Reakcija imunofluorescencije (greben) ili metoda fluorescentnih antitijela (MFA). Reakcije imunofluorescencije B) neizravni tip
Punkcija regionalnih limfnih čvorova
Koža iznad limfnih čvorova tretira se 96% alkoholom i 3-5% otopina alkohola jod. Zatim 1 i 2 prsta lijeve ruke fiksirajte limfni čvor. Desnom rukom uzima se sterilna štrcaljka s nekoliko kapi izotonične otopine natrijeva klorida koja se ubrizgava paralelno s uzdužnom osi limfnog čvora. Igla se gura u različitim smjerovima do suprotne stijenke kapsule čvora i polako se ubrizgava sadržaj štrcaljke. Prstima lijeve ruke lagano se masira limfni čvor. S polaganim izvlačenjem igle, klip štrcaljke se istovremeno pomiče napred, aspirirajući sadržaj limfnog čvora. Materijal se nanese na predmetno staklo (uz malu količinu materijala doda se kap izotonične otopine natrijevog klorida), prekrije pokrovnim staklom. Proučavanje nativnog lijeka provodi se u tamnom vidnom polju pomoću svjetlosno-optičkog mikroskopa sa kondenzatorom tamnog polja (objektiv 40, 7x, 10x ili 15x). Blijede treponeme mogu se naći i u obojenim preparatima. Kada se boje prema Romanovsky-Giemsi, blijede treponeme su obojene ružičasto, prema Fontanu i Morozovu u smeđu (crnu), prema metodi Burri, neobojene treponeme se otkrivaju na tamnoj pozadini.Serološka dijagnostika
Značaj u dijagnozi sifilisa, procjeni učinkovitosti liječenja, utvrđivanju kriterija za izlječenje, identifikaciji latentnih, rezistentnih oblika daje se standardnim (klasičnim) i specifičnim serološkim reakcijama. Standardni ili klasični serološki testovi (SSR) uključuju:- Wassermanova reakcija (RV),
- sedimentne reakcije Kahna i Sachs-Vitebskog (citoholna),
- reakcija na staklo (ekspresna metoda),
- reakcija imobilizacije blijede treponeme (RIBT),
- reakcija imunofluorescencije (RIF).
Wassermanova reakcija (RV)
- razvio A. Wasserman zajedno s A. Neisserom i C. Bruckom 1906. godine. Wassermanova reakcija temelji se na fenomenu fiksacije komplementa (Borde-Ganguova reakcija) i omogućuje određivanje antilipidnih protutijela (reagina). Prema moderne ideje, u Wassermanovoj reakciji utvrđuju se antitijela na lipide makroorganizama, a ne na blijedu treponemu, a reakcija otkriva autoimuni proces koji nastaje denaturacijom tkiva makroorganizma od strane blijede treponeme uz stvaranje lipoproteinskog kompleksa (konjugata), u kojem lipidi (hapteni) su odrednica.Obično se RV postavlja s dva ili tri antigena. Najčešće se koriste visoko osjetljivi kardiolipinski antigen (ekstrakt goveđeg srca obogaćen kolesterolom i lecitinom) i treponemski antigen (sonicirana suspenzija anatogeno uzgojene treponeme pallidum). Zajedno s reaginima pacijentovog krvnog seruma, ti antigeni tvore imunološki kompleks sposoban za adsorpciju i vezanje komplementa. Za vizualno određivanje formiranog kompleksa (reagini + antigen + komplement) kao indikator se koristi hemolitički sustav (mješavina eritrocita ovna s hemolitičkim serumom). Ako se u 1. fazi reakcije veže komplement (reagini + antigen + komplement) ne dolazi do hemolize – eritrociti se talože u lako uočljiv precipitat (PB pozitivni). Ako se komplement ne veže u fazi 1 zbog odsutnosti reagina u ispitivanom serumu, hemolitički sustav će ga iskoristiti i doći će do hemolize (PB negativan). Stupanj ozbiljnosti hemolize u postavljanju RV procjenjuje se plusima: potpuna odsutnost hemolize ++++ ili 4+ (RV oštro pozitivan); jedva započeta hemoliza +++ ili 3+ (PB pozitivan); značajna hemoliza ++ ili 2+ (PB slabo pozitivan); nerazumljiva slika hemolize ± (DV sumnjiv); potpuna hemoliza - (Wassermannova reakcija je negativna).
Osim kvalitativne procjene RV postoji i kvantitativna formulacija s različitim razrjeđenjima seruma (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titar reagena određen je maksimalnim razrjeđenjem, koje još uvijek daje oštro pozitivan (4+) rezultat. Kvantitativna formulacija RV važna je u dijagnozi nekih klinički oblici sifilitičke infekcije, kao i pri praćenju učinkovitosti liječenja. Trenutno se Wassermanova reakcija postavlja s dva antigena (kardiolipin i treponemal sondirani Reiter soj). U pravilu, RV postaje pozitivan 5-6 tjedana nakon infekcije u 25-60% pacijenata, 7-8 tjedana - u 75-96%, 9-19 tjedana - u 100%, iako u posljednjih godina ponekad prije ili kasnije. Istodobno, titar reagina postupno raste i doseže maksimalnu vrijednost (1: 160-1: 320 i više) u slučaju pojave generaliziranih osipa (sekundarni svježi sifilis). Kada je RV pozitivan, postavlja se dijagnoza primarnog seropozitivnog sifilisa.
Sa sekundarnim svježim i sekundarnog rekurentnog sifilisa, RV je pozitivan u 100% pacijenata, ali se negativan rezultat može primijetiti u imunokompromitiranih pothranjenih pacijenata. Zatim se titar reagina postupno smanjuje i kod sekundarnog rekurentnog sifilisa obično ne prelazi 1:80-1:120.
S tercijarnim sifilisom RV je pozitivan u 65-70% bolesnika i obično se opaža nizak titar reagina (1:20-1:40). S kasnim oblicima sifilisa (sifilis unutarnji organi, živčani sustav) pozitivan RV se opaža u 50-80% slučajeva. Titar reagina kreće se od 1:5 do 1:320.
S latentnim sifilisom pozitivan RV se opaža u 100% pacijenata. Titar reagina je od 1:80 do 1:640, a kod kasnog latentnog sifilisa od 1:10 do 1:20. brzo opadanje titar reagina (do potpune negativnosti) tijekom liječenja ukazuje na učinkovitost liječenja.
Nedostaci Wassermannove reakcije- nedostatak osjetljivosti početno stanje primarni sifilis negativan). Također je negativan u 1/3 bolesnika, ako su u prošlosti bili liječeni antibioticima, u bolesnika s tercijarnim aktivnim sifilisom s lezijama kože i sluznica, koštano-zglobnog aparata, unutarnjih organa, središnjeg živčanog sustava, s kasnim kongenitalnim sifilisom .
Nedostatak specifičnosti- Wassermanova reakcija može biti pozitivna kod osoba koje prethodno nisu bile bolesne i ne boluju od sifilisa. Konkretno, lažno pozitivni (nespecifični) rezultati RV uočeni su u bolesnika koji boluju od sistemskog eritemskog lupusa, lepre, malarije, malignih neoplazmi, oštećenja jetre, opsežnog infarkta miokarda i drugih bolesti, a ponekad i potpuno zdravi ljudi.
Otkriva se kratkotrajna lažno pozitivna Wassermanova reakcija kod nekih žena prije ili poslije poroda, kod osoba koje zlorabe droge, nakon anestezije, uzimanja alkohola. U pravilu je lažno pozitivan RV slabo izražen, često s niskim titrom reagina (1:5-1:20), pozitivan (3+) ili slabo pozitivan (2+). Kod masovnih seroloških pretraga učestalost lažno pozitivnih rezultata je 0,1-0,15%. Za prevladavanje nedostatka osjetljivosti koriste postavljanje na hladno (Collardova reakcija), a istodobno se postavlja s drugim serološkim reakcijama.
Sedimentne reakcije Kahna i Sachs-Vitebskog
Wassermanova reakcija koristi se u kombinaciji s dvije sedimentne reakcije (Kahn i Zaks-Vitebsky), tijekom čije proizvodnje se pripremaju koncentriraniji antigeni. Ekspresna metoda (mikroreakcija na staklu) - odnosi se na lipidne reakcije i temelji se na reakciji taloženja. Stavlja se sa specifičnim kardiolipinskim antigenom, čija se 1 kap pomiješa s 2-3 kapi proučavanog krvnog seruma u jažice posebne staklene ploče.Prednost- brzina dobivanja odgovora (za 30-40 minuta). Rezultati se vrednuju prema količini taloga i veličini pahuljica. Ozbiljnost je definirana kao CSR - 4+, 3+, 2+ i negativno. Valja napomenuti da se lažno pozitivni rezultati opažaju češće nego kod RV. Ekspresna metoda se u pravilu koristi za masovne preglede sifilisa, tijekom pregleda u kliničkim dijagnostičkim laboratorijima, somatskim odjelima i bolnicama. Na temelju rezultata ekspresne metode zabranjena je dijagnoza sifilisa, isključena je njegova uporaba kod trudnica, donatora, a također i za kontrolu nakon liječenja.
Reakcija imobilizacije treponeme pallidum (RIBT)
Reakcija imobilizacije treponeme pallidum (RIBT)- predložili su 1949. R.W.Nelson i M.Mayer. To je najspecifičnija dijagnostička pretraga za sifilis. Međutim, složenost i visoka cijena postavljanja ograničava njegovu primjenu. U krvnom serumu pacijenata određuju se video-specifična antitijela (imobilizini), koja dovode do nepokretnosti blijedih treponema u prisutnosti komplementa. Antigen je živa patogena treponema pallidum izolirana iz kunića zaraženih sifilisom. Uz pomoć mikroskopa broji se broj imobiliziranih (imobiliziranih) blijedih treponema i ocjenjuju se rezultati RIBT: imobilizacija blijedih treponema od 51 do 100% je pozitivna; od 31 do 50% - slabo pozitivno; od 21 do 30% - sumnjivo; od 0 do 20% - negativno.RIBT je važno kada diferencijalna dijagnoza razlikovati lažno pozitivne serološke reakcije od reakcija uzrokovanih sifilisom. Postaje pozitivan kasnije od RV, RIF i stoga ne koristi se za dijagnosticiranje zaraznih oblika sifilisa, iako je u sekundarnom razdoblju sifilisa pozitivan u 85-100% bolesnika.
U tercijarnom razdoblju sifilisa s oštećenjem unutarnjih organa, mišićno-koštanog sustava i živčanog sustava, RIBT je pozitivan u 98-100% slučajeva ( RV je često negativan).
Mora se imati na umu da RIBT može biti lažno pozitivan ako su u ispitivanom serumu prisutni treponemocidni lijekovi (penicilin, tetraciklin, makroliti itd.), koji uzrokuju nespecifičnu imobilizaciju blijedog treponema. U tu svrhu, krv za RIBT ispituje se najranije 2 tjedna nakon završetka uzimanja antibiotika i drugih lijekova.
RIBT, kao i RIF, polako je negativan tijekom liječenja, pa se ne koristi kao kontrola tijekom liječenja.
Reakcija imunofluorescencije (RIF)
Reakcija imunofluorescencije (RIF)- razvio ga je 1954. A. Coons, a prvi su ga koristili za dijagnosticiranje sifilitične infekcije Deacon, Falcone, Harris 1957. RIF se temelji na neizravnoj metodi za određivanje fluorescentnih protutijela. Antigen za određivanje stadija su tkivno patogene blijede treponeme fiksirane na stakalce, na koje se nanosi ispitivani serum. Ako se u testiranom serumu nalaze antitreponemska protutijela koja se odnose na IgM i IgG, ona se snažno vežu za antigen - treponemu, što se detektira pod fluorescentnim mikroskopom pomoću antispecialnog ("antihumanog") fluorescentnog seruma.Rezultati RIF-a uzimaju se u obzir intenzitetom sjaja blijede treponeme u preparatu (žuto-zeleni sjaj). U nedostatku anti-treponemalnih protutijela u serumu, blijede treponeme se ne otkrivaju. U prisutnosti protutijela otkriva se sjaj blijede treponeme, čiji se stupanj izražava u plusevima: 0 i 1+ - negativna reakcija; od 2+ do 4+ - pozitivno.
RIF se odnosi na grupne treponemske reakcije i stavlja se u razrjeđenje ispitivanog seruma 10 i 200 puta (RIF-10 i RIF-200). RIF-10 se smatra osjetljivijim, ali nespecifični pozitivni rezultati često ispadnu nego kod RIF-200 (ima veću specifičnost). Obično, RIF postaje pozitivan prije nego RW- pozitivan kod primarnog seronegativnog sifilisa u 80% bolesnika, kod 100% u sekundarnom razdoblju sifilisa, uvijek pozitivan kod latentnog sifilisa i u 95-100% slučajeva kod kasnih oblika i kongenitalnog sifilisa.
RIF specifičnost povećava se nakon predtretmana ispitivanog seruma sorbentom-ultrazvučnim treponemskim antigenom koji veže grupna antitijela (RIF - abs).
Indikacije za postavljanje RIBT i RIF- dijagnoza latentnog sifilisa za potvrdu specifičnosti kompleksa lipidnih reakcija u slučaju sifilitičke infekcije na temelju pozitivnog RV. Pozitivni RIBT i RIF dokaz su latentnog sifilisa. S lažno pozitivnim RV u raznim bolestima (sistemski eritematozni lupus, maligne neoplazme itd.), a ako su ponovljeni rezultati RIBT i RIF negativni, to ukazuje na nespecifičnu prirodu RV. Sumnja na kasne sifilitičke lezije unutarnjih organa, mišićno-koštanog sustava, živčanog sustava u prisutnosti negativnog RV u bolesnika. Sumnja na primarni seronegativni sifilis, kada se u bolesnika s ponovljenim pregledima erozije (ulkusnog) iscjetka s površine, s punkcijom iz povećanih regionalnih limfnih čvorova, ne otkrije blijeda treponema - u ovom slučaju postavlja se samo RIF - 10.
Prilikom pregleda osoba s negativnim RV koji su imali dugotrajne seksualne i kućne kontakte s pacijentima sa sifilisom, s obzirom na vjerojatnu mogućnost liječenja u nedavnoj prošlosti antisifilitičkim lijekovima koji su uzrokovali RV negativan. Imunoenzimski test (ELISA, ELISA - enzymelinked immunosorbent assay) - metodu su razvili E.Engvall i sur., S.Avrames (1971). Suština se sastoji u kombinaciji sifilitičkog antigena adsorbiranog na površini čvrste faze nosača s antitijelom proučavanog krvnog seruma i detekcije specifičnog kompleksa antigen-antitijelo pomoću enzimski označenog anti-species imunološkog krvnog seruma. To vam omogućuje da vizualno procijenite rezultate ELISA-e prema stupnju promjene boje supstrata pod djelovanjem enzima koji je dio konjugata. Nepouzdani rezultati ELISA mogu se pojaviti kao posljedica nedovoljnog razrjeđivanja sastojaka, kršenja temperaturnih i vremenskih režima, nedosljednosti pH otopina, kontaminacije laboratorijskog staklenog posuđa i nepravilne tehnike pranja nosača.
Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA)
Predložen kao dijagnostički test za sifilis T. Rathlev (1965.1967), T. Tomizawa (1966). Makromodifikacija reakcije naziva se TRHA, mikromodifikacija je MHA-TR, automatizirana verzija je AMNA-TR, reakcija s poliurea makrokapsulama umjesto eritrocita je MSA-TR. Osjetljivost i specifičnost RPHA slične su RIBT, RIF, ali je RPHA manje osjetljiv u ranim oblicima sifilisa u usporedbi s RIF-abs i osjetljiviji u kasnim oblicima, s kongenitalnim sifilisom. RPGA se postavlja u kvalitativnoj i kvantitativnoj verziji.Tehnika uzimanja krvi za serološke reakcije
Za istraživanje RV, RIF, RIBT, krv se uzima iz kubitalne vene natašte ili ne prije 4 sata nakon obroka sterilnom štrcaljkom ili jednom iglom (gravitacijom). Na mjestu uzimanja uzoraka koža se prethodno tretira 70% alkoholom. Štrcaljku i iglu treba isprati izotoničnom otopinom natrijevog klorida. U čistu, suhu i hladnu epruvetu ulije se 5-7 ml ispitivane krvi. Na epruvetu se lijepi prazan papir s prezimenom bolesnika, inicijalima, brojem povijesti bolesti ili ambulantnog kartona, datumom vađenja krvi. Nakon uzimanja krvi, epruveta se stavlja u hladnjak s temperaturnim režimom od +4°+8°C do sljedećeg dana. Sljedećeg dana, serum se isušuje za istraživanje. Ako se krv ne koristi sljedeći dan, serum se mora iscijediti iz ugruška i čuvati u hladnjaku ne duže od 1 tjedna. Za istraživanje na RIBT epruveta mora biti posebno pripremljena i sterilna. U slučaju kršenja pravila uzimanja krvi za istraživanje, nepoštivanje uvjeta može dovesti do izobličenja rezultata.Ne preporučuje se uzimanje krvi za istraživanje nakon jela, alkohola, raznih lijekovi, nakon uvođenja raznih cjepiva, tijekom menstrualnog ciklusa među ženama.
Za istraživanje ekspresnom metodom krv je uzeta iz vrha prsta, kao što se radi kada se uzima za ESR, ali krv se uzima za 1 kapilaru više. Ekspresna metoda može se provesti i s krvnim serumom dobivenim venepunkcijom. Ako postoji potreba za krvnim pretragama u udaljenim laboratorijima, umjesto krvi može se poslati suhi serum (metoda suhe kapi). Da biste to učinili, sljedeći dan nakon uzimanja krvi, serum se odvoji od ugruška i uvuče u sterilnu štrcaljku u količini od 1 ml. Zatim se serum izlije u obliku 2 odvojena kruga na traku debljeg pisaćeg papira (voštanog papira ili celofana) veličine 6x8 cm, a na slobodnom rubu ispisuje se prezime, inicijali ispitanika i datum vađenja krvi. papir. Serum papir se zaštiti od izravnog sunčevog svjetla i ostavi na sobnoj temperaturi do sljedećeg dana. Serum se suši u obliku malih krugova sjajnog žućkastog staklastog filma. Nakon toga se papirnate trake s osušenim serumom smotaju poput farmaceutskog praha i šalju u laboratorij s naznakom dijagnoze i za koju svrhu se proučava.
Serološka rezistencija
U dijelu (2% ili više) bolesnika sa sifilisom, unatoč potpunoj antisifilitičkoj terapiji, dolazi do usporavanja (odsutnosti) negativnih seroloških reakcija nakon završetka liječenja do 12 mjeseci ili više. Postoji takozvana serološka rezistencija, koja se posljednjih godina sve više uočava. Postoje oblici serološke rezistencije:- Pravi(apsolutno, bezuvjetno) - potrebno je provesti dodatno antisifilično liječenje, u kombinaciji s nespecifičnom terapijom za povećanje imunoloških snaga tijela.
- Relativni- nakon potpunog tretmana, blijede treponeme formiraju ciste ili L-forme, koje su u tijelu u stanju niske virulencije i, kao rezultat toga, dodatno liječenje ne mijenja pokazatelje seroloških reakcija, posebno RIF i RIBT.
Pseudo-otpor- nakon tretmana, unatoč pozitivnim serološkim reakcijama, u tijelu nema blijede treponeme. U tijelu nema antigena, ali se nastavlja proizvodnja antitijela koja se fiksiraju prilikom postavljanja seroloških reakcija.
Serološka rezistencija može se razviti zbog:
- neadekvatno liječenje bez uzimanja u obzir trajanja i stadija bolesti;
- nedovoljna doza, a posebno zbog neuzimanja u obzir tjelesne težine pacijenata;
- kršenja intervala između uvođenja lijekova;
- očuvanje blijedih treponema u tijelu unatoč punopravnom specifičnom liječenju, zbog njihove otpornosti na penicilin i druge kemoterapijske lijekove u prisutnosti skrivenih, encistiranih lezija u unutarnjim organima, živčanom sustavu, limfni čvorovi, koji su nedostupni antibakterijski lijekovi(često se blijede treponeme nalaze u tkivima ožiljka mnogo godina nakon završetka terapije, u limfnim čvorovima ponekad je moguće otkriti blijede treponeme 3-5 godina nakon antisifilitičke terapije);
- smanjenje zaštitnih snaga kod raznih bolesti i intoksikacija (endokrinopatija, alkoholizam, ovisnost o drogama, itd.);
- opća iscrpljenost (prehrana siromašna vitaminima, bjelančevinama, mastima).
- prateći nespecifične bolesti unutarnji organi, poremećaji kardiovaskularnog sustava, reumatizam, disfunkcije endokrinog i živčanog sustava, teške kronične dermatoze, maligne neoplazme;
- lezije živčanog sustava (teške ozljede, potres mozga, mentalna trauma);
- trudnoća kronična intoksikacija alkoholom, nikotinskim lijekovima; zarazne bolesti(malarija, tuberkuloza, virusni hepatitis, dizenterija, tifus, tifus i povratna groznica).
Reakcija se temelji na činjenici da se imunološki serumi tretiraju fluorokromima (FITC), koji se kombiniraju s antitijelima. Serumi ne gube svoju imunološku specifičnost. Kada nastali luminiscentni serum stupi u interakciju s odgovarajućim antigenom, nastaje specifičan luminozni kompleks koji je lako vidljiv luminiscentnim mikroskopom.
Za izravnu i neizravnu imunofluorescenciju mogu se koristiti različiti imunofluorescentni serumi. U izravnoj metodi, specifični fluorescentni imunološki serumi pripremaju se za svaki mikrob imunizacijom kunića s ubijenom kulturom patogena, zatim se imunološki serum kunića kombinira s fluorokromom (fluorescein izocijanat ili izotiocijanat). Metoda se koristi za ekspresnu dijagnostiku u svrhu otkrivanja bakterijskih ili virusnih antigena.
Indirektna metoda uključuje korištenje nefluorescentnog dijagnostičkog imunološkog seruma (imuniziranog kunića ili bolesne osobe) i fluorescentnog seruma koji sadrži antitijela protiv globulina vrste dijagnostičkog seruma.
Posao #3
Enzimski imunološki test (IFA)
Enzimski imunoenzimski test (ELISA) naširoko se koristi. Temelji se na činjenici da su proteini snažno adsorbirani na pločama, na primjer, od polivinil klorida. Jedna od najčešćih varijanti ELISA testa u praksi temelji se na upotrebi enzimima obilježenih specifičnih protutijela iste specifičnosti. Otopina s analiziranim antigenom dodaje se nosaču s imobiliziranim antitijelima. Tijekom inkubacije na čvrstoj fazi stvaraju se specifični kompleksi antigen-antitijelo. Zatim se nosač ispere od nevezanih komponenti i dodaju homologna antitijela obilježena enzimom koja se vežu na slobodne valencije antigena u kompleksima. Nakon druge inkubacije i uklanjanja viška ovih antitijela obilježenih enzimom, određuje se enzimska aktivnost na nosaču, čija će vrijednost biti proporcionalna početnoj koncentraciji antigena koji se proučava.
U drugoj varijanti ELISA test serum se dodaje imobiliziranom antigenu. Nakon inkubacije i uklanjanja nevezanih komponenti pomoću antiglobulinskih protutijela obilježenih enzimima, otkrivaju se specifični imunokompleksi. Ova je shema jedna od najčešćih u postavljanju ELISA-e.
Specifični ispitni materijal - Specifični supstrat antitijela
antitijela patogena s peroksidazom za peroksidazu
Ispitani AGS, označen
serum peroksidaza Supstrat za
Specifična peroksidaza
Kontrolirati:
pozitivan - imunološki serum obilježen peroksidazom + supstrat - 2 jažice;
negativno - normalni serum + supstrat - 2 jažice.
Trenutno se široko koriste serološki testovi (SR), u kojima su uključeni označeni antigeni ili antitijela. To uključuje imunofluorescenciju, radioimunotest, enzimski imunotest, imunobloting, protočnu citometriju i elektronsku mikroskopiju.
Primjenjuju se:
1) za serodijagnostiku zaraznih bolesti, odnosno za otkrivanje protutijela pomoću skupa poznatih konjugiranih (kemijski kombiniranih) antigena s različitim oznakama (enzimi, fluorokromne boje);
2) odrediti mikroorganizam ili njegov serovar standardnim obilježenim dijagnostičkim protutijelima (brza dijagnostika).
Dijagnostički serumi pripremaju se imunizacijom životinja odgovarajućim antigenom, potom se izoliraju imunoglobulini i konjugiraju sa svjetlećim bojama (fluorokromima), enzimima i radioizotopima.
Dijagnostička monoklonska protutijela dobivaju se korištenjem hibridnih stanica nastalih fuzijom imuni B-limfocit sa stanicama mijeloma. Hibridomi su sposobni brzo se razmnožavati in vitro u kulturi stanica i proizvoditi imunoglobulin karakterističan za uzeti B-limfocit.
Označeni SR nisu inferiorni u odnosu na druge SR u specifičnosti, a svojom osjetljivošću nadilaze sve SR.
Reakcija imunofluorescencije (RIF)
Kao oznaka koriste se svjetleće fluorokromne boje (fluorescein izotiocijanat i dr.).
Postoje razne modifikacije RIF-a. Za ekspresnu dijagnostiku zaraznih bolesti - za otkrivanje mikroba ili njihovih antigena u ispitivanom materijalu koristi se RIF po Koonsu.
Postoje dvije metode RIF-a prema Koonsu: izravna i neizravna.
Izravne RIF komponente:
1) materijal koji se proučava (stolica, iscjedak iz nazofarinksa, itd.);
2) označeni specifični imunološki serum koji sadrži antitijela na željeni antigen;
3) izotonična otopina natrijeva klorida.
Bris ispitivanog materijala tretira se obilježenim antiserumom.
Dolazi do reakcije AG-AT. Pregled luminiscentnim mikroskopom u području gdje su lokalizirani AG-AT kompleksi otkriva fluorescenciju oznake (Slika 34).
Komponente neizravni RIF, namijenjen ekspresnoj dijagnostici influence A:
1) ispiranje ispitnog materijala iz nazofarinksa bolesnika sa sumnjom na gripu;
2) specifični antiserum s antitijelima protiv virusa influence A;
3) antiglobulinski serum (AT protiv imunoglobulina) obilježen fluorokromom;
4) izotonična otopina natrijeva klorida.
Bris iz ispitivanog materijala najprije se obradi imunološkim serumom na željeni antigen, a zatim obilježenim antiglobulinskim serumom.
Imuni kompleksi AG-AT - obilježeni AT detektiraju se pomoću fluorescentnog mikroskopa.
Prednost neizravne metode je u tome što nema potrebe za pripremom širokog spektra fluorescentno specifičnih seruma, već se koristi samo jedan fluorescentni antiglobulinski serum.
Za serološka dijagnostika influence A, odnosno detektirati protutijela protiv virusa influence A u krvnom serumu pomoću neizravni RIF koristiti influenza diagnosticum (antigen virusa influence A). Serodijagnostika virusne infekcije je uglavnom retrospektivna i koristi se za potvrdu dijagnoze i epidemiološku analizu.
Imunoenzimski test (ELISA): kompetitivna metoda (određivanje HBs-AG virusa hepatitisa B) i neizravna metoda (serološka dijagnostika HIV infekcije)
Enzimski imunološki test (ELISA)
Kao oznaka koriste se enzimi: peroksidaza, alkalna fosfataza itd.
Indikator reakcije je sposobnost enzima da izazovu obojene reakcije kada su izloženi odgovarajućem supstratu. Na primjer, supstrat za peroksidazu je otopina ortofenildiamina (OPD) ili tetrametilbenzidina (TMB).
Najviše se koristi čvrsta faza ELISA (Slika 35), neizravna i kompetitivna metoda (Slika 36).
Rezultati ELISA testa mogu se procijeniti vizualno i mjerenjem optičke gustoće na spektrofotometru (ELISA analizator).
Prednosti ELISA-e uključuju:
Jednostavnost metoda ocjenjivanja odgovora;
Stabilnost konjugata;
Lako podložan automatizaciji.
Sljedeće vrste ELISA date su kao primjeri:
A) natjecateljski tip
Dizajniran za otkrivanje površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBs Ag) u krvnim serumima i plazmi tijekom dijagnostike virusni hepatitis B i određivanje nosivosti HBs Ag.
Komponente:
1) ispitni materijal - serum ili krvna plazma;
2) antitijela na HBs Ag adsorbirana na površini jažice polistirenske mikroploče;
3) konjugat - mišja monoklonska protutijela na HBs Ag obilježena peroksidazom;
4) ortofenilendiamin (OPD) - supstrat;
5) fosfatno-slani pufer;
6) kontrolni serumi:
Pozitivan (serum s HBs Ag);
Negativno (serum bez HBs Ag).
Napredak:
2. Inkubacija 1 sat na 37°C.
3. Ispiranje bunara.
4. Uvođenje konjugata.
5. Inkubacija 1 sat na 37°C.
6. Ispiranje bunara.
7. Uvođenje OFD. U prisutnosti HBs Ag otopina u jažicama postaje žuta.
8. Računovodstvo za ELISA provodi se pomoću optičke gustoće pomoću fotometra. Stupanj optičke gustoće bit će obrnuto proporcionalan koncentraciji ispitivanog HBs Ag.
Reakcija se odvija u tri faze:
1. HBs Ag ispitivanog seruma (plazme) veže se na homologna antitijela adsorbirana na površini jažice. Nastaje IR AG-AT. (HBs Ag - anti HBs AT).
2. Protutijela na HBs Ag obilježena peroksidazom vežu se na preostale slobodne HBs Ag determinante kompleksa AG-AT. Nastaje kompleks AT-označenog AT (anti HBs AT - HBs Ag - anti HBs AT obilježen peroksidazom).
3. OPD stupa u interakciju s peroksidazom kompleksa AT-AG-AT i javlja se žuto bojenje.
B) neizravni tip
To je glavna testna reakcija za dijagnozu HIV infekcije.
Cilj: Serološka dijagnostika HIV infekcija - otkrivanje antitijela na HIV antigene.
Komponente:
1) materijal za ispitivanje - krvni serum (AB do AG-m HIV);
2) sintetski peptidi koji oponašaju 2 antigena HIV-a: gp 120 i gp 41, adsorbirani na površini jažice od polistirena;
3) antiglobulinski serum obilježen peroksidazom dobiven imunizacijom kunića humanim globulinima (AT do AT);
5) fiziološka otopina s fosfatnim puferom;
6) kontrolni serumi:
pozitivan;
Negativan.
Napredak:
1. Uvođenje kontrolnih i ispitnih seruma.
2. Inkubacija 30 minuta na 37°C.
3. Pranje rublja.
4. Uvođenje enzimom obilježenog antiglobulinskog seruma.
5. Inkubacija 30 minuta na 37°C.
6. Pranje rublja.
7. Uvođenje OFD.
Reakcija se odvija u 3 faze:
1. Protutijela na HIV proučavanog seruma vežu se na homologne antigene (gp 120 i gp 41), a na površini sorbenta nastaje IR AG-AT (HIV AG - AT na HIV).
2. Stvaranje IC AG-AT-AT obilježenog peroksidazom, jer Protutijela ispitivanog seruma su antigeni za antiglobulinski serum.
3. OPD stupa u interakciju s peroksidazom kompleksa AG-AT-AT i javlja se žuto obojenje otopine jažice. Stupanj enzimske aktivnosti izravno je proporcionalan koncentraciji proučavanih protutijela.
Reakcija imunofluorescencije – RIF (Koonsova metoda).Postoje tri vrste izravna metoda, neizravna metoda, s komplementom. Koonsova reakcija je brza dijagnostička metoda za otkrivanje mikrobnih antigena ili otkrivanje protutijela.
Izravna RIF metoda temelji se na činjenici da tkivni antigeni ili mikrobi tretirani imunološkim serumima s antitijelima obilježenim fluorokromima mogu svijetliti u UV zrakama fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu, tretiranom takvim luminiscentnim serumom, svijetle duž periferije stanice u obliku zelene granice.
Indirektna RIF metoda sastoji se u identificiranju kompleksa antigen-antitijelo korištenjem
antiglobulin (anti-antitijela) serum obilježen fluorokromom. Da biste to učinili, razmazi iz suspenzije mikroba tretiraju se antitijelima antimikrobnog dijagnostičkog seruma kunića. Zatim se antitijela koja nisu vezana mikrobnim antigenima isperu, a antitijela koja su ostala na mikrobima otkrivaju se tretiranjem razmaza antiglobulinskim (anti-zečjim) serumom označenim
fluorokromi. Kao rezultat toga nastaje kompleks mikrob + antimikrobna zečja protutijela + anti-zečja protutijela obilježena fluorokromom. Ovaj kompleks se promatra u fluorescentnom
mikroskop, kao kod izravne metode.
23. Enzimski imunološki test Sastojci, formulacija, obračun, procjena. Područja upotrebe.
I Radioimunotest.
Radioimuna metoda ili analiza (RIA) vrlo je osjetljiva metoda koja se temelji na reakciji antigen-protutijelo pomoću antigena ili antitijela obilježenih radionuklidom (125J, 14C, 3H, 51Cr itd.). Nakon njihove interakcije, nastali radioaktivni imunološki kompleks se odvaja i njegova radioaktivnost se određuje u odgovarajućem brojaču (beta ili gama zračenje). Intenzitet zračenja izravno je proporcionalan broju vezanih molekula antigena i protutijela.
dodajte pacijentov serum, antiglobulinski serum označen enzimom i supstrat/kromogen za enzim.
II. Pri određivanju antigena u jažice sa sorbiranim antitijelima unosi se antigen (npr. krvni serum sa željenim antigenom), dodaju se dijagnostički serum protiv njega i sekundarna antitijela (protiv dijagnostičkog seruma) označena enzimom, i onda supstrat/kromogen za enzim.
24. Imunološke reakcije lize, primjena. Reakcija vezanja komplementa. Sastojci, formulacija, računovodstvo, procjena. Primjena.
Reakcija fiksacije komplementa (RCC) sastoji se u činjenici da kada antigeni i antitijela odgovaraju jedno drugom, oni formiraju imunološki kompleks, na koji je komplement (C) vezan preko Fc fragmenta antitijela, a komplement je vezan antigen-antitijelo. kompleks. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, tada komplement ostaje slobodan. RSK se provodi u dvije faze 1. faza - inkubacija smjese koja sadrži antigen + protutijelo + komplement, 2. faza (indikator) - dokazivanje slobodnog komplementa u smjesi dodavanjem hemolitičkog sustava koji se sastoji od eritrocita ovna i hemolitičkog seruma koji sadrži protutijela. njima. U 1. fazi reakcije, kada nastaje kompleks antigen-antitijelo, dolazi do vezanja komplementa, a zatim u 2. fazi neće doći do hemolize eritrocita senzibiliziranih protutijelima (reakcija je pozitivna). Ako se antigen i antitijelo ne podudaraju (nema antigena ili antitijela u ispitivanom uzorku), komplement ostaje slobodan iu 2. fazi će se pridružiti kompleksu eritrocit-antieritrocitno antitijelo, uzrokujući hemolizu (negativnu reakciju).
25. Dinamika formiranja staničnog imunološkog odgovora, njegove manifestacije. Imunološki
memorija.
Imunološki stanični odgovor (CIR) je složena, višekomponentna kooperativna reakcija imunološkog sustava izazvana stranim antigenom (epitopima T-stanica). Provodi T-sustav imuniteta. KIO pozornice
1. APC Hvatanje antigena
2. Procesor. AG u proteasomima.
3. Stvaranje kompleksa peptid + MHC klase I i II.
4. Transport komplementa do APC membrane.
5. Prepoznavanje komplementa pomoću AG-specifičnih T-pomagača 1
6. aktivacija APC i T-helpera 1, oslobađanje IL-2 i gama-interferona od strane E-helpera1. Proliferacija i diferencijacija u području AG-ovisnih T-limfocita.
7. Stvaranje zrelih T-limfocita različitih populacija i memorijskih T-limfocita.
8. Interakcija zrelih T-limfocita s AH i realizacija krajnjeg efektora.
Manifestacije KIO:
antiinfektivna AI:
antivirusno,
antibakterijski (intracelularno smještene bakterije);,
alergije IV i I tipa;
antitumorski IO;
transplantacija AI;
imunološka tolerancija;
imunološko pamćenje;
autoimuni procesi.
26. Karakterizacija regulatornih i efektorskih subpopulacija T-limfocita. Glavni
oznake. T-stanični receptor (TCR). Genetska kontrola TCR raznolikosti
T-limfociti predstavljaju drugu važnu populaciju limfocita, čiji prekursori nastaju u koštana srž a zatim migriraju radi daljnjeg sazrijevanja i
diferencijacija u timus (naziv "T-limfocit" odražava ovisnost o timusu, kao glavnom mjestu rane faze sazrijevanja).
Prema spektru biološke aktivnosti, T-limfociti su regulatorne i efektorske stanice koje osiguravaju adaptivnu funkciju T-sustava imuniteta. Oni ne proizvode molekule antitijela. TCR je membranska molekula koja se razlikuje od HCR-a, ali je strukturno i funkcionalno slična protutijelima.
TCR - specifičan za AG. receptor. To je glavna molekula koja pripada Ig superobitelji. Ima 3 dijela: nadmembranski, membranski i citoplazmatski. TCR rep čine 2 globularne alfa i beta molekule koje imaju varijabilne i konstantne domene (Vα i Vβ, Sα i Sβ).
Vα i Vβ tvore aktivni TCR kompleks. Postoje 3 hipervarijabilne regije – konstantne determinističke regije (CDO). Funkcija KDO je prepoznavanje i vezanje peptida T-stanica, tj. determinantne skupine AG. TCR čvrsto sjedi na stanici i njegov citoplazmatski rep, njen citoplazmatski dio, sudjeluje u provođenju inf. U jezgri tijekom njegove interakcije s AG. Otprilike 90% TCR. Nose alfa i beta lance, a otprilike 10% nosi gama i delta lance.
TCR je genetski kodiran. α i γ lance, analogno IG lakim lancima, kodiraju V, G i C geni, a β i δ, analogno IG teškim lancima, V, G, E. α i γ na kromosomu 7, te β i δ na kromosomu 14.
CD-3 receptor je komplementarna struktura, molekula Ig. Tvore ga 3 transmembranska proteina: εδ, εγ i dimer-zeta., supramembranski, vembranski i citosolni rep. Oni predstavljaju jedan kompleks s TCR, koji osigurava provođenje AG-specifičnih signala do stanične jezgre.
CD4 i CD8. Ekspresiraju se ili istovremeno s TCR-om ili odvojeno od njega. Imaju funkciju koreceptora. Oni pojačavaju prianjanje na stanicu koja predstavlja AG. Oni osiguravaju provođenje AG-specifičnog signala do stanične jezgre.
T-limfociti se dijele prema vrsti prepoznavanja, MOLEKULA:
CD4 rec. Peptid MHC 2. klase
CD8 peptid + MHC 1. klase
Karakteristike glavnih subpopulacija T-limfocita: populacija T-limfocita može se klasificirati u tri klase:
A. Pomoćnici, HRT efektori (CD 4+) i citotoksični supresori (CD 8+);
B. Nestimulirane (CD 45 RA+) i memorijske stanice (CD 45 RO+);
C. Tip 1 - (produkcija IL-2, INF-gama, TNF-beta);
Tip 2 - (stvara IL-4, IL-5, IL-6, IL9, IL 10).
Prvi ga je predložio Coombs 1942. RIF se temelji na detekciji antigena u kliničkom materijalu, pripravcima krvnih stanica, itd. korištenjem monoklonskih protutijela ili seruma obilježenih fluorokromom (izravni RIF). Prva (dijagnostička) protutijela mogu se dokazati antiimunoglobulinskim serumom obilježenim fluorokromima (indirektni RIF). Postoje modifikacije RIF-a za otkrivanje protutijela na uzročnike infekcije u krvnom serumu ili protutijela u krvnom serumu.
Popularnost RIF-a je zbog njegove isplativosti, prisutnosti širok raspon dijagnostički setovi, brzi odgovor. Danas se u ovoj reakciji koriste i poliklonski serumi i monoklonska protutijela obilježena fluorescein izotiocijanatom (FITC). Kako bi se smanjila nespecifična pozadinska luminiscencija, preparati se tretiraju goveđim serumskim albuminom označenim rodaminom ili Evans plavim.
Najčešće se RIF koristi za brzo otkrivanje patogena u patološkom materijalu. U tom slučaju priprema se razmaz od ispitivanog materijala na predmetnom stakalcu, kao kod konvencionalne mikroskopije. Preparat se fiksira metilnim alkoholom, acetonom ili drugim kemijskim fiksativom. Na površinu fiksiranog razmaza nanose se serumi obilježeni FITC-om ili monoklonska protutijela (kod neizravnog RIF-a lijek se najprije tretira serumom protiv željenog antigena, a potom obilježenim protutijelima na imunoglobuline koji se koriste u prvoj fazi). Budući da je RIF vrsta heterogene analize, jedna faza se odvaja od druge pranjem.
Računanje rezultata reakcije provodi se pomoću fluorescentnog mikroskopa, u optički sustav u koji je ugrađen skup svjetlosnih filtara koji osiguravaju osvjetljenje preparata ultraljubičastim ili plavo-ljubičastim svjetlom zadane valne duljine. Istraživač procjenjuje prirodu sjaja, oblik, veličinu predmeta i njihov relativni položaj.
Prilikom postavljanja RIF-a za otkrivanje protutijela, razmazi se pripremaju iz referentnog soja uzročnika. Testirani serum se nanosi na bris. Ako sadrži željena antitijela, tada se ona vežu na antigene mikrobnih stanica. Ispiranje preparata puferskom otopinom uklanja nevezana antitijela. Zatim se lijek tretira označenim serumom protiv humanih imunoglobulina. U slučaju pozitivnog rezultata reakcije, tijekom mikroskopa razmaza u fluorescentnom mikroskopu uočava se specifičan sjaj referentne kulture.
Glavni nedostatak RIF-a je njegova subjektivnost.
Klasični kriteriji za specifičnost ove reakcije su:
karakteristična morfologija, veličina i položaj uzročnika u razmazu;
periferna priroda sjaja objekta;
fluorescentna boja;
intenzitet fluorescencije.
U proučavanju velikih objekata (Trichomonas, ljudske stanice, stanice zahvaćene bakterijama ili virusima), ovi kriteriji omogućuju vam da dobijete pouzdan rezultat. Istovremeno, elementarna tijela klamidije i mikoplazme imaju veličine koje leže na granici razlučivosti luminiscentnog mikroskopa. Istodobno, procjena morfologije mikroorganizama je teška, a luminiscencija gubi svoj periferni karakter. Preostali kriteriji očito nisu dovoljni za pouzdanu identifikaciju promatranog mikroorganizma. U vezi s gore navedenim, subjektivna priroda uzimanja u obzir reakcije nameće posebne zahtjeve za kvalifikacije osoblja koje provodi studiju.
2.2. Vremenski razlučni fluorescentni imunotest (FIA BP, Etkins R. et Wallac O., 1984.)
Ova vrsta FIA temelji se na principima sorpcije jednog od reagensa na krutu fazu i korištenju "sendvič" tehnologije, tj. dvostruko prepoznavanje, slično ELISA-i. Međutim, bitna razlika metode je korištenje kelata lantanida (elementi rijetkih zemalja europij, samarij, terbij i disprozij) kao oznaka. Prednosti FIA VR su njegova visoka osjetljivost, tehnologija postavljanja slična ELISA-i i potencijal za značajno poboljšanje korisnog signala zbog vrlo visokog omjera signala i šuma. Specifična fluorescentna oznaka fluorescira nemjerljivo jače i dulje od pozadinske fluorescencije. Osim toga, naljepnica ima mogućnost vraćanja sposobnosti sjaja (za obračun, koristi se pulsno pobudno zračenje s periodom od 1 s - više od 1000 impulsa), što dovodi do akumulacije (pojačanja) korisnog signala. Opisani sustav implementirao je PerkinElmer, SAD, pod nazivom Delfia i ima osjetljivost veću od 10 -17 M u određivanju antigena.
2.3. Protočna citometrija
