Imunofluorescencinė reakcija (rifas) arba fluorescencinių antikūnų metodas (MFA). Imunofluorescencinės reakcijos B) netiesioginis tipas
Regioninių limfmazgių punkcija
Oda virš limfmazgių apdorojama 96% alkoholio ir 3-5% alkoholio tirpalas jodo. Tada 1 ir 2 kairės rankos pirštai fiksuoja limfmazgį. Dešine ranka jie paima sterilų švirkštą su keliais lašais izotoninio natrio chlorido tirpalo, kuris įšvirkščiamas lygiagrečiai išilginei limfmazgio ašiai. Adata įvairiomis kryptimis stumiama į priešingą mazgo kapsulės sienelę ir švirkšto turinys lėtai suleidžiamas. Kairės rankos pirštais lengvai masažuojamas limfmazgis. Lėtai ištraukiant adatą, švirkšto stūmoklis tuo pačiu metu pastumiamas į priekį, aspiruojant limfmazgio turinį. Medžiaga uždedama ant stiklinio stiklelio (su nedideliu kiekiu medžiagos įlašinamas lašelis izotoninio natrio chlorido tirpalo), uždengiamas dengiamuoju stiklu. Natūralaus vaisto tyrimas atliekamas tamsiame regėjimo lauke, naudojant šviesos optinį mikroskopą su tamsaus lauko kondensatoriumi (objektyvas 40, 7x, 10x arba 15x). Beicuotuose preparatuose galima rasti ir blyškių treponemų. Dažant pagal Romanovsky-Giemsa, blyškios treponemos nusidažo rožine spalva, pagal Fontaną ir Morozovą – ruda (juoda), pagal Burri metodą, tamsiame fone aptinkamos nedažytos treponemos.Serologinė diagnozė
Sifilio diagnostikoje, gydymo efektyvumo vertinime, gydymo kriterijų nustatymo, latentinių, atsparių formų identifikavimo svarba teikiama standartinėms (klasikinėms) ir specifinėms serologinėms reakcijoms. Standartiniai arba klasikiniai serologiniai tyrimai (SSR) apima:- Wassermano reakcija (RV),
- Kahno ir Sachs-Vitebsky nuosėdinės reakcijos (citocholinė),
- reakcija ant stiklo (ekspresinis metodas),
- Treponema pallidum imobilizacijos reakcija (RIBT),
- imunofluorescencinė reakcija (RIF).
Wassermano reakcija (RV)
- sukūrė A. Wasserman kartu su A. Neisseriu ir C. Brucku 1906 m. Wassermano reakcija pagrįsta komplemento fiksacijos reiškiniu (Borde-Gangu reakcija) ir leidžia nustatyti antilipidinius antikūnus (reaginus). Pagal šiuolaikinės idėjos, Wassermano reakcijoje nustatomi antikūnai prieš makroorganizmo lipidus, o ne blyškią treponemą, o reakcija atskleidžia autoimuninį procesą, kurį sukelia makroorganizmo audinių denatūracija blyškiomis treponemomis, susidarant lipoproteinų kompleksui (konjugatui). lipidai (haptenai) yra determinantas.Paprastai RV dedamas su dviem ar trimis antigenais. Dažniausiai naudojamas labai jautrus kardiolipino antigenas (galvijų širdies ekstraktas, praturtintas cholesteroliu ir lecitinu) ir treponeminis antigenas (anatogeniškai auginamos treponema pallidum suspensija ultragarsu). Kartu su paciento kraujo serumo reaginomis šie antigenai sudaro imuninį kompleksą, galintį adsorbuoti ir surišti komplementą. Vizualiniam susidariusio komplekso (reaginai + antigenas + komplementas) nustatymui kaip indikatorius naudojama hemolizinė sistema (avino eritrocitų mišinys su hemoliziniu serumu). Jei komplementas susijungia 1-oje reakcijos fazėje (reaginai + antigenas + komplementas), hemolizė nevyksta – eritrocitai nusėda į lengvai pastebimas nuosėdas (PB teigiamas). Jei komplementas 1 fazėje neprisijungia dėl to, kad tiriamajame serume nėra reaginų, jį naudos hemolizinė sistema ir įvyks hemolizė (PB neigiama). Hemolizės sunkumo laipsnis, esant RV, įvertinamas pagal pliusus: visiškas hemolizės nebuvimas ++++ arba 4+ (RV staigiai teigiamas); vos prasidėjusi hemolizė +++ arba 3+ (PB teigiamas); reikšminga hemolizė ++ arba 2+ (PB silpnai teigiamas); nesuprantamas hemolizės vaizdas ± (RV abejotina); visiška hemolizė (Wassermann reakcija neigiama).
Be kokybinio RV įvertinimo, yra ir kiekybinė formulė su įvairiais serumo praskiedimais (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Reaginų titras nustatomas pagal maksimalų praskiedimą, kuris vis tiek duoda ryškiai teigiamą (4+) rezultatą. Kiekybinė RV formuluotė yra svarbi diagnozuojant kai kuriuos klinikinės formos sifiline infekcija, taip pat stebint gydymo efektyvumą. Šiuo metu Wasserman reakcija vyksta naudojant du antigenus (kardiolipiną ir treponemalinį Reiterio kamieną). Paprastai RV būna teigiamas 5-6 savaites po užsikrėtimo 25-60% pacientų, 7-8 savaites - 75-96%, 9-19 savaičių - 100%, nors pastaraisiais metais kartais anksčiau ar vėliau. Tuo pačiu metu atsinaujinimo titras palaipsniui didėja ir pasiekia maksimalią vertę (1:160-1:320 ir daugiau), jei atsiranda generalizuoti bėrimai (antrinis šviežias sifilis). Kai RV yra teigiamas, diagnozuojamas pirminis seropozityvus sifilis.
Su antrine šviežia ir antrinio pasikartojančio sifilio, RV yra teigiamas 100% pacientų, tačiau neigiamas rezultatas gali būti stebimas pacientams, kurių imunitetas yra susilpnėjęs ir netinkamai maitinamas. Vėliau reaginų titras palaipsniui mažėja ir antrinio pasikartojančio sifilio atveju paprastai neviršija 1:80-1:120.
Su tretiniu sifiliu RV yra teigiamas 65-70% pacientų ir paprastai stebimas žemas reaginų titras (1:20-1:40). Su vėlyvosiomis sifilio formomis (sifiliu Vidaus organai, nervų sistema) teigiamas RV stebimas 50-80 proc. Reagin titras svyruoja nuo 1:5 iki 1:320.
Su latentiniu sifiliu teigiamas RV stebimas 100% pacientų. Reagino titras yra nuo 1:80 iki 1:640, o sergant vėlyvuoju latentiniu sifiliu – nuo 1:10 iki 1:20. greitas nuosmukis reaginų titras (iki visiško negatyvumo) gydymo metu rodo gydymo efektyvumą.
Wassermann reakcijos trūkumai- jautrumo stoka Pradinis etapas pirminis sifilis neigiamas). Jis taip pat neigiamas 1/3 pacientų, jei jie anksčiau buvo gydomi antibiotikais, pacientams, sergantiems tretiniu aktyviu sifiliu su odos ir gleivinių, osteoartikulinio aparato, vidaus organų, centrinės nervų sistemos pažeidimais, vėlyvuoju įgimtu sifiliu. .
Specifiškumo trūkumas- Wasserman reakcija gali būti teigiama asmenims, kurie anksčiau nesirgo ir neserga sifiliu. Visų pirma, klaidingai teigiami (nespecifiniai) RV rezultatai pastebimi pacientams, sergantiems sistemine raudonąja vilklige, raupsais, maliarija, piktybiniais navikais, kepenų pažeidimais, plačiais miokardo infarktais ir kitomis ligomis, o kartais ir visiškai sveikų žmonių.
Aptinkama trumpalaikė klaidingai teigiama Wasserman reakcija kai kurioms moterims prieš gimdymą ar po gimdymo, žmonėms, kurie piktnaudžiauja narkotikais, po anestezijos, alkoholio vartojimo. Paprastai klaidingai teigiamas RV yra silpnai išreikštas, dažnai su žemu reaginų titru (1:5-1:20), teigiamas (3+) arba silpnai teigiamas (2+). Atliekant masinius serologinius tyrimus, klaidingai teigiamų rezultatų dažnis yra 0,1-0,15%. Kad pašalintų jautrumo trūkumą, jie naudoja nustatymą šaltyje (Collard reakcija) ir tuo pačiu metu nustato kitas serologines reakcijas.
Kahno ir Sachso-Vitebskio nuosėdinės reakcijos
Wasserman reakcija naudojama kartu su dviem nuosėdų reakcijos (Kahnas ir Zaksas-Vitebskis), kurį gaminant paruošiami labiau koncentruoti antigenai. Greitasis metodas (mikroreakcija ant stiklo) - reiškia lipidų reakcijas ir pagrįstas nusodinimo reakcija. Jis dedamas su specifiniu kardiolipino antigenu, kurio 1 lašas sumaišomas su 2-3 lašais tiriamo kraujo serumo į specialios stiklinės plokštelės šulinėlius.Privalumas- atsakymo gavimo greitis (per 30-40 minučių). Rezultatai vertinami pagal nuosėdų kiekį ir dribsnių dydį. Sunkumo laipsnis apibrėžiamas kaip CSR – 4+, 3+, 2+ ir neigiamas. Reikėtų pažymėti, kad klaidingai teigiami rezultatai pastebimi dažniau nei naudojant RV. Paprastai greitasis metodas naudojamas masiniams sifilio tyrimams, atliekant tyrimus klinikinės diagnostikos laboratorijose, somatiniuose skyriuose ir ligoninėse. Remiantis greitojo metodo rezultatais, draudžiama diagnozuoti sifilį, draudžiama jį naudoti nėščioms moterims, donorams, taip pat kontrolei po gydymo.
Treponema pallidum imobilizacijos reakcija (RIBT)
Treponema pallidum imobilizacijos reakcija (RIBT)– 1949 metais pasiūlė R.W.Nelson ir M.Mayer. Tai specifiškiausias sifilio diagnostinis testas. Tačiau nustatymo sudėtingumas ir didelės sąnaudos riboja jo taikymą. Pacientų kraujo serume nustatomi vaizdo specifiniai antikūnai (imobilizinai), kurie, esant komplementui, sukelia blyškių treponemų nejudrumą. Antigenas yra gyva patogeninė treponema pallidum, išskirta iš sifiliu užsikrėtusių triušių. Mikroskopo pagalba suskaičiuojamas imobilizuotų (imobilizuotų) blyškių treponemų skaičius ir įvertinami RIBT rezultatai: blyškių treponemų imobilizacija nuo 51 iki 100% teigiama; nuo 31 iki 50% - silpnai teigiamas; nuo 21 iki 30% - abejotina; nuo 0 iki 20% – neigiamas.RIBT svarbu kada diferencinė diagnostika atskirti klaidingai teigiamas serologines reakcijas nuo sifilio sukeltų reakcijų. Teigiamas tampa vėliau nei RV, RIF ir todėl jis nenaudojamas infekcinėms sifilio formoms diagnozuoti, nors antriniu sifilio periodu jis teigiamas 85-100 proc.
Tretiniu sifilio periodu, kai pažeisti vidaus organai, raumenų ir kaulų sistema bei nervų sistema, RIBT teigiamas 98-100% atvejų. RV dažnai yra neigiamas).
Reikia atsiminti, kad RIBT gali būti klaidingai teigiamas, jei tiriamajame serume yra treponemocidinių vaistų (penicilino, tetraciklino, makrolitų ir kt.), kurie sukelia nespecifinį blyškios treponemos imobilizavimą. Šiuo tikslu kraujas RIBT tiriamas ne anksčiau kaip po 2 savaičių po antibiotikų ir kitų vaistų vartojimo pabaigos.
RIBT, kaip ir RIF, gydymo metu yra lėtai neigiamas, todėl gydymo metu jis nenaudojamas kaip kontrolė.
Imunofluorescencinė reakcija (RIF)
Imunofluorescencinė reakcija (RIF)- sukūrė 1954 m. A. Coons ir pirmą kartą panaudojo sifilinei infekcijai diagnozuoti Deacon, Falcone, Harris 1957 m. RIF yra pagrįstas netiesioginiu fluorescencinių antikūnų nustatymo metodu. Stadymui skirtas antigenas yra audinių patogeninės blyškios treponemos, fiksuotos ant stiklelių, ant kurių užtepamas tiriamasis serumas. Jei tiriamajame serume yra antitreponeminių antikūnų, susijusių su IgM ir IgG, jie stipriai jungiasi su antigenu – treponema, kuri aptinkama fluorescenciniu mikroskopu, naudojant antirūšinį („anti-žmogaus“) fluorescencinį serumą.RIF rezultatai yra atsižvelgiama į blyškios treponemos švytėjimo intensyvumą preparate (geltonai žalias švytėjimas). Jei serume nėra antitreponeminių antikūnų, blyškios treponemos neaptinkamos. Esant antikūnams, nustatomas blyškios treponemos švytėjimas, kurio laipsnis išreiškiamas pliusais: 0 ir 1+ - neigiama reakcija; nuo 2+ iki 4+ – teigiamas.
RIF reiškia grupines treponemines reakcijas ir įdedamas į tiriamojo serumo praskiedimą 10 ir 200 kartų (RIF-10 ir RIF-200). RIF-10 laikomas jautresniu, tačiau nespecifiniai teigiami rezultatai dažnai iškrenta nei naudojant RIF-200 (jo specifiškumas didesnis). Paprastai, RIF tampa teigiamas anksčiau nei RW- teigiamas pirminio seronegatyvaus sifilio atveju 80% pacientų, 100% antriniu sifilio periodu, visada teigiamas latentiniu sifiliu ir 95-100% atvejų vėlyvomis formomis ir įgimtu sifiliu.
RIF specifiškumas padidėja po išankstinio tiriamojo serumo apdorojimo sorbentiniu-ultragarsiniu treponeminiu antigenu, jungiančiu grupinius antikūnus (RIF – abs).
Indikacijos RIBT ir RIF pastatymui- latentinio sifilio diagnozė, siekiant patvirtinti lipidų reakcijų komplekso specifiškumą sifilinės infekcijos atveju, remiantis teigiamu RV. Teigiamas RIBT ir RIF yra latentinio sifilio įrodymas. Klaidingai teigiamas RV sergant įvairiomis ligomis (sistemine raudonąja vilklige, piktybiniai navikai tt) ir jei pakartotiniai RIBT ir RIF rezultatai yra neigiami, tai rodo nespecifinį RV pobūdį. Įtarimas dėl vėlyvųjų sifilinių vidaus organų, raumenų ir kaulų sistemos, nervų sistemos pažeidimų, esant neigiamam RV pacientams. Įtarimas dėl pirminio seronegatyvaus sifilio, kai pakartotinai tiriant erozinius (opinius) išskyras iš paviršiaus, punkcija iš padidėjusių regioninių limfmazgių nenustatoma blyški treponema – šiuo atveju nustatomas tik RIF – 10.
Tiriant asmenis, turinčius neigiamą RV kurie turėjo ilgalaikių seksualinių ir buitinių kontaktų su pacientais, sergančiais sifiliu, atsižvelgiant į tikėtiną galimybę neseniai juos gydyti antisifiliniais vaistais, kurie sukėlė RV neigiamą poveikį. Fermentinis imunosorbentinis tyrimas (ELISA, ELISA – enziminis imunosorbentinis tyrimas) – metodą sukūrė E.Engvall ir kt., S.Avrames (1971). Esmė susideda iš sifilinio antigeno, adsorbuoto ant kietosios fazės nešiklio paviršiaus, derinio su tiriamo kraujo serumo antikūnu ir specifinio antigeno-antikūno komplekso aptikimas naudojant fermentu pažymėtą anti-rūšinį imuninį kraujo serumą. Tai leidžia vizualiai įvertinti ELISA rezultatus pagal substrato spalvos pasikeitimo laipsnį, veikiant fermentui, kuris yra konjugato dalis. Nepatikimi ELISA rezultatai gali atsirasti dėl nepakankamo ingredientų praskiedimo, temperatūros ir laiko režimų pažeidimo, tirpalų pH nenuoseklumo, laboratorinių stiklinių indų užteršimo ir netinkamos nešiklio plovimo technikos.
Pasyvioji hemagliutinacijos reakcija (RPHA)
Siūlomas kaip diagnostinis sifilio tyrimas T. Rathlev (1965.1967), T. Tomizawa (1966). Reakcijos makromodifikacija vadinama TRHA, mikromodifikacija – MHA-TR, automatizuota versija – AMNA-TR, reakcija su polikarbamido makrokapsulėmis vietoj eritrocitų – MSA-TR. RPHA jautrumas ir specifiškumas yra panašus į RIBT, RIF, tačiau RPHA yra mažiau jautrus ankstyvoms sifilio formoms, palyginti su RIF-abs, ir jautresnis vėlyvoms formoms, turintiems įgimtą sifilį. RPGA pateikiama kokybinėmis ir kiekybinėmis versijomis.Serologinių reakcijų kraujo paėmimo technika
RV, RIF, RIBT tyrimams kraujas imamas iš kubitinės venos tuščiu skrandžiu arba ne anksčiau kaip praėjus 4 valandoms po valgio steriliu švirkštu arba viena adata (pagal gravitaciją). Mėginių ėmimo vietoje oda iš anksto apdorojama 70 % alkoholiu. Švirkštą ir adatą reikia nuplauti izotoniniu natrio chlorido tirpalu. 5-7 ml tiriamojo kraujo supilama į švarų, sausą, šaltą mėgintuvėlį. Ant mėgintuvėlio klijuojamas tuščias popierius su paciento pavarde, inicialais, ligos istorijos ar ambulatorinės kortelės numeriu, kraujo paėmimo data. Paėmus kraują, mėgintuvėlis iki kitos dienos dedamas į šaldytuvą, kurio temperatūros režimas +4°+8°C. Kitą dieną serumas nusausinamas tyrimams. Jei kraujas kitą dieną nepanaudotas, serumą reikia nupilti iš krešulio ir laikyti šaldytuve ne ilgiau kaip 1 savaitę. RIBT tyrimui mėgintuvėlis turi būti specialiai paruoštas ir sterilus. Pažeidus kraujo paėmimo tyrimams taisykles, nesilaikant sąlygų gali būti iškraipyti rezultatai.Nerekomenduojama imti kraujo tyrimams po valgio, alkoholio, įvairių vaistai, įvedus įvairias vakcinas, per mėnesinių ciklas tarp moterų.
Ekspreso metodo tyrimams kraujas buvo paimtas iš piršto galiuko, kaip daroma imant AKS, bet kraujas paimamas 1 kapiliaru daugiau. Greitąjį metodą galima atlikti ir su kraujo serumu, gautu venopunkcijos būdu. Jei reikia kraujo tyrimų atokiose laboratorijose, vietoj kraujo galima siųsti sausą serumą (sauso lašo metodas). Norėdami tai padaryti, kitą dieną po kraujo paėmimo serumas atskiriamas nuo krešulio ir įtraukiamas į sterilų 1 ml švirkštą. Tada serumas 2 atskirų apskritimų pavidalu pilamas ant storo 6x8 cm dydžio rašomojo popieriaus (vaško popieriaus arba celofano) juostelės, kurios laisvajame krašte užrašoma tiriamojo pavardė, inicialai ir kraujo paėmimo data. popierius. Serumo popierius saugomas nuo tiesioginių saulės spindulių ir paliekamas kambario temperatūroje iki kitos dienos. Serumas išdžiūsta mažų blizgios gelsvos stiklinės plėvelės apskritimų pavidalu. Po to popieriaus juostelės su džiovintu serumu susukamos kaip farmaciniai milteliai ir siunčiami į laboratoriją, nurodant diagnozę ir kokiu tikslu ji tiriama.
Serologinis atsparumas
Daliai (2% ir daugiau) sifiliu sergančių pacientų, nepaisant visaverčio antisifilinio gydymo, neigiamų serologinių reakcijų sulėtėjimas (nėra) pasibaigus gydymui iki 12 mėnesių ir ilgiau. Yra vadinamasis serologinis atsparumas, kuris pastaraisiais metais buvo dažnai stebimas. Yra serologinio atsparumo formų:- Tiesa(absoliutus, besąlyginis) – būtina atlikti papildomą antisifilinį gydymą, derinant su nespecifine terapija, siekiant padidinti organizmo imunines jėgas.
- Giminaitis- po pilno gydymo blyškios treponemos formuojasi cistos arba L formos, kurios organizme yra mažo virulentiškumo būsenoje ir dėl to papildomas gydymas nekeičia serologinių reakcijų, ypač RIF ir RIBT, rodiklių.
Pseudo pasipriešinimas- po gydymo, nepaisant teigiamų serologinių reakcijų, blyškios treponemos organizme nėra. Organizme nėra antigeno, tačiau toliau gaminasi antikūnai, kurie fiksuojami nustatant serologines reakcijas.
Serologinis atsparumas gali išsivystyti dėl:
- netinkamas gydymas, neatsižvelgiant į ligos trukmę ir stadiją;
- nepakankama dozė, ypač dėl to, kad nebuvo atsižvelgta į pacientų kūno svorį;
- intervalo tarp vaistų vartojimo pažeidimai;
- blyškios treponemos išsaugojimas organizme, nepaisant visaverčio specifinio gydymo, dėl jų atsparumo penicilinui ir kitiems chemoterapiniams vaistams, esant paslėptiems, encistiniams vidaus organų, nervų sistemos pažeidimams, limfmazgiai, kurie yra neprieinami antibakteriniai vaistai(dažnai blyškios treponemos randamos rando audiniuose praėjus daugeliui metų po gydymo pabaigos, limfmazgiuose kartais galima aptikti blyškias treponemas praėjus 3-5 metams po antisifilinio gydymo);
- apsauginių jėgų mažinimas sergant įvairiomis ligomis ir intoksikacijomis (endokrinopatija, alkoholizmas, narkomanija ir kt.);
- bendras išsekimas (valgant mažai vitaminų, baltymų, riebalų).
- palyda nespecifinės ligos vidaus organai, širdies ir kraujagyslių sistemos sutrikimai, reumatas, endokrininės ir nervų sistemos funkcijos sutrikimai, sunkios lėtinės dermatozės, piktybiniai navikai;
- nervų sistemos pažeidimai (sunkūs sužalojimai, smegenų sukrėtimas, psichinė trauma);
- nėštumas lėtinis apsinuodijimas alkoholiu, nikotino vaistais; užkrečiamos ligos(maliarija, tuberkuliozė, virusinis hepatitas, dizenterija, šiltinė, vidurių šiltinė ir pasikartojantis karštligė).
Reakcija pagrįsta tuo, kad imuniniai serumai yra apdorojami fluorochromais (FITC), kurie derinami su antikūnais. Serumai nepraranda savo imuninio specifiškumo. Susidariusiam liuminescenciniam serumui sąveikaujant su atitinkamu antigenu, susidaro specifinis šviesos kompleksas, kuris lengvai matomas liuminescenciniu mikroskopu.
Tiesioginei ir netiesioginei imunofluorescencijai gali būti naudojami įvairūs imunofluorescenciniai serumai. Tiesioginiu būdu kiekvienam mikrobui ruošiami specifiniai fluorescenciniai imuniniai serumai, imunizuojant triušį su nužudyta patogeno kultūra, tada triušio imuninis serumas sujungiamas su fluorochromu (fluoresceino izocianatu arba izotiocianatu). Metodas naudojamas ekspresinei diagnostikai, siekiant nustatyti bakterijų ar virusų antigenus.
Taikant netiesioginį metodą naudojamas nefluorescencinis diagnostinis imuninis serumas (imunizuotas triušis arba sergantis asmuo) ir fluorescencinis serumas, kuriame yra antikūnų prieš diagnostinių serumo rūšių globulinus.
3 darbas
Fermentinis imunologinis tyrimas (IFA)
Plačiai naudojamas su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas (ELISA). Jis pagrįstas tuo, kad baltymai yra stipriai adsorbuojami ant plokštelių, pavyzdžiui, iš polivinilchlorido. Vienas iš labiausiai paplitusių ELISA variantų praktikoje yra pagrįstas to paties specifiškumo fermentu pažymėtų specifinių antikūnų naudojimu. Tirpalas su analizuojamu antigenu pridedamas prie nešiklio su imobilizuotais antikūnais. Inkubacijos metu ant kietosios fazės susidaro specifiniai antigeno-antikūno kompleksai. Tada nešiklis nuplaunamas nuo neprisijungusių komponentų ir pridedami homologiniai antikūnai, pažymėti fermentu, kurie jungiasi prie laisvųjų antigeno valentų kompleksuose. Po antrojo inkubavimo ir pašalinus šių fermentu žymėtų antikūnų perteklių, nustatomas fermentinis aktyvumas ant nešiklio, kurio reikšmė bus proporcinga pradinei tiriamo antigeno koncentracijai.
Kitame ELISA variante tiriamasis serumas pridedamas prie imobilizuoto antigeno. Inkubavus ir pašalinus neprisijungusius komponentus naudojant fermentu pažymėtus antiglobulino antikūnus, nustatomi specifiniai imunokompleksai. Ši schema yra viena iš labiausiai paplitusių nustatant ELISA.
Specifinė tiriamoji medžiaga – specifinio antikūno substratas
antikūnų patogenas su peroksidaze peroksidazei
Ištirtas AGS, paženklintas
serumo peroksidazės substratas, skirtas
Specifinė peroksidazė
Kontrolė:
teigiamas - imuninis serumas, pažymėtas peroksidaze + substratas - 2 šulinėliai;
neigiamas – normalus serumas + substratas – 2 šulinėliai.
Šiuo metu plačiai naudojami serologiniai tyrimai (SR), kuriuose dalyvauja pažymėti antigenai arba antikūnai. Tai apima imunofluorescenciją, radioimuninį tyrimą, fermentų imuninį tyrimą, imunoblotą, srauto citometriją ir elektroninę mikroskopiją.
Jie taikomi:
1) infekcinių ligų serodiagnostikai, t.y. antikūnams nustatyti naudojant žinomų konjuguotų (chemiškai sujungtų) antigenų rinkinį su įvairiomis žymėmis (fermentais, fluorochromo dažais);
2) nustatyti mikroorganizmą ar jo serovarą naudojant standartinius žymėtus diagnostinius antikūnus (greioji diagnostika).
Diagnostiniai serumai ruošiami imunizuojant gyvūnus atitinkamu antigenu, tada imunoglobulinai išskiriami ir konjuguojami su šviečiančiais dažais (fluorochromais), fermentais ir radioizotopais.
Diagnostiniai monokloniniai antikūnai gaunami naudojant hibridines ląsteles, suformuotas sintezės būdu imuninis B-limfocitas su mielomos ląstelėmis. Hibridomos gali greitai daugintis in vitro ląstelių kultūroje ir gaminti imunoglobuliną, būdingą paimtam B-limfocitui.
Pažymėti SR specifiškumu nenusileidžia kitiems SR, o savo jautrumu lenkia visus SR.
Imunofluorescencinė reakcija (RIF)
Kaip etiketė naudojami švytintys fluorochromo dažai (fluoresceino izotiocianatas ir kt.).
Yra įvairių RIF modifikacijų. Greitai – infekcinių ligų diagnostikai – mikrobams ar jų antigenams aptikti tiriamojoje medžiagoje naudojamas RIF pagal Koons.
Pagal Koonsą yra du RIF metodai: tiesioginis ir netiesioginis.
Tiesioginiai RIF komponentai:
1) tiriama medžiaga (išmatos, nosiaryklės išskyros ir kt.);
2) pažymėtas specifinis imuninis serumas, turintis antikūnų prieš norimą antigeną;
3) izotoninis natrio chlorido tirpalas.
Tiriamosios medžiagos tepinėlis apdorojamas pažymėtu antiserumu.
Vyksta AG-AT reakcija. Liuminescencinis mikroskopinis tyrimas zonoje, kurioje yra lokalizuoti AG-AT kompleksai, atskleidžia žymės fluorescenciją (34 pav.).
Komponentai netiesioginis RIF, skirtas greitajai gripo A diagnostikai:
1) tiriamosios medžiagos plovimai iš paciento, kuriam įtariamas gripas, nosiaryklės;
2) specifinis antiserumas su antikūnais prieš A gripo virusą;
3) antiglobulino serumas (AT prieš imunoglobuliną), pažymėtas fluorochromu;
4) izotoninis natrio chlorido tirpalas.
Tiriamos medžiagos tepinėlis pirmiausia apdorojamas imuniniu serumu iki norimo antigeno, o po to - žymėtu antiglobulino serumu.
Imuniniai kompleksai AG-AT – pažymėti AT aptinkami naudojant fluorescencinį mikroskopą.
Netiesioginio metodo privalumas yra tas, kad nereikia ruošti plataus spektro fluorescencinių specifinių serumų, naudojamas tik vienas fluorescencinis antiglobulino serumas.
Dėl serologinė gripo A diagnozė, y., nustatyti antikūnus prieš A gripo virusą kraujo serume, naudojant netiesioginis RIF naudoti gripo diagnostiką (gripo A viruso antigeną). Serodiagnostika virusinės infekcijos daugiausia retrospektyvus ir naudojamas diagnozei patvirtinti bei epidemiologinei analizei.
Su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas (ELISA): konkurencinis metodas (hepatito B viruso HBs-AG nustatymas) ir netiesioginis metodas (serologinė ŽIV infekcijos diagnostika)
Fermentinis imunologinis tyrimas (ELISA)
Kaip etiketė naudojami fermentai: peroksidazė, šarminė fosfatazė ir kt.
Reakcijos indikatorius yra fermentų gebėjimas sukelti spalvų reakcijas, kai jie veikiami atitinkamu substratu. Pavyzdžiui, peroksidazės substratas yra ortofenildiamino (OPD) arba tetrametilbenzidino (TMB) tirpalas.
Plačiausiai naudojami kietosios fazės ELISA (35 pav.), netiesioginiai ir konkurenciniai metodai (36 pav.).
ELISA rezultatus galima įvertinti vizualiai ir matuojant optinį tankį spektrofotometru (ELISA analizatoriumi).
ELISA pranašumai yra šie:
Atsakymo vertinimo metodų paprastumas;
Konjugatų stabilumas;
Lengvai pritaikomas automatizavimui.
Kaip pavyzdžiai pateikti šie ELISA tipai:
A) konkurencinis tipas
Skirta hepatito B viruso (HBs Ag) paviršiaus antigenui aptikti kraujo serume ir plazmoje diagnostikos metu virusinis hepatitas B ir HBs Ag vežimo nustatymas.
Komponentai:
1) tiriamoji medžiaga – serumas arba kraujo plazma;
2) antikūnai prieš HBs Ag, adsorbuoti polistireno mikroplokštelės šulinio paviršiuje;
3) konjugatas – pelės monokloniniai antikūnai prieš HBs Ag, pažymėti peroksidaze;
4) ortofenilendiaminas (OPD) – substratas;
5) fosfato-fiziologinio tirpalo buferis;
6) kontroliniai serumai:
Teigiamas (serumas su HBs Ag);
Neigiamas (serumas be HBs Ag).
Progresas:
2. Inkubavimas 1 valanda 37°C temperatūroje.
3. Šulinių plovimas.
4. Konjugato įvedimas.
5. Inkubavimas 1 valanda 37°C temperatūroje.
6. Šulinių plovimas.
7. OFD įvedimas. Esant HBs Ag, tirpalas duobutėse pagelsta.
8. ELISA apskaita atliekama pagal optinį tankį naudojant fotometrą. Optinio tankio laipsnis bus atvirkščiai proporcingas tiriamo HBs Ag koncentracijai.
Reakcija vyksta trimis etapais:
1. Tirto serumo (plazmos) HBs Ag jungiasi prie šulinėlio paviršiuje adsorbuotų homologinių antikūnų. Susidaro IR AG-AT. (HBs Ag – anti HBs AT).
2. Antikūnai prieš HBs Ag, pažymėti peroksidaze, jungiasi prie likusių laisvųjų HBs Ag determinantų AG-AT komplekse. Susidaro AT-AG žymėto AT kompleksas (anti HBs AT - HBs Ag - anti HBs AT, paženklintas peroksidaze).
3. OPD sąveikauja su AT-AG-AT komplekso peroksidaze ir atsiranda geltonas dažymas.
B) netiesioginis tipas
Tai yra pagrindinė tyrimo reakcija diagnozuojant ŽIV infekciją.
Tikslas: Serologinė diagnozėŽIV infekcija – antikūnų prieš ŽIV antigenus nustatymas.
Komponentai:
1) tiriamoji medžiaga – kraujo serumas (AB iki AG-m ŽIV);
2) sintetiniai peptidai, imituojantys 2 ŽIV antigenus: gp 120 ir gp 41, adsorbuoti polistireno šulinio paviršiuje;
3) peroksidaze pažymėtas antiglobulino serumas, gautas imunizuojant triušius žmogaus globulinais (AT į AT);
5) fosfatiniu buferiniu tirpalu;
6) kontroliniai serumai:
teigiamas;
Neigiamas.
Progresas:
1. Kontrolinio ir tiriamojo serumo įvedimas.
2. Inkubavimas 30 minučių 37°C temperatūroje.
3. Skalbimas.
4. Fermentais pažymėto antiglobulino serumo įvedimas.
5. Inkubavimas 30 minučių 37°C temperatūroje.
6. Skalbimas.
7. OFD įvedimas.
Reakcija vyksta 3 etapais:
1. Tirto serumo antikūnai prieš ŽIV jungiasi prie homologinių antigenų (gp 120 ir gp 41), o sorbento paviršiuje susidaro IR AG-AT (ŽIV AG - AT to ŽIV).
2. Peroksidaze paženklinto IC AG-AT-AT susidarymas, nes Tirto serumo antikūnai yra antiglobulino serumo antigenai.
3. OPD sąveikauja su AG-AT-AT komplekso peroksidaze ir šulinėlio tirpalas nusidažo geltonai. Fermentinio aktyvumo laipsnis yra tiesiogiai proporcingas tiriamų antikūnų koncentracijai.
Imunofluorescencinė reakcija – RIF (Koonso metodas).Yra trijų tipų tiesioginis metodas, netiesioginis metodas, su komplementu. Koonso reakcija yra greitas diagnostikos metodas mikrobų antigenams arba antikūnams aptikti.
Tiesioginis RIF metodas pagrįstas tuo, kad audinių antigenai arba mikrobai, apdoroti imuniniais serumais su fluorochromais paženklintais antikūnais, gali švyti fluorescencinio mikroskopo UV spinduliuose. Bakterijos tepinėlyje, apdorotos tokiu liuminescenciniu serumu, švyti išilgai ląstelės periferijos žalio krašto pavidalu.
Netiesioginis RIF metodas susideda iš antigeno-antikūno komplekso identifikavimo naudojant
antiglobulino (anti-antikūno) serumas, pažymėtas fluorochromu. Norėdami tai padaryti, tepinėliai iš mikrobų suspensijos apdorojami antimikrobinio triušio diagnostinio serumo antikūnais. Tada mikrobų antigenų nesurišti antikūnai nuplaunami, o ant mikrobų likę antikūnai aptinkami apdorojant tepinėlį antiglobulino (anti-triušio) serumu, paženklintu.
fluorochromai. Dėl to susidaro kompleksinis mikrobas + antimikrobiniai triušio antikūnai + anti-triušio antikūnai, pažymėti fluorochromu. Šis kompleksas stebimas fluorescencinėje lempoje
mikroskopu, kaip ir tiesioginiu būdu.
23. Fermentinis imunologinis tyrimas Ingredientai, formuluotė, apskaita, įvertinimas. Naudojimo sritys.
I Radioimuninis tyrimas.
Radioimuninis metodas arba analizė (RIA) yra labai jautrus metodas, pagrįstas antigeno ir antikūno reakcija naudojant antigenus arba antikūnus, paženklintus radionuklidu (125J, 14C, 3H, 51Cr ir kt.). Po jų sąveikos susidaręs radioaktyvus imuninis kompleksas yra atskiriamas ir jo radioaktyvumas nustatomas atitinkamame skaitiklyje (beta arba gama spinduliuotė). Spinduliuotės intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas surištų antigenų ir antikūnų molekulių skaičiui.
pridėkite paciento serumą, antiglobulino serumą, pažymėtą fermentu, ir fermento substratą / chromogeną.
II. Nustatant antigeną, antigenas (pavyzdžiui, kraujo serumas su norimu antigenu) įvedamas į šulinėlius su sorbuotais antikūnais, įvedamas prieš jį diagnostinis serumas ir antriniai antikūnai (prieš diagnostinį serumą), pažymėti fermentu, ir tada fermento substratas/chromogenas.
24. Imuninės lizės reakcijos, taikymas. Komplemento surišimo reakcija. Ingredientai, formulavimas, apskaita, vertinimas. Taikymas.
Komplemento fiksavimo reakcija (RCC) susideda iš to, kad kai antigenai ir antikūnai atitinka vienas kitą, jie sudaro imuninį kompleksą, prie kurio komplementas (C) yra prijungtas per antikūnų Fc fragmentą, o komplementą jungia antigenas-antikūnas. kompleksas. Jei antigeno-antikūno kompleksas nesusidaro, komplementas lieka laisvas. RSK vykdoma dviem etapais 1 fazė - mišinio, kuriame yra antigenas + antikūnas + komplementas, inkubavimas, 2 fazė (indikatorius) - laisvo komplemento nustatymas mišinyje, pridedant prie jo hemolizinę sistemą, susidedančią iš avino eritrocitų ir hemolizinio serumo, kuriame yra antikūnų. jiems. 1-oje reakcijos fazėje, kai susidaro antigeno-antikūno kompleksas, įvyksta komplemento surišimas, o vėliau 2-oje fazėje antikūnais įjautrintų eritrocitų hemolizė nevyksta (reakcija teigiama). Jei antigenas ir antikūnas nesutampa (tiriamame mėginyje nėra antigeno ar antikūno), komplementas lieka laisvas ir 2-oje fazėje prisijungs prie eritrocitų-antieritrocitų antikūnų komplekso, sukeldamas hemolizę (neigiamą reakciją).
25. Ląstelinio imuninio atsako formavimosi dinamika, jo apraiškos. Imunologiniai
atmintis.
Imuninis ląstelių atsakas (CIO) yra sudėtinga daugiakomponentė imuninės sistemos reakcija, kurią sukelia svetimas antigenas (T-ląstelių epitopai). Įgyvendina imuniteto T sistema. KIO etapai
1. APC Antigen Capture
2. Procesorius. AG proteasomose.
3. Sudėtinio peptido + MHC I ir II klasės susidarymas.
4. Papildykite transportavimą į APC membraną.
5. Komplemento atpažinimas, kurį atlieka AG specifiniai T pagalbininkai 1
6. APC ir T-pagalbininkų 1 aktyvinimas, IL-2 ir gama-interferono išsiskyrimas E-pagalbininkų1. Proliferacija ir diferenciacija nuo AG priklausomų T-limfocitų srityje.
7. Skirtingų populiacijų subrendusių T-limfocitų ir atminties T-limfocitų susidarymas.
8. Subrendusių T limfocitų sąveika su AH ir galutinio efektoriaus realizavimas.
KIO apraiškos:
antiinfekcinis AI:
antivirusinis,
antibakterinis (tarpląstelėje esančios bakterijos);
IV ir I tipo alergijos;
priešnavikinis IO;
persodinti AI;
imunologinė tolerancija;
imunologinė atmintis;
autoimuniniai procesai.
26. T-limfocitų reguliacinių ir efektorinių subpopuliacijų apibūdinimas. Pagrindinis
žymekliai. T-ląstelių receptorius (TCR). Genetinė TCR įvairovės kontrolė
T-limfocitai yra antra svarbi limfocitų populiacija, kurios pirmtakai susidaro kaulų čiulpai o paskui migruoti tolimesniam brendimui ir
diferenciacija į užkrūčio liauką (pavadinimas „T-limfocitas“ atspindi priklausomybę nuo užkrūčio liaukos, kaip pagrindinė ankstyvojo brendimo stadijos vieta).
Pagal biologinio aktyvumo spektrą T-limfocitai yra reguliuojamosios ir efektorinės ląstelės, užtikrinančios imuniteto T sistemos adaptacinę funkciją. Jie negamina antikūnų molekulių. TCR yra membraninė molekulė, kuri skiriasi nuo HCR, tačiau yra struktūriškai ir funkciškai panaši į antikūnus.
TCR – specifinis AG. receptorius. Tai pagrindinė Ig superšeimos molekulė. Jį sudaro 3 dalys: supramembraninė, membraninė ir citoplazminė. TCR uodegą sudaro 2 rutulinės alfa ir beta molekulės, turinčios kintamus ir pastovius domenus (Vα ir Vβ, Сα ir Сβ).
Vα ir Vβ sudaro aktyvų TCR kompleksą. Yra 3 hiperkintamieji regionai – pastovūs deterministiniai regionai (CDO). KDO funkcija yra T ląstelių peptidų atpažinimas ir surišimas, t.y. AG lemiančios grupės. TCR tvirtai sėdi ant ląstelės ir jos citoplazminė uodega, citoplazminė dalis, dalyvauja vykdant inf. Branduolys jo sąveikos su AG metu. Maždaug 90% TCR. Jie turi alfa ir beta grandines, o maždaug 10% - gama ir delta grandines.
TCR yra genetiškai užkoduotas. α ir γ grandines, analogiškai su IG lengvosiomis grandinėmis, koduoja V, G ir C genai, o β ir δ, pagal analogiją su IG sunkiosiomis grandinėmis, V, G, E. α ir γ 7 chromosomoje, o β ir δ 14 chromosomoje.
CD-3 receptorius yra papildoma struktūra, Ig molekulė. Jį sudaro 3 transmembraniniai baltymai: εδ, εγ ir dimer-zeta., supramembraninis, vembraninis ir citozolinis uodega. Jie sudaro vieną kompleksą su TCR, kuris užtikrina specifinių AG signalų perdavimą ląstelės branduoliui.
CD4 ir CD8. Jie išreiškiami kartu su TCR arba atskirai nuo jo. Jie atlieka koreceptorių funkciją. Jie sustiprina sukibimą su AG pateikiančia ląstele. Jie užtikrina specifinio AG signalo laidumą ląstelės branduoliui.
T-limfocitai skirstomi pagal atpažinimo tipą, MOLEKULĖ:
CD4 rec. Peptidas MHC 2 klasė
CD8 peptidas + MHC 1 klasė
Pagrindinių T-limfocitų subpopuliacijų charakteristikos: T-limfocitų populiacija gali būti suskirstyta į tris klases:
A. Pagalbininkai, PHT efektoriai (CD 4+) ir citotoksiniai slopintuvai (CD 8+);
B. Nestimuliuotos (CD 45 RA+) ir atminties ląstelės (CD 45 RO+);
C. 1 tipas – (IL-2, INF-gama, TNF-beta gaminantis);
2 tipas – (gamina IL-4, IL-5, IL-6, IL9, IL 10).
Pirmą kartą pasiūlė Coombs 1942 m. RIF pagrįstas antigenų aptikimu klinikinėje medžiagoje, kraujo ląstelių preparatuose ir kt. naudojant monokloninius antikūnus arba fluorochromu pažymėtus serumus (tiesioginis RIF). Pirmieji (diagnostiniai) antikūnai gali būti aptikti naudojant anti-imunoglobulino serumą, pažymėtą fluorochromais (netiesioginis RIF). Yra RIF modifikacijų, leidžiančių aptikti antikūnus prieš infekcinius agentus kraujo serume arba antikūnus kraujo serume.
RIF populiarumą lemia jo ekonomiškumas, buvimas Didelis pasirinkimas diagnostikos rinkiniai, greitas atsakymas. Šiandien šioje reakcijoje naudojami ir polikloniniai serumai, ir monokloniniai antikūnai, pažymėti fluoresceino izotiocianatu (FITC). Siekiant sumažinti nespecifinę fono liuminescenciją, preparatai apdorojami galvijų serumo albuminu, pažymėtu rodaminu arba Evanso mėlyna spalva.
Dažniausiai RIF naudojamas norint greitai aptikti patogeną patologinėje medžiagoje. Šiuo atveju iš tiriamosios medžiagos ant stiklelio paruošiamas tepinėlis, kaip ir atliekant įprastą mikroskopiją. Preparatas fiksuojamas metilo alkoholiu, acetonu ar kitu cheminiu fiksatoriumi. Fiksuoto tepinėlio paviršiuje užtepami FITC žymėti serumai arba monokloniniai antikūnai (esant netiesioginiam RIF, vaistas pirmiausia apdorojamas serumu prieš norimą antigeną, o po to – žymėtais antikūnais prieš pirmajame etape naudotus imunoglobulinus). Kadangi RIF yra nevienalytės analizės rūšis, vienas etapas yra atskirtas nuo kito plaunant.
Reakcijos rezultatai apskaitomi naudojant fluorescencinį mikroskopą optinė sistema kuriame sumontuotas šviesos filtrų rinkinys, suteikiantis preparato apšvietimą tam tikro bangos ilgio ultravioletine arba mėlynai violetine šviesa. Tyrėjas įvertina švytėjimo pobūdį, objektų formą, dydį ir jų santykinę padėtį.
Nustatant RIF antikūnams aptikti, paruošiami tepinėliai iš etaloninės patogeno padermės. Tiriamasis serumas tepamas ant tepinėlio. Jei jame yra norimų antikūnų, jie jungiasi su mikrobų ląstelių antigenais. Preparatą plaunant buferiniu tirpalu pašalinami neprisirišę antikūnai. Tada vaistas apdorojamas žymėtu serumu prieš žmogaus imunoglobulinus. Esant teigiamam reakcijos rezultatui, atliekant tepinėlio mikroskopiją fluorescenciniu mikroskopu, stebimas specifinis etaloninės kultūros švytėjimas.
Pagrindinis RIF trūkumas yra jo subjektyvumas.
Klasikiniai šios reakcijos specifiškumo kriterijai yra šie:
būdinga patogeno morfologija, dydis ir vieta tepinėlyje;
periferinis objekto švytėjimo pobūdis;
fluorescencinė spalva;
fluorescencijos intensyvumas.
Tiriant didelius objektus (Trichomonas, žmogaus ląsteles, bakterijų ar virusų paveiktas ląsteles), šie kriterijai leidžia gauti patikimą rezultatą. Tuo pačiu metu elementarių chlamidijų ir mikoplazmų kūnų dydis yra ties liuminescencinio mikroskopo skiriamosios gebos riba. Tuo pačiu metu sunku įvertinti mikroorganizmų morfologiją, o liuminescencija praranda periferinį pobūdį. Likusių kriterijų akivaizdžiai nepakanka, kad būtų galima patikimai identifikuoti pastebėtą mikroorganizmą. Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta, subjektyvus atsižvelgimo į reakciją pobūdis kelia specialius reikalavimus tyrimą atliekančio personalo kvalifikacijai.
2.2. Laiko nustatymo fluorescencinis imunologinis tyrimas (FIA BP, Etkins R. ir Wallac O., 1984)
Šio tipo FIA remiasi vieno iš reagentų sorbcijos ant kietosios fazės principais ir „sandwich“ technologijos panaudojimu, t.y. dvigubas atpažinimas, panašus į ELISA. Tačiau svarbus metodo skirtumas yra lantanido chelatų (retųjų žemių elementų europio, samariumo, terbio ir disprozio) naudojimas kaip etiketė. FIA VR pranašumai yra didelis jautrumas, ELISA tipo nustatymo technologija ir galimybė žymiai pagerinti naudingą signalą dėl labai didelio signalo ir triukšmo santykio. Specifinė fluorescencinė etiketė fluorescuoja neišmatuojamai stipriau ir ilgiau nei foninė fluorescencija. Be to, etiketė turi galimybę atkurti galimybę švytėti (apskaitai naudojama impulsinė sužadinimo spinduliuotė su 1 s periodu - naudojama daugiau nei 1000 impulsų), dėl ko kaupiasi (sustiprinamas) naudingas signalas. Aprašytą sistemą įdiegė PerkinElmer, JAV, pavadinimu Delfia ir jos jautrumas yra didesnis nei 10-17 M nustatant antigenus.
2.3. Srauto citometrija
