena. Stopa zaraženosti svjetske populacije približava se 100%, stoga je u ovom slučaju vrlo važna identifikacija virusa i njegova doza, što je posebno važno tijekom trudnoće, jer za odraslu osobu virus koji se ukorijenio u njegovu tijelo često ne uzrokuje nikakve probleme i ne daje znakove bolesti.

Stoga se takav pregled koji propisuje liječnik ne smije zanemariti, jer je u nekim slučajevima lančana reakcija polimerazom obavezna i neophodna metoda laboratorijske dijagnostike koja može zaštititi ne samo ženu, već i malog, nerođenog čovjeka od ozbiljnih komplikacija.

Zaključno, želio bih napomenuti da tako divna metoda kao PCR služi čovječanstvu više od 30 godina. Istodobno, zadaci testa nisu ograničeni na traženje uzročnika zaraznih bolesti. Lančana reakcija polimeraze, rođena na tlu molekularne biologije, neraskidivo je povezana s genetikom, uspješno se koristi u forenzici za osobnu identifikaciju, u sudskoj medicini za utvrđivanje očinstva, u veterini, ako klinika za životinje ima mogućnost nabave skupe opreme, kao iu drugim područjima (industrija, Poljoprivreda itd.).

Video: PCR - suština i primjena