interferon leukocitni gen virus

Trenutačno je metoda dobivanja interferona mikrobiološkom sintezom prepoznata kao obećavajuća, što omogućuje dobivanje ciljanog proizvoda s mnogo većim prinosom iz relativno jeftine sirovine. Pristupi korišteni u ovom slučaju omogućuju stvaranje varijanti strukturnog gena koje su optimalne za bakterijsku ekspresiju, kao i regulatornih elemenata koji kontroliraju njegovu ekspresiju.

Kao početni mikroorganizmi koriste se različiti dizajni sojeva Pichia pastoris, Pseudomonas putida i Escherichia coli.

Nedostatak korištenja P. pastoris kao proizvođača interferona su izuzetno teški uvjeti fermentacije za ovu vrstu kvasca, potreba da se strogo održava koncentracija induktora, posebice metanola, tijekom procesa biosinteze.

Nedostatak korištenja sojeva Ps. putida je složenost procesa fermentacije pri niskoj razini ekspresije (10 mg interferona na 1 litru medija kulture). Produktivnija je uporaba sojeva Escherichia coli.

Znan veliki broj plazmidi i sojevi E. coli koji eksprimiraju interferon: sojevi E. coli ATCC 31633 i 31644 s plazmidima Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 ili Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), Soj E. coli pINF-AP2 (SU 1312961), Soj E. coli pINF-F-Pa (AU 1312962), Soj E. coli SG 20050 s plazmidom p280/21FN, Soj E. coli SG 20050 s plazmidom pINF14 (SU 1703691) ), soj E. coli SG 20050 s plazmidom pINF16 (RU 2054041) itd. Nedostatak tehnologija koje se temelje na korištenju ovih sojeva je njihova nestabilnost, kao i nedovoljna razina ekspresije interferona.

Uz karakteristike korištenih sojeva, učinkovitost procesa uvelike ovisi o tehnologiji korištenoj za izolaciju i pročišćavanje interferona.

Poznata je metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje uzgoj stanica Ps. putida, destrukcija biomase, obrada polietileniminom, frakcioniranje amonijevim sulfatom, hidrofobna kromatografija na fenilsilokromu C-80, pH frakcioniranje lizata, njegovo koncentriranje i dijafiltracija, ionsko-izmjenjivačka kromatografija na DE-52 celulozi, pH gradijent eluacije, ionsko-izmjenjivačka kromatografija dobiveni eluens na CM celulozi -52, koncentracija prolaskom kroz filtarsku kasetu i gel filtracija na Sephadex G-100 (SU 1640996). Nedostatak ove metode, osim složene višestupanjske fermentacije, je i višestupanjski proces u dobivanju konačnog proizvoda.

Također je poznata metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje uzgoj soja E. coli SG 20050/pIF16 u LB bujonu u tikvicama u termostatiranoj mućkalici, centrifugiranje biomase, njeno ispiranje otopinom pufera i sonikaciju radi uništavanja stanica. Dobiveni lizat je centrifugiran, ispran s 3 M uree u puferu, otopljen u gvanidin kloridu u puferu, sonikiran, centrifugiran, oksidativna sulfitoliza, dijaliza protiv 8 M uree, renaturacija i završna dvostupanjska kromatografija na CM-52 celulozi i Sephadex G -50 (EN 2054041).

Nedostaci ove metode su njezina relativno niska produktivnost glavnih faza procesa izolacije i pročišćavanja. Posebno se to odnosi na ultrazvučnu obradu proizvoda, dijalizu i oksidativnu sulfitolizu, što dovodi do nestabilnosti u prinosu interferona, kao i nemogućnosti korištenja ove metode za industrijsku proizvodnju interferona.

Kao najbliži analog (prototip) može se navesti metoda za proizvodnju humanog leukocitnog interferona, koja se sastoji u uzgoju rekombinantnog soja E. coli, zamrzavanju dobivene biomase na temperaturi ne višoj od -70 ° C, odmrzavanju, uništavanju stanica mikroorganizama. s lizozimom, uklanjanje DNA i RNA uvođenjem u lizat DNaze i pročišćavanje izoliranog netopljivog oblika interferona ispiranjem puferskom otopinom s deterdžentima, otapanje precipitata interferona u otopini gvanidin hidroklorida, renaturacija i jednostupanjsko pročišćavanje pomoću ionsko-izmjenjivačka kromatografija. Kao producent korišten je soj E. coli SS5 dobiven korištenjem rekombinantnog pSS5 plazmida koji sadrži tri promotora: Plac, Pt7 i Ptrp te gen alfa-interferona s uvedenim nukleotidnim supstitucijama.

Ekspresiju interferona pomoću soja E. coli SS5 koji sadrži ovaj plazmid kontroliraju tri promotora: Plac, Pt7 i Ptrp. Razina ekspresije interferona je oko 800 mg po 1 litri stanične suspenzije.

Nedostatak ove metode je niska proizvodnost korištenja enzimske destrukcije stanica, DNA i RNA mikroorganizma i jednostupanjskog kromatografskog pročišćavanja interferona. To uzrokuje nestabilnost procesa izolacije interferona, dovodi do smanjenja njegove kvalitete i ograničava mogućnost korištenja gornje sheme za industrijsku proizvodnju interferona.

Nedostaci ovog plazmida i soja temeljenog na njemu su korištenje u plazmidu jakog nereguliranog promotora faga T7 u soju E. coli BL21 (DE3), u kojem se gen T7 RNA polimeraze nalazi ispod promotora lac operona i koja uvijek "teče". Posljedično, sinteza interferona kontinuirano se događa u stanici, što dovodi do disocijacije plazmida i smanjenja vitalnosti stanica soja, a kao rezultat toga, smanjenja prinosa interferona.

Primjer dobivanja rekombinantnog interferona:

600 g biomase stanica Pseudomonas putida 84 koje sadrže rekombinantni p VG-3 plazmid sadržavalo je nakon uzgoja 130 mg alfa-2 interferona. Stanice su stavljene u balistički dezintegrator s mehaničkom miješalicom kapaciteta 5,0 l i 3,0 l pufera za lizu koji sadrži 1,2 % natrijevog klorida, 1,2 % tris-(hidroksimetil)-aminometana, 10 % saharoze, 0 15 % etilendiamintetraoctene kiseline (EDTA). ), 0,02% fenilmetilsulfonil fluorida i 0,01% ditiotreitola na pH 7,7. Biomasa je miješana dok nije dobivena homogena suspenzija tijekom 30 minuta, zatim je dezintegrirana u cirkulacijskom načinu rada u balističkom dezintegratoru u skladu s uputama za rad. Vrijeme razgradnje iznosilo je 1,5 sat.Proces razgradnje je bio završen kada se tijekom mikroskopiranja preparata u nekoliko vidnih polja mikroskopa praktički nisu uočavale cijele stanice mikroorganizama. Volumen suspenzije lizirane biomase bio je 3,5 litara.

Lizat dobiven u ovoj fazi zatim je ušao u fazu taloženja nukleinskih kiselina. Da bi se to postiglo, 180 ml 5% otopine polietilenimina je dodano u spremnik koji je sadržavao lizat uz miješanje pri brzini od 1-1,2 l/h. Suspenzija je miješana 1 h i centrifugirana da se odvoji talog nukleinskih kiselina 1 h pri (9500±500) okretaja u minuti, na temperaturi od (5±2)C. Nakon centrifugiranja odvojen je supernatant, čiji je volumen bio 3,0 l.

Uz polagano miješanje mješalicom, u supernatant je u malim obrocima uliveno 182 g suhog amonijevog sulfata (svaki sljedeći obrok je dodan nakon što se prethodni potpuno otopio). Nakon što je dodavanje amonijevog sulfata završeno, miješanje je nastavljeno dok se sol potpuno ne otopi, a suspenzija proteinskog taloga je držana na temperaturi od (5 ± 2) C 16 sati, a zatim centrifugirana 1 sat na (13500 ± 500) o/min na temperaturi od (5 ± 2) FROM.

Dobiveni talog je otopljen u destiliranoj vodi, čime je ukupni volumen doveden do 4 litre. Kiselinsko frakcioniranje dobivene otopine koja je sadržavala alfa-2 interferon provedeno je da se talože popratni proteini. Da bi se to učinilo, 5,0 ml 50% octene kiseline je dodano u otopinu do pH 4,75. Dobivena smjesa je prebačena u hladnjak i ostavljena na temperaturi od (5±2)C tijekom 3 sata, zatim je suspenzija proteina centrifugirana na (13500±500) okretaja u minuti tijekom 30 minuta na (5±2)C.

U 4 1 supernatanta dodano je 50,0 ml 1 M otopine Tris do pH (6,9 ± 0,1). Koncentracija ukupnog proteina, određena Lowry metodom, bila je 9,0 mg / ml, biološka aktivnost alfa-2 interferona (6.80.5) 106 IU / ml. Specifična aktivnost 8,5105 IU/mg. Ukupni sadržaj alfa-2 interferona u ovoj fazi je 2,91010 IU.

Sorbent Soloz KG u količini od 0,6 l u obliku vodene suspenzije stavljen je u kromatografsku kolonu. Zatim je pomoću peristaltičke pumpe 2,0 L 0,2 M otopine natrijevog hidroksida, 6,0 L destilirane vode i 4,5 L 0,05 M otopine tris-acetatnog pufera sekvencijalno propušteno kroz sorbent na pH (7,1 ± 0, 1), što je je praćen pH metrom na izlazu iz kolone.

Otopina proteina koja je sadržavala alfa-2 interferon razrijeđena je destiliranom vodom do vodljivosti od (6,0+2,0) mS/cm na sobnoj temperaturi. Volumen otopine u ovom slučaju bio je 19,2 litre.

Otopina je nanesena na kolonu brzinom od 1,5 l/sat, zatim je sorbent ispran s 2,0 1 Tris-acetatnog pufera 0,05 M pri pH 7,0. Eluacija je provedena s 1,2 1 0,05 M otopine Tris s pH (10,2±0,1).Sadržaj interferona u frakcijama sakupljenim pomoću kolektora frakcija određen je enzimskim imunotestom.

Koncentracija ukupnog proteina, određena Lowryjevom metodom, je (2,2 ± 0,2) mg / ml, biološka aktivnost alfa-2 interferona je (2,1 ± 0,5) 107 IU / ml, specifična aktivnost lijeka je (9,7 ± 0,5) 106 IU/mg. Ukupni sadržaj alfa-2 interferona u ovoj fazi je (1,5±0,5)1010 IU.

Sorbent Spherocell qae u količini od 0,15 l u obliku vodene suspenzije napunjen je u kolonu i ispran brzinom od 0,15 l/h sukcesivno s 0,5 l 2 M otopine natrijevog klorida, 1,5 l destilirane vode i 1,0 l otopine tris-acetatnog pufera 0,05 M s pH 8,0, kontrolirajući pH otopine pufera na izlazu iz kolone pH metrom.

Otopina proteina od 0,7 1 koja je sadržavala alfa-2 interferon nanesena je na kolonu sorbenta od 0,15 l Spherocell-QAE brzinom od 0,2 l/h. Kolona je isprana s 0,05 M otopinom pufera tris-acetata (pH 8,0) volumena 0,1 L, zatim su nečistoće proteina isprane s 1,0 L iste otopine pufera uz dodatak 0,05 M NaCl. Interferon je eluiran s 0,8 1 0,1 M otopine pufera natrijevog acetata pri pH 5,0. Sadržaj alfa-2 interferona u frakcijama sakupljenim pomoću kolektora određen je enzimskim imunotestom. Koncentracija proteina bila je (0,35±0,05) mg/ml, biološka aktivnost alfa-2 interferona bila je (1,7±0,2) 107 IU/ml. Specifična aktivnost lijeka je 5,5107 IU/mg proteina. Eluat je sadržavao 1,20 x 1010 IU. Prinos biološke aktivnosti u ovoj fazi je 82,5%.

Dobivena otopina je podešena na pH (5,0±0,1) s 50% octenom kiselinom i razrijeđena s 0,05 M natrijevog acetatnog pufera. Specifična električna vodljivost iznosila je (0,29±0,02) mS/cm pri temperaturi (5±2)C. Ovako pripremljena otopina proteina nanesena je na kolonu sa sorbentom Spherocell LP-M brzinom 0,1 l/h, isprana s 0,3 l gornje otopine pufera, a potom je interferon eluiran linearnom koncentracijom natrijevog klorida. gradijent stvoren pomoću miksera za gradijent Ultragrad.Eluat je frakcioniran pomoću kolektora frakcija i izmjerena je koncentracija ukupnog proteina i alfa-2 interferona. Koncentracija proteina u skupnim frakcijama (0,45±0,02) mg/ml. Volumen otopine je 0,1 l. Ukupni sadržaj alfa-2 interferona (8,6±0,2) 109 IU. Specifična aktivnost - e (7,5 ± 0,2) 107 IU / mg. Iskorištenje u ovoj fazi je 73%.

Rezultirajuća otopina od 3 0,1 L koncentrirana je na (5,0±0,2) ml s ultrafiltracijskom ćelijom pomoću Amicon YM-3 membrane. Tako pripremljen uzorak nanese se na kolonu sorbenta Sephadex G-100 ekvilibriranu s fosfatno puferiranom fiziološkom otopinom brzinom od 0,025 l/h. Volumen frakcija je 10,0 ml. Frakcije dobivene nakon kromatografije testirane su na sadržaj alfa-2 interferona imunoenzimskim testom i spajanjem frakcija koje sadrže glavni pik alfa-2 interferona. Volumen dobivene otopine bio je 30,2 ml. Koncentracija ukupnih proteina, određena Lowry metodom, (0,90±0,02) mg/ml. Ukupan sadržaj alfa-2 interferona u otopini je 5,5109 IU. Specifična aktivnost dobivenog lijeka alfa-2 interferona 2,3108 IU/mg. Izlaz alfa-2 interferona u ovoj fazi je 90,2%. Dobiveni proizvod je steriliziran i pakiran. Ukupni prinos lijeka je 35,8%, uključujući 51% u fazi pročišćavanja.

Za dobivanje velikih količina IFN-a koriste se šestodnevne jednoslojne kulture stanica pilećih embrija ili uzgoj leukocita ljudske krvi zaraženih određenim tipom virusa. Drugim riječima, za dobivanje IFN-a stvara se specifičan sustav virus-stanica.

Gen odgovoran za biosintezu IFN-a izoliran je iz ljudske stanice. Egzogeni ljudski IFN dobiva se tehnologijom rekombinantne DNA. Postupak za izolaciju cDNA IFN-a je sljedeći:

1) mRNA se izolira iz ljudskih leukocita, frakcionira se po veličini, vrši se reverzna transkripcija i ubacuje se na mjesto modificiranog plazmida.

2) Nastali produkt se transformira u E. coli; nastali klonovi se dijele u skupine koje se identificiraju.

3) Svaka skupina klonova hibridizirana s IFN - mRNA.

4) Iz dobivenih hibrida koji sadrže cDNA i xRNA, izolirana je mRNA, njezina translacija se provodi u sustavu sinteze proteina.

5) Odredite interferonsko antivirusno djelovanje svake smjese dobivene translacijom. Skupine koje su pokazale aktivnost interferona sadrže cDNA klon hibridiziran s IFN - mRNA; ponovno identificirati klon koji sadrži IFN pune duljine - humanu cDNA.

Slične informacije.

Interferon pripada važnim zaštitnim proteinima imunološki sustav. Otkriveno je proučavanjem interferencije virusa, odnosno fenomena kada životinje ili stanične kulture zaražene jednim virusom postaju neosjetljive na infekciju drugim virusom. Ispostavilo se da je smetnja posljedica dobivenog proteina koji ima zaštitno antivirusno svojstvo. Ovaj protein je nazvan interferon.

Interferon je skupina glikoproteina koje sintetiziraju stanice imunološkog sustava i vezivno tkivo. Ovisno o tome koje stanice sintetiziraju interferon, razlikuju se tri vrste: α, β i γ-interferoni.

Alfa interferon koju proizvode leukociti i zove se leukocit; beta interferon naziva se fibroblastičnim, jer ga sintetiziraju fibroblasti - stanice vezivnog tkiva, i gama interferon - imun, jer se proizvodi aktivirani T-limfociti, makrofagi, prirodne ubojice, tj. imunološke stanice.

Interferon se neprestano sintetizira u tijelu, a njegova koncentracija u krvi se održava na oko 2 IU/ml (1 međunarodna jedinica - ME je količina interferona koja štiti staničnu kulturu od 1 CPD 50 virusa). Proizvodnja interferona dramatično se povećava kada je zaražen virusima, kao i kada je izložen induktorima interferona, kao što su RNA, DNA, složeni polimeri. Takvi induktori interferona nazivaju se interferonogeni.

Osim antivirusnog učinka, interferon ima antitumorsku zaštitu, jer usporava proliferaciju (razmnožavanje) tumorskih stanica, kao i imunomodulatorno djelovanje, stimulira fagocitozu, prirodne ubojice, regulira proizvodnju antitijela od strane B stanica, aktivira ekspresiju glavne histokompatibilnosti. kompleks.

Mehanizam djelovanja interferon je složen. Interferon ne djeluje izravno na virus izvan stanice, već se veže na posebne stanične receptore i utječe na proces reprodukcije virusa unutar stanice u fazi sinteze proteina.

Primjena interferona. Djelovanje interferona je to učinkovitije što se ranije počinje sintetizirati ili ulazi u tijelo izvana. Stoga se koristi sa preventivna svrha s mnogima virusne infekcije kao što je gripa, kao i terapijska svrha s kroničnim virusnim infekcijama, kao što su parenteralni hepatitis (B, C, D), herpes, Multipla skleroza i dr. Interferon daje pozitivne rezultate u liječenju maligni tumori i bolesti povezane s imunodeficijencijom.

Interferoni su specifični za vrstu, tj. ljudski interferon je manje učinkovit za životinje i obrnuto. Međutim, ova specifičnost vrste je relativna.

Dobivanje interferona. Interferon se dobiva na dva načina: a) infekcijom ljudskih leukocita ili limfocita sigurnim virusom, pri čemu zaražene stanice sintetiziraju interferon, koji se zatim izolira i od njega se konstruiraju pripravci interferona; b) genetskim inženjeringom - uzgojem u industrijskim uvjetima rekombinantnih bakterijskih sojeva sposobnih za proizvodnju interferona. Obično se koriste rekombinantni sojevi Pseudomonas, Escherichia coli s genima interferona ugrađenim u njihovu DNA. Interferon dobiven genetskim inženjeringom naziva se rekombinantnim. U našoj zemlji rekombinantni interferon primljeno službeni naziv"Reaferon". Proizvodnja ovog lijeka mnogo je učinkovitija i jeftinija od lijeka za leukocite.

Rekombinantni interferon našao je široku primjenu u medicini kao preventiva i lijek s virusnim infekcijama, neoplazmama i imunodeficijencijama.

Antigeni. Definicija. Pojam potpunih i defektnih antigena. zahtjevi za antigene. Pojmovi o antigenskim svojstvima mikroorganizama. Antigenska struktura bakterija.

Antigeni(od latinskog anti - protiv, genos - rod) - genetski strane tvari koje, kada se unesu u unutarnju okolinu tijela, mogu izazvati imunološki odgovor u obliku stvaranja protutijela ili imunološki T-limfociti i komunicirati s njima. Glavna svojstva antigena su imunogenost i specifičnost. Antigeni su strukturni i kemijski elementi stanice i njihovi metabolički produkti.

Antigeni su koloidne tvari koje su strane tijelu, a kada se otpuste u njegovu unutarnju okolinu, mogu izazvati specifičnu imunološku reakciju, koja se očituje, posebice, u stvaranju specifičnih protutijela, pojavi senzibiliziranih limfocita ili u pojava stanja tolerancije na ovu tvar.

Tvari koje su antigeni moraju biti strane organizmu, makromolekularne, biti u koloidnom stanju, ući u organizam parenteralno, tj. zaobilazeći gastrointestinalni trakt, pri čemu obično dolazi do cijepanja tvari i gubitka njezine stranosti. Stranost antigena treba shvatiti kao određeni stupanj kemijske razlike između antigena i makromolekula organizma u čiji unutarnji okoliš ne ulazi.

Antigenska svojstva povezana su s molekularnom težinom makromolekule. Što je veća molekularna težina tvari, to je veća njezina antigenost. Istodobno, netočno je pretpostaviti da je visoka molekularna težina obvezno svojstvo antigena. Dakle, glukagon, vazopresin - angiotenzin također imaju antigenska svojstva.

Uobičajeno je razlikovati potpune antigene, neispravne antigene (haptene) i polu-haptene.

Puni antigeni nazivaju se oni koji uzrokuju stvaranje protutijela ili senzibilizaciju limfocita i sposobni su s njima reagirati kako u tijelu tako iu laboratorijskim reakcijama. Proteini, polisaharidi, visokomolekularne nukleinske kiseline i složeni spojevi ovih tvari imaju svojstva punopravnih antigena.

Defektni antigeni ili hapteni sami po sebi nisu sposobni potaknuti stvaranje protutijela ili senzibilizaciju limfocita. Ovo se svojstvo pojavljuje tek kada im se dodaju potpuni antigeni ("vodiči"), a među nastalim antitijelima ili senzibiliziranim limfocitima neki su specifični za "provodnika", a neki za hapten.

Poluhapteni su relativno jednostavne tvari koje se, ulaskom u unutarnju okolinu organizma, mogu kemijski povezati s proteinima tog organizma i dati im svojstva antigena. Neke od ovih tvari također mogu lijekovi(jod, brom, antipirin itd.).

Molekula antigena sastoji se od dva nejednaka dijela. Aktivni (mali dio) c naziva se antigenska determinanta (epitop) i određuje antigensku specifičnost. Antigene determinante nalaze se na onim mjestima molekule antigena koja su najviše povezana s mikrookolinom. U proteinskoj molekuli, na primjer, mogu se nalaziti ne samo na krajevima polipeptidnog lanca, već iu drugim njegovim dijelovima. Antigene determinante sadrže najmanje tri aminokiseline krute strukture (tirozin, triptofan, fenilalanin). Specifičnost antigena također je povezana s redoslijedom izmjene aminokiselina polipeptidnog lanca i kombinacijom njihovih položaja jedan u odnosu na drugi. Broj antigenih determinanti u molekuli antigena određuje njegovu valenciju. To je veća što je veća relativna molekularna težina molekule antigena.

Vjeruje se da ostatak (neaktivni) dio molekule antigena igra ulogu nositelja determinante i potiče prodiranje antigena u unutarnju okolinu tijela, njegovu pinocitozu ili fagocitozu, reakciju stanica na prodiranje antigena, stvaranje medijatora međustanične interakcije u imunološkom odgovoru (T-limfociti imaju receptore za nositelja , B- za antigenu determinantu).

Prema anatomskoj građi bakterijske stanice razlikuju se H-antigeni (flagelirani, ako ih bakterija ima), K-antigeni (nalaze se na površini stanične stijenke), O-antigeni (vezani za staničnu stijenku bakterije). ), antigeni koje bakterije izlučuju u svoju okolinu (proteini-egzotoksini, polisaharidi kapsule).

Među brojnim antigenima mikrobne stanice postoje oni koji su svojstveni samo određenoj vrsti mikroba (tipski antigeni), određenoj vrsti (vrstni antigeni), kao i zajednički skupini (obitelji) mikroorganizama (skupinski antigeni). ).

Dakle, bakterijska stanica (poput mikroorganizama drugih kraljevstava mikroba - virusa, protozoa, gljivica) je složen kompleks brojnih antigena. Kada uđe u unutarnju okolinu makroorganizma, mnogi od ovih antigena će formirati vlastita specifična antitijela. Neki antigeni potiču stvaranje jedva primjetne količine protutijela (titar), drugi - brzo i značajno stvaranje protutijela. Prema tome, razlikuju se "slabi" i "jaki" antigeni.

Nisu svi antigeni bakterijske stanice jednako uključeni u indukciju otpornosti (imuniteta) na ponovni ulazak patogenih mikroba iste vrste u makroorganizam. Sposobnost antigena da inducira imunitet naziva se imunogenost, a takav antigen imunogen. Također je utvrđeno da pojedini antigeni nekih mikroorganizama mogu uzrokovati razvoj raznih vrsta preosjetljivosti (alergija). Takvi antigeni nazivaju se alergenima.

Prema građi virusne čestice razlikuje se nekoliko skupina antigena: nuklearni, kapsidni i superkapsidni. Antigenski sastav viriona ovisi o strukturi same virusne čestice. Antigenska specifičnost jednostavno organiziranih virusa povezana je s ribo- i deoksinukleoproteinima. U složenim virusima, dio antigena je povezan s nukleokapsidom, a drugi je lokaliziran u vanjskoj ljusci - superkapsidu.

Imunogenost- sposobnost induciranja imunološkog odgovora.

Specifičnost- sposobnost antigena da stupi u interakcijske reakcije s protutijelima specifičnim za njega ili aktiviranim (primiranim) limfocitima, što dovodi do neutralizacije ovog antigena.

Imunogenost se utvrđuje:

stranost, oni. tvar mora biti prepoznata od strane imunološkog sustava kao "neja". Štoviše, što je manje izražen genetski odnos između organizma i primijenjene tvari, to je imunogen bolji;

Molekularna težina, koja treba biti najmanje 5-10 kD. Što je veća molekularna težina antigena, to će imunološki odgovor biti jači;

kemijske prirode. Antigeni mogu biti proteini, polisaharidi, polipeptidi, fosfolipidi, nukleinske kiseline itd.

Ovisno o kemijskoj prirodi i molekularnoj težini, antigeni mogu biti potpuna i nepotpun

(hapteni).

Potpuni antigeni(imunogeni) induciraju specifičan imunološki odgovor i stupaju u interakciju s protutijelima i aktiviranim T-limfocitima. To su makromolekularne tvari - proteini, polisaharidi, glikoproteini, lipopolisaharidi, lipoproteini, nukleoproteini i korpuskularni oblici (mikroorganizmi, strane stanice i dr.). Antigeni mogu biti egzogeni i endogeni. Endogeni AG - vlastite stanice tijela s modificiranim genomom i produkti koje one stvaraju ( autoantigeni).

Hapteni- to su jednostavni kemijski spojevi male molekulske mase: disaharidi, lipidi, peptidi, nukleinske kiseline itd. Nisu imunogeni, ali imaju visoku razinu specifičnosti u interakciji s produktima imunološkog odgovora (antitijela i T-limfociti) . Ako se hapten spoji s proteinom, on dobiva svojstvo imunogenosti (tj. postaje potpun). Specifičnost ovog kompleksa određuje hapten

Poluhapteni

Proantigeni

Poluhapteni nastaju kada se anorganske tvari (jod, brom, dušik itd.) spajaju s proteinima. Takvi kompleksi mogu inducirati stvaranje antitijela specifičnih za anorganske spojeve.

Proantigeni su alergeni-hapteni ili neantigene tvari (sulfonamidi, antibiotici, fenolftalein i dr.). U kombinaciji s proteinima makroorganizama mogu izazvati stanje preosjetljivosti i razvoj alergijskih reakcija.

Poluhapteni nastaju kada se anorganske tvari (jod, brom, dušik itd.) spajaju s proteinima. Takvi kompleksi mogu inducirati stvaranje antitijela specifičnih za anorganske spojeve.

Proantigeni su alergeni-hapteni ili neantigene tvari (sulfonamidi, antibiotici, fenolftalein i dr.). U kombinaciji s proteinima makroorganizama mogu izazvati stanje preosjetljivosti i razvoj alergijskih reakcija.

№ 7 Interferoni, priroda. Načini dobivanja i primjene.
Interferon je jedan od važnih zaštitnih proteina imunološkog sustava. Otkriveno je proučavanjem interferencije virusa, odnosno fenomena kada životinje ili stanične kulture zaražene jednim virusom postaju neosjetljive na infekciju drugim virusom. Ispostavilo se da je smetnja posljedica dobivenog proteina koji ima zaštitno antivirusno svojstvo. Ovaj protein je nazvan interferon.
Interferon je obitelj glikoproteinskih proteina koje sintetiziraju stanice imunološkog sustava i vezivnog tkiva. Ovisno o tome koje stanice sintetiziraju interferon, razlikuju se tri vrste: α, β i γ-interferoni.
Alfa interferonkoju proizvode leukociti, a naziva se leukocit; beta interferon naziva se fibroblastičnim, jer ga sintetiziraju fibroblasti - stanice vezivnog tkiva, i gama interferon- imunološki, jer ga proizvode aktivirani T-limfociti, makrofagi, prirodne ubojice, tj. imunološke stanice.
Interferon se sintetizira u tijelu stalno, a njegova koncentracija u krvi se održava na oko 2 IU / ml (1 međunarodna jedinica - MI je količina interferona koja štiti staničnu kulturu od 1 CPD 50 virusa). Proizvodnja interferona dramatično se povećava kada je zaražen virusima, kao i kada je izložen induktorima interferona, kao što su RNA, DNA, složeni polimeri. Takvi induktori interferona nazivaju se interferonogeni.
Osim antivirusnog učinka, interferon ima antitumorsku zaštitu, jer usporava proliferaciju (razmnožavanje) tumorskih stanica, kao i imunomodulatorno djelovanje, stimulira fagocitozu, prirodne ubojice, regulira proizvodnju antitijela od strane B stanica, aktivira ekspresiju glavne histokompatibilnosti. kompleks.
Mehanizam djelovanjainterferon je složen. Interferon ne djeluje izravno na virus izvan stanice, već se veže na posebne stanične receptore i utječe na proces reprodukcije virusa unutar stanice u fazi sinteze proteina.
Primjena interferona. Djelovanje interferona je to učinkovitije što se ranije počinje sintetizirati ili ulazi u tijelo izvana. Stoga se koristi u profilaktičke svrhe kod mnogih virusnih infekcija, poput gripe, kao i u terapijske svrhe kod kroničnih virusnih infekcija, poput parenteralnog hepatitisa (B, C, D ), herpes, multipla skleroza itd. Interferon daje pozitivne rezultate u liječenju malignih tumora i bolesti povezanih s imunodeficijencijama.
Interferoni su specifični za vrstu, tj. ljudski interferon je manje učinkovit za životinje i obrnuto. Međutim, ova specifičnost vrste je relativna.
Dobivanje interferona. Interferon se dobiva na dva načina: a) infekcijom ljudskih leukocita ili limfocita sigurnim virusom, pri čemu zaražene stanice sintetiziraju interferon, koji se zatim izolira i od njega se konstruiraju pripravci interferona; b) genetskim inženjeringom - uzgojem u industrijskim uvjetima rekombinantnih bakterijskih sojeva sposobnih za proizvodnju interferona. Obično se koriste rekombinantni sojevi Pseudomonas, Escherichia coli s genima interferona ugrađenim u njihovu DNA. Interferon dobiven genetskim inženjeringom naziva se rekombinantnim. U našoj zemlji rekombinantni interferon dobio je službeni naziv "Reaferon". Proizvodnja ovog lijeka mnogo je učinkovitija i jeftinija od lijeka za leukocite.
Rekombinantni interferon našao je široku primjenu u medicini kao profilaktičko i terapeutsko sredstvo za virusne infekcije, neoplazme i imunodeficijencije.

10267 0

Biosinteza somatotropina i drugih ljudskih hormona

Hormon je specifičan za vrstu, tj. za razliku od inzulina, životinjski hormoni rasta nemaju nikakvu aktivnost u ljudskom tijelu. Stoga je jedini lijek za hipofizni nanizam hormon hipofize, koji se izolira iz leševa. Istraživanja su pokazala da kod intramuskularna injekcija somatotropin u dozama od 10 mg po 1 kg tjelesne težine tijekom godine, tri injekcije tjedno daje povećanje rasta za oko 8-18 cm godišnje.

Oboljela djeca u dobi od četiri do pet godina, uz kontinuirano liječenje, hvataju rast sa svojim vršnjacima do puberteta (14-16 godina). Ako uzmemo u obzir činjenicu da se iz jednog leša može dobiti 4-6 mg somatotropina, onda možemo shvatiti da je liječenje ove bolesti prirodnim somatotropinom potpuno beznadno. Osim nedostatka lijeka, postojali su i drugi problemi povezani s heterogenošću hormona izoliranog iz kadaveričnog materijala.

Također je postojala opasnost da je materijal hipofize zaražen virusima koji se sporo razvijaju. Takvi virusi imaju neobično dugo trajanje inkubacije stoga je djeci koja su primala lijek bio potreban dugogodišnji medicinski nadzor.

Ljudski hormon rasta, sintetiziran u posebno dizajniranim bakterijskim stanicama, ima očite prednosti: dostupan je u velikim količinama, njegovi pripravci su biokemijski čisti i bez virusne kontaminacije.

Biosintezu hormona rasta (koji se sastoji od 191 aminokiselinskog ostatka) pomoću posebno dizajniranih bakterija na bazi Escherichie coli proveo je Genentech. Budući da se tijekom sinteze DNA za mRNA dobiva gen koji kodira prekursor somatotropina koji se u bakterijskim stanicama ne cijepa u aktivni hormon, postupili smo na sljedeći način: u 1. fazi, dvolančana DNA kopija mRNA je kloniran te je digestijom restrikcijskim endonukleazama dobiven slijed koji kodira cijeli aminokiselinski slijed hormona, osim prve 23 aminokiseline. Zatim je kloniran sintetski polinukleotid koji odgovara aminokiselinama od 1 do 23. Zatim su dva fragmenta kombinirana zajedno i "podešena" u plazmid E. coli, nakon čega su bakterijske stanice počele sintetizirati ovaj hormon.

Do 1980. dovršena su klinička ispitivanja lijeka i testovi toksičnosti, a započeli su masovni eksperimenti na djeci koja su bila blizu puberteta. Rezultati su bili ohrabrujući, a od 1982. sintetski hormon rasta počeo se proizvoditi u industrijskim razmjerima.

Drugi hormon, β-endorfin, moždani opijat od 31 aminokiseline, sintetiziran je u genetski modificiranim stanicama E. coli. Godine 1980. australski znanstvenik Shine i američki znanstvenici Fettes, Lan i Baxter uspješno su klonirali DNA koja kodira β-endorfin u stanicama E. ooli i dobili ovaj polipeptid kao fuzijski protein s enzimom β-galaktozidazom. U prvoj fazi klonirali su fragment DNA dobiven kao rezultat reverzne transkripcije mRNA koja kodira β-endorfin, a zatim ga umetnuli u plazmid E.coli iza gena β-galaktozidaze, pri čemu su dobili hibridni protein koji se sastoji od β- galaktozidaza i - endorfin; dalje, β-galaktozidaza je enzimatski cijepana, dobivajući biološki aktivan β-endorfin.

Dobivanje interferona

Interferon je prvi put dobiven 1957. godine u Nacionalnom institutu medicinsko istraživanje blizu Londona. Ovo je protein koji se oslobađa u vrlo malim količinama od strane životinjskih i ljudskih stanica kada virusi uđu u tijelo i usmjeren je na borbu protiv njih. Već prve studije otkrile su visoku biološku aktivnost interferona u liječenju gripe, hepatitisa, pa čak i Rak(suzbija reprodukciju abnormalnih stanica).

Interferon, kao i somatotropin, ima specifičnost vrste: životinjski interferoni su neaktivni u ljudskom tijelu i čak ih odbacuje.

Ljudsko tijelo proizvodi nekoliko vrsta interferona: leukocitni (a), fibroblastni (P) i imunološki (y) (T-limfocitni).

Prirodni interferoni dobivaju se iz ljudske krvi s iznimno malim prinosom: 1978. godine u Central Health Laboratory u Helsinkiju (u to vrijeme svjetski lider u proizvodnji leukocitnog interferona) dobiveno je 0,1 g čistog interferona iz 50 tisuća litara krv.

Proces dobivanja interferona bio je u osnovi isti za sve vrste stanica uzgojenih u kulturama koje tvore interferon. Krvne stanice su zaražene Sendai virusom i nakon 24 sata filtrirane na supercentrifugi. Supernatant je sadržavao sirovi pripravak interferona, koji je podvrgnut kromatografskom pročišćavanju.

Cijena lijeka bila je vrlo visoka - 400 g interferona koštalo je 2,2 milijarde dolara. Međutim, obećanje njegove farmakološke primjene (uključujući protiv četiri vrste raka) natjeralo je traženje novih načina za njegovo dobivanje, prvenstveno uz pomoć genetskog inženjeringa.

U siječnju 1980. ljudski interferon dobiven je u genetski modificiranim stanicama E. coli. Početna poteškoća s ovim metodama bila je u tome što je interferonska mRNA oskudna čak iu leukocitima stimuliranim virusnom infekcijom, te da su prinosi bili vrlo niski: zabilježene su 1-2 molekule interferona po bakterijskoj stanici.

Godine 1981. tvrtka Genentech uspjela je dizajnirati rekombinantnu DNA koja kodira y-interferon i uvesti ga u genom bakterija, kvasca, pa čak i stanica sisavaca, te su postali sposobni sintetizirati interferon s visokim prinosom - 1 litra stanične kulture kvasca sadržavala je 1 milijun jedinica interferona (jedinica interferona odgovara takvoj količini koja štiti 50% stanica u kulturi od infekcije virusom). Proces je proveden na sljedeći način: istraživači su izolirali mješavinu molekula mRNA iz ljudskih limfocita, dobili molekule odgovarajućih kopija DNK i uveli ih u stanice E. coli. Zatim su odabrane bakterije koje proizvode interferon.

Dobivanje imunogenih pripravaka i cjepiva

Cjepiva su jedno od najznačajnijih dostignuća medicine, a njihova je primjena iznimno učinkovita i s ekonomskog gledišta. NA posljednjih godina Razvoju cjepiva posvećena je posebna pozornost. To je zbog činjenice da do sada nije bilo moguće nabaviti visoko učinkovita cjepiva za sprječavanje mnogih uobičajenih ili opasnih zaraznih bolesti.

Povećan interes za cjepiva nastao je nakon što je utvrđena uloga patogena u razvoju onih bolesti koje se prije nisu smatrale zaraznima. Na primjer, gastritis, čir na želucu i duodenum, maligne neoplazme jetre (virusi hepatitisa B i C).

Stoga su u posljednjih 10-15 godina vlade mnogih zemalja počele poduzimati mjere usmjerene na intenzivan razvoj i proizvodnju potpuno novih cjepiva.

Cjepiva koja se danas koriste mogu se podijeliti u sljedeće vrste, ovisno o načinu njihove pripreme:
- živa atenuirana cjepiva;
- inaktivirana cjepiva;
- cjepiva koja sadrže pročišćene komponente mikroorganizama (proteine ​​ili polisaharide);
- rekombinantna cjepiva koja sadrže komponente mikroorganizama dobivene genetskim inženjeringom

Tehnologija rekombinantne DNA također se koristi za stvaranje nove vrste živih atenuiranih cjepiva, postižući atenuaciju usmjerenom mutacijom gena koji kodiraju virulentne proteine ​​patogena. Ista se tehnologija također koristi za proizvodnju živih rekombinantnih cjepiva umetanjem gena koji kodiraju imunogene proteine ​​u žive nepatogene viruse ili bakterije (vektori) koji se ubrizgavaju u ljude.

Princip korištenja DNA cjepiva je da se u tijelo pacijenta ubrizgava DNA molekula koja sadrži gene koji kodiraju imunogene proteine. uzročnik bolesti. DNA cjepiva se inače nazivaju genskim ili genetskim.

Za dobivanje DNA cjepiva, gen koji kodira proizvodnju imunogenog proteina mikroorganizma umeće se u bakterijski plazmid. Osim gena koji kodira protein cijepljenja, u plazmid su umetnuti genetski elementi koji su neophodni za ekspresiju ("uključivanje") ovog gena u eukariotskim stanicama, uključujući i ljude, kako bi se osigurala sinteza proteina. Takav se plazmid unosi u kulturu bakterijskih stanica kako bi se dobio veliki broj kopija.

Zatim se plazmidna DNA izolira iz bakterija, pročišćava od drugih molekula DNA i nečistoća. Pročišćena molekula DNA služi kao cjepivo. Uvođenje DNA cjepiva osigurava sintezu stranih proteina u stanicama cijepljenog organizma, što dovodi do kasnijeg razvoja imuniteta protiv odgovarajućeg patogena. Istodobno, plazmidi koji sadrže odgovarajući gen ne integriraju se u DNA ljudskih kromosoma.

DNK cjepiva nude brojne prednosti u odnosu na konvencionalna cjepiva:
- doprinose stvaranju antitijela na nativnu molekulu virusnih proteina;
- doprinose stvaranju citotoksičnih T-limfocita;
- može selektivno utjecati na različite subpopulacije T-limfocita;
- doprinose stvaranju dugotrajnog imuniteta;
- eliminirati rizik od infekcije.

L.V. Timoščenko, M.V. Chubik

Interferon je jedan od važnih zaštitnih proteina imunološkog sustava. Otkriveno je proučavanjem interferencije virusa, odnosno fenomena kada životinje ili stanične kulture zaražene jednim virusom postaju neosjetljive na infekciju drugim virusom. Ispostavilo se da je smetnja posljedica dobivenog proteina koji ima zaštitno antivirusno svojstvo. Ovaj protein je nazvan interferon.

Interferon je obitelj glikoproteinskih proteina koje sintetiziraju stanice imunološkog sustava i vezivnog tkiva. Ovisno o tome koje stanice sintetiziraju interferon, razlikuju se tri vrste: α, β i γ-interferoni.

Alfa interferon koju proizvode leukociti i zove se leukocit; beta interferon naziva se fibroblastičnim, jer ga sintetiziraju fibroblasti - stanice vezivnog tkiva, i gama interferon- imunološki, jer ga proizvode aktivirani T-limfociti, makrofagi, prirodne ubojice, tj. imunološke stanice.

Interferon se neprestano sintetizira u tijelu, a njegova koncentracija u krvi se održava na oko 2 IU/ml (1 međunarodna jedinica - ME je količina interferona koja štiti staničnu kulturu od 1 CPD 50 virusa). Proizvodnja interferona dramatično se povećava kada je zaražen virusima, kao i kada je izložen induktorima interferona, kao što su RNA, DNA, složeni polimeri. Takvi induktori interferona nazivaju se interferonogeni.

Osim antivirusnog učinka, interferon ima antitumorsku zaštitu, jer usporava proliferaciju (razmnožavanje) tumorskih stanica, kao i imunomodulatorno djelovanje, stimulira fagocitozu, prirodne ubojice, regulira proizvodnju antitijela od strane B stanica, aktivira ekspresiju glavne histokompatibilnosti. kompleks.

Mehanizam djelovanja interferon je složen. Interferon ne djeluje izravno na virus izvan stanice, već se veže na posebne stanične receptore i utječe na proces reprodukcije virusa unutar stanice u fazi sinteze proteina.

Primjena interferona. Djelovanje interferona je to učinkovitije što se ranije počinje sintetizirati ili ulazi u tijelo izvana. Stoga se koristi u profilaktičke svrhe kod mnogih virusnih infekcija, poput gripe, kao i u terapijske svrhe kod kroničnih virusnih infekcija, kao što su parenteralni hepatitis (B, C, D), herpes, multipla skleroza itd. Interferon daje pozitivnu rezultira u liječenju malignih tumora i bolesti povezanih s imunodeficijencijama.

Interferoni su specifični za vrstu, tj. ljudski interferon je manje učinkovit za životinje i obrnuto. Međutim, ova specifičnost vrste je relativna.

Dobivanje interferona. Interferon se dobiva na dva načina: a) infekcijom ljudskih leukocita ili limfocita sigurnim virusom, pri čemu zaražene stanice sintetiziraju interferon, koji se zatim izolira i od njega se konstruiraju pripravci interferona; b) genetskim inženjeringom - uzgojem u industrijskim uvjetima rekombinantnih bakterijskih sojeva sposobnih za proizvodnju interferona. Obično se koriste rekombinantni sojevi Pseudomonas, Escherichia coli s genima interferona ugrađenim u njihovu DNA. Interferon dobiven genetskim inženjeringom naziva se rekombinantnim. U našoj zemlji rekombinantni interferon dobio je službeni naziv "Reaferon". Proizvodnja ovog lijeka mnogo je učinkovitija i jeftinija od lijeka za leukocite.

Rekombinantni interferon našao je široku primjenu u medicini kao profilaktički i terapeutski agens za virusne infekcije, neoplazme i imunodeficijencije.