İnterferon alfa 2b insan rekombinant talimatı. Uyuşturucu hakkında her şey. Uluslararası tescilli olmayan isim
saat güncel uygulama gözün mukoza zarında ilaç, konjonktival enfeksiyon, gözün mukoza zarının hiperemi, tek foliküller, alt forniksin konjonktiva şişmesi mümkündür.
İlacı kullanırken, lökopeni, lenfopeni, trombositopeni, alanin aminotransferaz seviyesinde bir artış, alkalin fosfataz ile kendini gösteren laboratuvar parametrelerinin normlarından sapmalar mümkündür. Terapi sırasında bu sapmaların zamanında tespiti için, genel klinik kan testleri 2 haftada bir ve biyokimyasal - 4 haftada bir tekrarlanmalıdır. Kural olarak, bu değişiklikler genellikle küçük, asemptomatik ve geri dönüşümlüdür.
Interferon betanın yan etkileri.
Lökopeni. trombositopeni. Anemi. otoimmün hemoliz. Anoreksiya. İshal. Artan transaminaz seviyeleri. Hipotansiyon. Taşikardi. nefes darlığı. Baş dönmesi. Uyku bozuklukları. Kemiklerde ve eklemlerde ağrı. Ateş. zayıflık. miyalji. Baş ağrısı. Mide bulantısı. Kusmak; de uzun süreli kullanım- saç kaybı.madde-çözelti: paketler Kayıt No.: LSR-007009/08
Clinico-farmakolojik grup:
Serbest bırakma formu, kompozisyon ve paketleme
madde -çözüm.
şişeler (1) - karton paketleri.
İlacın aktif bileşenlerinin tanımı interferon alfa-2b»
farmakolojik etki
interferon. 19,300 dalton moleküler ağırlığa sahip, oldukça saflaştırılmış bir rekombinant proteindir. Bakteriyel plazmitlerin interferon sentezini kodlayan insan lökositlerinin geni ile hibridizasyonu yoluyla bir Escherichia coli klonundan elde edilmiştir. İnterferonun aksine, alfa-2a 23 konumunda arginin içerir.
Spesifik membran reseptörleri ile etkileşime ve RNA sentezinin ve nihayetinde proteinlerin indüklenmesinden kaynaklanan bir antiviral etkiye sahiptir. İkincisi, virüsün normal üremesini veya salınmasını önler.
Fagositoz aktivasyonu, antikor ve lenfokin oluşumunun uyarılması ile ilişkili immünomodülatör aktiviteye sahiptir.
Tümör hücreleri üzerinde antiproliferatif etkiye sahiptir.
Belirteçler
Akut hepatit B, kronik hepatit B, kronik hepatit C.
Tüylü hücreli lösemi, kronik miyeloid lösemi, renal hücreli karsinom, AIDS ile ilişkili Kaposi sarkomu, kutanöz T hücreli lenfoma ( mikoz mantarları ve Cesari sendromu), malign melanom.
Dozaj rejimi
/ in veya s / c girin. Doz ve tedavi rejimi, endikasyonlara bağlı olarak ayrı ayrı belirlenir.
Yan etki
Grip benzeri semptomlar: sık sık - ateş, titreme, kemiklerde ağrı, eklemler, gözler, kas ağrısı, baş ağrısı, artan terleme, baş dönmesi.
Yandan sindirim sistemi: iştahta olası azalma, bulantı, kusma, ishal, kabızlık, tat alma bozukluğu, ağız kuruluğu, kilo kaybı, hafif karın ağrısı, karaciğer fonksiyon testlerinde hafif değişiklikler (genellikle tedavi sona erdikten sonra normaldir).
CNS ve çevre birimlerinden gergin sistem: nadiren - baş dönmesi, zihinsel bozulma, uyku bozukluğu, hafıza bozukluğu, kaygı, sinirlilik, saldırganlık, öfori, depresyon (uzun süreli tedaviden sonra), parestezi, nöropati, titreme; bazı durumlarda - intihar eğilimi, uyuşukluk.
Yandan kardiyovasküler sistemin: olası - taşikardi (ateşli), arteriyel hipotansiyon veya hipertansiyon, aritmi; bazı durumlarda - kardiyovasküler sistem ihlalleri, koroner arter hastalığı, miyokard enfarktüsü.
Yandan solunum sistemi: nadiren - göğüs ağrısı, öksürük, hafif nefes darlığı; bazı durumlarda - zatürree, akciğer ödemi.
Hematopoetik sistemden: olası hafif lökopeni, trombositopeni, granülositopeni.
Dermatolojik reaksiyonlar: olası kaşıntı, geri dönüşümlü alopesi.
Diğerleri: nadiren - kas sertliği; izole durumlarda - doğal veya rekombinant interferonlara karşı antikorlar.
Kontrendikasyonlar
ağır kardiyovasküler hastalıklar, dekompanse karaciğer sirozu, şiddetli depresyon, psikoz, alkol veya uyuşturucu bağımlılığı, aşırı duyarlılık interferon alfa-2b'ye.
Gebelik ve emzirme
Hamilelik sırasında kullanım, ancak tedavinin anne için beklenen yararı ağır bastığında mümkündür. potansiyel risk fetüs için.
İnterferon alfa-2b'nin anne sütüne geçip geçmediği bilinmemektedir. Gerekirse, emzirme döneminde kullanılması emzirmenin sonlandırılmasına karar vermelidir.
Çocuk doğurma çağındaki kadınlar tedavi sırasında güvenilir doğum kontrolü kullanmalıdır.
Karaciğer fonksiyon ihlalleri için başvuru
Karaciğerin dekompanse sirozunda kontrendikedir. Karaciğer fonksiyon bozukluğu olan hastalarda dikkatli kullanın.
Böbrek fonksiyon ihlalleri için başvuru
Böbrek fonksiyon bozukluğu olan hastalarda dikkatli kullanın.
Özel Talimatlar
İntihar girişimine meyilli böbrek, karaciğer, kemik iliği hematopoezi bozukluğu olan hastalarda dikkatli kullanın.
Kardiyovasküler sistem hastalıkları olan hastalarda aritmi mümkündür. Aritmi azalmaz veya artmaz ise doz 2 kat azaltılmalı veya tedavi kesilmelidir.
Tedavi süresince nörolojik ve mental durumu kontrol etmek gerekir.
Kemik iliği hematopoezinin şiddetli inhibisyonu ile, periferik kan bileşiminin düzenli bir çalışması gereklidir.
İnterferon alfa-2b üzerinde uyarıcı bir etkiye sahiptir. bağışıklık sistemi bu nedenle, otoimmün reaksiyon riskinin artması nedeniyle otoimmün hastalıklara yatkın hastalarda dikkatli kullanılmalıdır.
ilaç etkileşimi
ilaç etkileşimi
İnterferon alfa-2b, teofilin metabolizmasını inhibe eder ve klirensini azaltır.
Buluş, genetik mühendisliği, biyoteknoloji, tıp, farmakoloji ile ilgilidir. İfadesi laktoz ve triptofan promotörlerinin ve bir transkripsiyon terminatörünün kontrolü altında olan insan lökosit interferon alfa-2b'nin sentezini kodlayan yeni bir rekombinant çok kopyalı plazmit DNA pSX50. Alıcı suşu E. coli BL21'in hücrelerinin rekombinant plazmit DNA pSX50 ile transformasyonunun bir sonucu olarak, E. coli SX50 suşu elde edildi - 0.9-1.0'a kadar üretkenliğe sahip bir rekombinant insan lökosit interferon alfa-2b üreticisi 1 litre kültür ortamı başına g interferon alfa-2b. Rekombinant alfa-2b interferon elde etme yöntemi, oluşturulan rekombinant E. coli SX50 suşunun kullanımına dayanır ve biyosentez sırasında sürekli olarak besin substratlarının eklenmesiyle azaltılmış triptofan içeriğine sahip bir besleyici ortam üzerinde derin ekimini, mekanik yıkımını içerir. sırasında mikroorganizma hücreleri yüksek basınç, agrege proteinin konsantre bir guanidin hidroklorür solüsyonunda çözünmesi, ardından interferonun kaotropik ajanlar varlığında fizyolojik tampon solüsyonlarında renatürasyonu ve Chelating Sepharose Fast Flow tipi reçineler üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırması kullanılarak saflaştırılması Cu +2 iyonları ile immobilize edilmiş, CM tipi Sephsrose Fast Flow iyon değişim reçineleri üzerinde iyon değişim kromatografisi ve Superdex 75 tipi reçineler üzerinde jel filtrasyon kromatografisi Yöntem, göre% 99'dan fazla saflıkta bir interferon maddesi elde edilmesini sağlar. jeller, 1 litre kültür ortamı başına en az 400-800 mg miktarlarda RF HPLC'ye göre ve pirojensiz (LAL-testi) gümüşle ve %98'den fazla gümüşle boyandığında indirgeyici ve indirgeyici olmayan koşullar altında elektroforez. 3 n. ve 3 z.p f-ly, 6 hasta.
RF patenti 2242516'ya ait çizimler
Buluş, genetik mühendisliği ile ilgilidir. ilaçlar biyoteknolojik yollarla elde edilen, yani rekombinant insan lökosit interferon alfa-2b'nin endüstriyel üretimi için yöntemler tıbbi amaç(bundan böyle interferon olarak anılacaktır) ve ayrıca Escherichia coli (E. coli) üreten rekombinant suşlar ve interferon sentezini kodlayan plazmit DNA'yı içerir.
İnterferonlar, 15.000 ila 21.000 dalton moleküler ağırlığa sahip, hücreler tarafından üretilen ve salgılanan protein molekülleridir. viral enfeksiyon veya diğer patojenler. Üç ana interferon grubu vardır: alfa, beta ve gama. Kendi başlarına bu gruplar homojen değildir ve birkaç farklı moleküler interferon çeşidi içerebilir. Bu nedenle, ilgi çeken ve tıpta antiviral, antiproliferatif ve immünomodülatör ajanlar olarak yaygın olarak kullanılan 14'ten fazla genetik interferon alfa çeşidi tanımlanmıştır.
Virüsler ve diğer indükleyiciler tarafından indüklenen insan lökositlerinden insan lökosit interferonunun üretilmesi için bilinen yöntemler (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).
İnterferon üretmeye yönelik bu yöntemlerin ana dezavantajı, nihai ürünün hepatit B ve C virüsü, immün yetmezlik virüsü vb. gibi insan virüsleriyle kontaminasyon olasılığıdır.
Şu anda, mikrobiyolojik sentez yoluyla interferon elde etme yöntemi daha umut verici olarak kabul edilmektedir, bu da hedef ürünün nispeten ucuz bir hammaddeden çok daha yüksek verimle elde edilmesini mümkün kılmaktadır. Bu durumda kullanılan yaklaşımlar, bakteri ekspresyonu için optimal olan yapısal gen varyantlarının yanı sıra ekspresyonunu kontrol eden düzenleyici elementlerin yaratılmasını mümkün kılar.
Pichia pastoris, Pseudomonas putida ve Escherichia coli suşlarının çeşitli tasarımları başlangıç mikroorganizmaları olarak kullanılmaktadır.
Bir interferon üreticisi olarak P. pastoris kullanmanın dezavantajı (J.N. Garcia, J.A. Aguiar ve diğerleri // Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995'te insan IFN-2b'sinin yüksek düzeyde ifadesi) ), bu tür mayaların fermantasyonu için son derece zor koşullar, biyosentez sürecinde indüktörün, özellikle metanolün konsantrasyonunu kesinlikle koruma ihtiyacı. Ps suşlarını kullanmanın dezavantajı. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508), düşük ekspresyon seviyesindeki fermentasyon işleminin karmaşıklığıdır (1 litre kültür ortamı başına 10 mg interferon). Escherichia coli suşlarının kullanılması daha verimlidir (Semin. Oncol., 1997, Haziran; 24 (3 Ek 9): S9-41-S9-51).
Bilinen çok sayıda plazmitler ve interferon eksprese eden E. coli suşları: Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 veya Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515) plazmitli E. coli suşları ATCC 31633 ve 31644, suşu E.coli pINF-AP2 (SU 1312961), suşu E.coli pINF-F-Pa (AU 1312962), plazmit p280/21FN ile E. coli SG 20050 (Kravchenko V.V. ve diğerleri Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, No. 9, s.1186-1193), pINF14 plazmitli E.Coli SG 20050 suşu (SU 1703691), pINF16 plazmitli E.coli SG 20050 suşu (RU 2054041), vb. bunların kullanımına dayalı teknolojiler suşlar, kararsızlıklarının yanı sıra yetersiz bir interferon ekspresyonu seviyesidir.
Kullanılan suşların özelliklerinin yanı sıra, işlemin verimliliği büyük ölçüde interferonun izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılan teknolojiye bağlıdır.
Ps hücrelerinin kültivasyonunu içeren interferon üretimi için bilinen bir yöntem. putida, biyokütle imhası, polietilenimin işlemi, amonyum sülfat fraksiyonasyonu, fenilsilokrom C-80 üzerinde hidrofobik kromatografi, lizatın pH fraksiyonasyonu, konsantrasyonu ve diafiltrasyonu, DE-52 selüloz üzerinde iyon değişim kromatografisi, pH gradyan elüsyonu, iyon değişim kromatografisi CM selüloz -52 üzerinde elde edilen eluent, bir filtre kasetinden geçirilerek konsantrasyon ve Sephadex G-100 (SU 1640996) üzerinde jel filtrasyonu. Bu yöntemin dezavantajı, karmaşık çok aşamalı fermantasyona ek olarak, nihai ürünün elde edilmesinde çok aşamalı işlemdir.
E. coli SG 20050/pIF16 suşunun termostatlı bir çalkalayıcıda şişelerde LB broth içinde yetiştirilmesini, biyokütlenin santrifüj edilmesini, bir tampon solüsyonu ile yıkanmasını ve hücreleri yok etmek için sonikasyonu içeren interferon üretmeye yönelik bir yöntem de bilinmektedir. Elde edilen lizat santrifüjlenir, tampon içinde 3 M üre ile yıkanır, tampon içinde guanidin klorür içinde çözülür, sonikasyona tabi tutulur, santrifüjlenir, oksidatif sülfitoliz, 8 M üreye karşı diyaliz, renatürasyon ve CM-52 selüloz ve Sephadex G üzerinde son iki aşamalı kromatografi -50 ( RU 2054041). Bu yöntemin dezavantajları, izolasyon ve saflaştırma işleminin ana aşamalarının nispeten düşük verimliliğidir. Özellikle, bu, ürünün ultrasonik işlenmesi, diyaliz ve oksidatif sülfitoliz için geçerlidir, bu da interferon veriminde kararsızlığa ve ayrıca bu yöntemin endüstriyel interferon üretimi için kullanılmasının imkansızlığına yol açar.
En yakın analog (prototip) olarak, insan lökosit interferonunun üretilmesi için bir yöntem belirtilebilir; bu, rekombinant bir E. coli suşunun yetiştirilmesinden, elde edilen biyokütlenin -70 ° C'yi aşmayan bir sıcaklıkta dondurulmasından, eritilmesinden, mikroorganizma hücrelerinin yok edilmesinden oluşur. lizozim ile, DNA ve RNA'nın DNaz lizatına dahil edilerek çıkarılması ve izole edilmiş çözünmeyen interferon formunun deterjanlarla bir tampon çözeltisi ile yıkanarak saflaştırılması, interferon çökeltisinin bir guanidin hidroklorür çözeltisi içinde çözülmesi, renatürasyon ve tek aşamalı saflaştırma ile iyon değişim kromatografisi. Üretici olarak, üç promotör içeren bir rekombinant pSS5 plazmidi kullanılarak elde edilen bir E. coli SS5 suşu: Plac, Pt7 ve P trp ve sokulan nükleotit ikameleri ile bir alfa-interferon geni kullanılır.
Bu plazmidi içeren E. coli SS5 suşu tarafından interferon ekspresyonu, üç promotör tarafından kontrol edilir: Plac, Pt7 ve P trp. İnterferonun ekspresyon seviyesi, 1 litre hücre süspansiyonu başına yaklaşık 800 mg'dır (RU 2165455).
Bu yöntemin dezavantajı, hücrelerin enzimatik yıkımının, mikroorganizmanın DNA ve RNA'sının kullanımının düşük üretilebilirliği ve interferonun tek aşamalı kromatografik saflaştırılmasıdır. Bu, interferon izolasyon sürecinin kararsızlığına neden olur, kalitesinde bir düşüşe yol açar ve yukarıdaki şemayı interferonun endüstriyel üretimi için kullanma olasılığını sınırlar. Bu plazmitin ve ona dayalı suşun dezavantajları, T7 RNA polimeraz geninin lac operon promotörü altında yer aldığı E. coli BL21 (DE3) suşunda güçlü bir regüle edilmemiş T7 faj promotörünün plazmitinde kullanılmasıdır ve hangi her zaman "akar". Sonuç olarak, hücrede sürekli olarak interferon sentezi meydana gelir, bu da plazmitin ayrışmasına ve suşun hücrelerinin canlılığının azalmasına ve bunun sonucunda interferon veriminde bir azalmaya yol açar.
Bu buluşun amacı, yüksek seviyede interferon biyosentezi olan yeni bir rekombinant plazmit DNA kullanarak E. coli üreticisinin bir rekombinant endüstriyel suşu oluşturmak ve interferon alfa-2b maddesi için "Avrupa Farmakopesi"ne kalite.
Bu sorun, VKPM V-8550 numaralı Federal Devlet Üniter Girişimi GosNII Genetics'in Tüm Rusya endüstriyel suşları koleksiyonunda saklanan rekombinant plazmit DNA pSX50 ve suşu Escherichia coli SX50 yaratılarak çözüldü.
ayrıca bir rekombinant E. coli SX50 suşunun kullanımına dayanan ve biyosentez sırasında sürekli olarak besin substratlarının eklenmesiyle azaltılmış triptofan içeriğine sahip bir besleyici ortam üzerinde derin ekimini içeren rekombinant alfa-2b interferon elde etmek için bir yöntem, mekanik imha yüksek basınçta mikroorganizma hücrelerinin parçalanması, konsantre bir guanidin hidroklorür çözeltisi içinde toplanmış proteinin çözünmesi, ardından interferonun kaotropik ajanlar varlığında fizyolojik tampon çözeltilerinde renatürasyonu ve Chelating Sepharose Fast Flow gibi reçineler üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması, Cu +2 iyonları ile immobilize edilmiş, CM Sepharose Fast Flow gibi iyon değişim reçineleri üzerinde iyon değişim kromatografisi ve Superdex 75 gibi reçineler üzerinde jel filtrasyon kromatografisi.
Buluşa göre, ekspresyonu laktoz ve triptofan promotörlerinin ve bir transkripsiyon terminatörünün kontrolü altında olan insan lökosit interferon alfa-2b'nin sentezini kodlayan yeni bir rekombinant çok kopyalı plazmit DNA pSX50 önerilmektedir. Plazmid pSX50, 3218 baz çiftine (bp) sahiptir ve aşağıdaki parçaların varlığı ile karakterize edilir:
1 nükleotitten 176 nükleotite (n) kadar olan dizi, triptofan promotörünü (P trp) içeren 176 bp'lik bir DNA fragmanını içerir;
177 AD'den dizi MS 194'e translasyonun başlatılmasından sorumlu Shine Delgarno dizisini içeren 18 bp'lik sentetik bir DNA parçasını içerir;
195 AD'den dizi 695 AD tarafından aşağıdaki nükleotit ikameleri ile interferon geninin dizisini içeren 501 bp'lik bir DNA fragmanı içerir: 37. pozisyonda, A'nın C ile ikamesi; 39. pozisyonda, G'nin T ile ikamesi; 40. pozisyonda, A'nın C ile ikamesi; 42 konumunda, G'nin T ile değiştirilmesi , 67 konumunda A'yı C'ye değiştir, 69 konumunda G'yi T'ye değiştir, 70 konumunda A'yı C'ye değiştir, 72 konumunda A'yı T'ye değiştir, 96 konumunda G'yi A'ya değiştir, içinde 100 pozisyonunda A'yı C'ye değiştirin, 102 pozisyonunda A'yı T'ye değiştirin, 114 pozisyonunda A'yı C'ye değiştirin, 120 pozisyonunda C'yi G'ye değiştirin, 126 pozisyonunda G'yi A'ya değiştirin, 129 pozisyonunda G'yi A'ya değiştirin, pozisyonda 330 C'yi G'ye değiştirin, 339 konumunda G'yi A'ya değiştirin, 342'de G'yi A'ya değiştirin, 487'de A'yı C'ye değiştirin, 489'da A'yı T'ye değiştirin, 495'te G'yi A'ya değiştirin ;
MS 696'dan dizi 713 AD tarafından sentetik bir poli-bağlayıcı içeren 18 bp'lik sentetik bir DNA parçasını içerir;
MS 714'ten dizi MS 1138'e kadar 4129 b.p ile plazmit pKK223-3'ün bir DNA parçasını içerir. 4553 AD'ye 425 bp boyutunda, katı transkripsiyon terminatörü rrnBT1 T2 dizisini içeren;
MS 1139'dan dizi MS 1229'a kadar 2487 b.p.'den plazmit pUC19'un bir DNA parçasını içerir. 2577 AD'ye p-laktoz geninin promotörünü içeren 91 p.O. boyutu (ampisilin direnç geni - Amp R);
MS 1230'dan dizi 2045'e kadar 720 b.p ile pUC4K plazmidinin bir DNA parçasını içerir. 1535'e kadar kan geninin yapısal bölgesini içeren boyut olarak 816 bp;
2046 AD'den dizi MS 3218'e 1625'ten 453 b.p'ye kadar plazmit pUC19'un bir DNA fragmanını içerir. boyut 1173 BP, plazmid (ori) ve lac promotörünün (P lac) replikasyonundan sorumlu diziyi içerir.
Şekil 1-5, tasarım şemalarını ve fiziki harita pSX50 plazmitleri.
Şekil 6, plazmit pSX50 için oluşturulmuş tam nükleotid dizisini gösterir.
Escherichia coli SX50 suşu, geleneksel genetik mühendisliği teknolojisi kullanılarak Escherichia coli BL21 hücrelerinin pSX50 plazmidi ile dönüştürülmesiyle elde edildi. E.Coli SX50 suşu aşağıdaki özelliklerle karakterize edilir.
Kültürel ve morfolojik özellikler
Hücreler küçük, düz, kalınlaştırılmış çubuk şeklinde, gram negatif, sporsuzdur. Hücreler basit besin ortamlarında iyi büyür. Difko agarda büyürken yuvarlak, pürüzsüz, dışbükey, bulutlu, parlak, gri renkli, kenarları düzgün koloniler oluşur. büyüme ile sıvı ortam(glikoz içeren minimal ortamda veya LB-et suyunda) yoğun bir eşit bulanıklık oluşturur.
Fiziko-biyolojik özellikler
Aerobe. Büyüme sıcaklık aralığı, optimum pH 6.5-7.5'te 4-42°C'dir.
Azot kaynağı olarak kullanılır mineral tuzlar amonyum ve nitrat formlarında ve organik bileşikler amino asitler, pepton, tripton, maya özü vb.
Karbon kaynağı olarak amino asitler, gliserol, karbonhidratlar kullanılır. Antibiyotik direnci. Hücreler kanamisine direnç gösterir (100 µg/ml'ye kadar).
Escherichia coli 8X50 suşu bir interferon üreticisidir.
Suşun saklanması için ortamın yöntemi, koşulları ve bileşimi
Yağ altında 20 μg / ml'lik bir konsantrasyona kanamisin ilavesiyle L-arape'de, eksi 70 ° C sıcaklıkta ampullerde% 15 gliserol ve uygun antibiyotik içeren L-et suyunda, ampullerde liyofilize halde artı 4 ° C sıcaklık
Escherichia coli SX50 suşu, Bergi's Key (1974) tarafından Escherichia coli türünün bir suşu olarak tanımlandı.
Alfa-2b interferonun endüstriyel üretim yöntemi
Önerilen yöntemin bir özelliği, interferonu fermantasyon sırasında biriken çözünmeyen bir formdan izole etmenize izin veren ve izolasyon sürecinin teknolojik şemasını önemli ölçüde basitleştirebilen ve hedef ürünün verimini artırabilen bir teknolojinin geliştirilmesidir.
Yöntem, biyosentez sırasında, tercihen azaltılmış triptofan içeriğiyle, besin substratlarının, tercihen glikoz ve maya ekstraktının sürekli eklenmesiyle, bir besin ortamında Escherichia coli SX50 suşunun yetiştirilmesini, 700°C yüksek bir basınçta mikroorganizma hücrelerinin mekanik olarak yok edilmesini içerir. -900 bar, interferonun bir tampon guanidin hidroklorür solüsyonunda çözülmesi, interferonun kaotropik ajanların varlığında fizyolojik tampon solüsyonlarında renatürasyonu, ardından Cu +2 ile immobilize edilmiş Chelating Sepharose Fast Flow gibi reçineler üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması iyonlar, CM Sepharose Fast Flow gibi iyon değişim reçineleri üzerinde iyon değişim kromatografisi ve Superdex 75 gibi reçineler üzerinde jel filtrasyon kromatografisi.
İnterferon elde etmenin bireysel aşamalarını gerçekleştirmek için en uygun koşullar aşağıdaki gibidir:
Fermentasyon, proses boyunca sürekli substrat ilavesiyle gerçekleştirilir, bu da yüksek düzeyde interferon ekspresyonuna yol açar;
Hücrelerin yok edilmesi, 900 barlık bir basınçta Gaulin tipi bir parçalayıcı içinde gerçekleştirilir;
Çözünür hücresel bileşenlerin (DNA, RNA, proteinler, lipopolisakaritler, vb.) Çıkarılması, çözünmeyen interferon formunun deterjan içeren tampon çözeltileri (Triton XI00, üre, vb.) ile yıkanmasıyla gerçekleştirilir;
Ortaya çıkan interferon içeren çökelti, 6 M guanidin hidroklorürden oluşan bir tampon çözeltisi içinde çözülür;
İnterferonun renatürasyonu, kaotropik ajanlar içeren fizyolojik bir tampon solüsyonunda gerçekleştirilir;
Interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması Cu +2 iyonları ile immobilize edilmiş Şelatlayıcı Sepharose Fast Flow üzerinde, katyon değişim reçinesi CM Sepharose Fast Flow üzerinde ve reçine tipi Superdex 75 üzerinde jel filtrasyon kromatografisi üzerinde gerçekleştirilir;
Her kromatografik saflaştırmadan sonra, gözenek boyutu 0,22 μm olan pirojen içermeyen filtreler aracılığıyla sterilizasyon filtrasyonu gerçekleştirilir.
Tarif edilen yöntemin uygulanmasının bir sonucu olarak interferon çıkışı, 1 litre kültür ortamı ile yaklaşık 400-800 mg interferondur. Ortaya çıkan ürünün kalitesi, alfa-2b interferon maddesi için "Avrupa Farmakopesi" standartlarına ve gereksinimlerine uygundur.
Önerilen yöntem ile prototip arasındaki önemli farklar şunlardır:
Biyosentez sırasında 1 litre kültür ortamından daha büyük miktarda interferon elde etmeyi mümkün kılan daha yüksek üretkenliğe sahip bir suş tasarımının kullanılması;
Hücresel biyokütlenin etkili mekanik imhasının kullanılması, daha fazla çözünmeyen interferon formunun daha saf bir ekstraktını elde etmeyi mümkün kılar. Kısa bir zaman, daha az kayıpla;
Kaotropik ajanların mevcudiyetinde renatürasyon sırasında fizyolojik tampon çözeltilerinin kullanılması, doğru şekilde renatüre edilmiş interferon formunun verimini arttırmayı mümkün kılar;
İnterferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırması, jeller gümüşle boyandığında ve RF HPLC'ye göre %98'den fazla ve pratik olarak safsızlıktan arındırıldığında, indirgeyici ve indirgeyici olmayan koşullarda elektroforeze göre %99'dan fazla saflıkta bir interferon maddesinin elde edilmesini mümkün kılar. pirojenler (LAL testi).
Talep edilen buluş grubunun özü ve avantajları aşağıdaki örneklerle gösterilmektedir.
Örnek 1 Rekombinant plazmid pSX50'nin yapısı
Plazmid pSX50 oluşturma yöntemi aşağıdaki adımları içerir:
Vektör plazmid pSX10'un yapımı;
1. plazmid pSX3'ün (2641 bp) yapımı
2. vektör plazmid pSX10'un (2553 bp) yapımı
Rekombinant plazmit pSX41'in (3218 bp) oluşturulması;
Rekombinant plazmit pSX43'ün (3218 bp) oluşturulması;
Rekombinant plazmit pSX45'in (3218 bp) oluşturulması;
Rekombinant plazmid pSX50'nin (3218 bp) oluşturulması.
Vektör plazmid pSX10'un yapımı
pSX10 vektör plazmidi, ampisiline dirençli beta-laktamaz gen kodlama dizisinin kan geni kodlama dizisi ile değiştirildiği bir pUC19 vektörüdür ve plazmid pKK223-3'ten transkripsiyon terminatörünü içerir.
Vektör plazmid pSS10'un yapımı iki aşamada gerçekleştirilir:
pUC19 plazmitini temsil eden plazmit pSX3'ün (2641 p.O.) elde edilmesi, ki burada amp geninin kodlama bölgesi kan geninin kodlama bölgesi ile değiştirilir;
Bir pSX3 plazmidi olan bir vektör plazmidi pSX10 (2553 bp) elde edilmesi, burada, içinde transkripsiyon terminatörü ggBT1 T2'yi kodlayan bir DNA parçası BamHI bölgesinin arkasına eklenir.
pSX3 plazmitini elde etmek için beş tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir. PCR yöntemi(polimeraz zincirleme tepki). İlk tur sırasında, bir şablon olarak pUC19 plazmit DNA'sı kullanılarak, 1828 bp'lik bir DNA parçasının amplifikasyonu gerçekleştirilir. (parça PU1-PU2) primerleri kullanarak:
Bu ve sonraki PCR reaksiyonları, aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilir: 20 mM Tis-HCl, pH 8.8, 10 mM (NH4)2S04, 10 mM KCl, 2 tM MgCl2, %0.1 Triton X100, 0.1 mg/ml BSA, her dNTP'den 0.2 mM, 1.25 u Pfu DNA polimeraz, 100 ng DNA. Amplifikasyon işlemi aşağıdaki aşamalardan oluşur: 95°C'de 5 dakika ısıtma, 35 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C, 2 dakika 72°C) ve 72°C'de 10 dakika inkübasyon. Amplifikasyondan sonra (ve sonraki amplifikasyonlardan sonra), DNA fragmanı elektroforetik olarak bir %1 agaroz jeli üzerinde saflaştırılır. İkinci ve üçüncü turlar sırasında, bir şablon olarak pUC4K plazmit DNA'sı kullanılarak, 555 bp'lik bir DNA fragmanının amplifikasyonu gerçekleştirilir. (parça KM1-KM2) primerleri kullanarak:
ve 258 bp'lik bir DNA parçasının amplifikasyonu. (KMZ-KM4) primerler ile
PCR'nin beşinci turunda, fragmanlar (PU1-PU2) ve (KM1-KM4) aşağıdaki koşullar altında birleştirilir: 95°C'de 5 dakika ısıtma, 5 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°) C, 10 dakika 72°C) ve 72°C'de 10 dakika inkübasyon. Son PCR'den sonra elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyondan sonra klonlar ayıklanır, plazmit DNA izole edilir ve kısıtlama analizi yapılır. Sonuç olarak, 2641 bp'lik bir pSX3 plazmidi elde edilir.
Vektör plazmid pSX10'u elde etmek için, PCR ile üç tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. İlk tur sırasında, şablon olarak pSX3 plazmit DNA'sı kullanılarak, 2025 bp'lik bir DNA parçasının amplifikasyonu gerçekleştirilir. (parça 10.1-10.2) primerleri kullanarak:
İkinci tur sırasında, bir şablon olarak pKK223-3 plazmidinin DNA'sı kullanılarak, 528 bp'lik bir DNA parçasının amplifikasyonu gerçekleştirilir. (parça KK1-KK2) primerleri kullanarak:
PCR'nin üçüncü turunda, fragmanlar (10.1-10.2) ve (KK1-KK2) aşağıdaki koşullar altında birleştirilir: 95°C'de 5 dakika ısıtma, 5 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C) , 10 dakika 72°C) ve 72°C'de 10 dakika inkübasyon. Son PCR'den sonra elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyondan sonra klonlar ayıklanır, plazmit DNA izole edilir ve kısıtlama analizi yapılır. Sonuç, 2553 bp'lik bir pSX10 plazmitidir.
Rekombinant plazmid pSX41'in yapımı
Rekombinant plazmit pSX41, vektör plazmiti pSX3'ün (2529 bp) bir Hind III - BamHI DNA fragmanı, E. coli triptofan operon promotörünü (P trp), EcoRI-XbaI a 20 bp'yi kodlayan 168 bp'lik Hind III - EcoRI DNA fragmanıdır. SD dizisini kodlayan sentetik DNA parçası (Shine-Delgarno) ve insan interferon alfa 2b genini kodlayan bir 501 bp XbaI-BamHI DNA parçası.
Vektör plazmid pSX3'ün (2529 bp) Hind III - VamHI DNA fragmanını elde etmek için pSX3 plazmidinin DNA'sı, HindIII ve BamHI kısıtlama enzimleri ile işlenir, ardından %1 agaroz jel içinde elektroforetik saflaştırma yapılır. Triptofan operonunun (P trp) promotörünü kodlayan 168 bp'lik Hind III EcoRI DNA fragmanı, bir şablon olarak toplam E. coli DNA'sı ve TRP1 ve PRP2 primerleri kullanılarak PCR ile elde edildi, ardından amplifiye fragmanın Hindlll ve EcoRI kısıtlaması ile işlenmesi enzimler:
SD dizisini (Shine-Delgarno) kodlayan 20 bp'lik bir sentetik DNA parçası olan EcoRI-Xbal'i elde etmek için aşağıdaki tamamlayıcı oligonükleotitler sentezlenir:
İnsan interferon alfa 2b genini kodlayan bir 501 bp XbaI-BamIII DNA fragmanı, bir şablon olarak toplam insan DNA'sı ve IFN1 ve IFN2 primerleri kullanılarak PCR ile elde edilir, ardından amplifiye fragmanın Xbal ve BamIII kısıtlama enzimleri ile işlenmesi takip edilir:
Daha sonra, elektroforetik olarak saflaştırılmış parçalar birleştirilir, T4 faj ligaz enzimi ile bağlanır, DNA E. coli DH5 hücrelerine dönüştürülür ve 20 ug/ml kanamisin içeren LA ortamı üzerine kaplanır. 12 saat süreyle 37°C'de inkübasyondan sonra klonlar ayıklanır, plazmit DNA izole edilir, kısıtlama analizi yapılır ve DNA'nın birincil yapısı belirlenir. Sonuç bir 3218 bp pSX41 plazmitidir. Daha sonra, hedef ürünün ekspresyon seviyesini arttırmak için interferon geninin aşamalı mutagenezi gerçekleştirilir. İnterferon geninin mutajenezi, E. coli'de nadiren bulunan ve karşılık gelen amino asitleri kodlayan üçlülerin, aynı amino asitleri kodlayan E. coli'de sıklıkla bulunan üçlülerle değiştirilmesinden oluşur. İnterferon gen DNA mutagenezi, PCR ile gerçekleştirilir.
Rekombinant plazmid pSX43'ün yapımı
Rekombinant plazmid pSX43'ü elde etmek için, bir şablon olarak plazmid pSX41'in DNA'sı ve IFN3 ve IFN4 primerleri kullanılarak PCR ile bir tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir:
PCR, aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilir: 95°C'de 5 dakika ısıtma, 20 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C, 10 dakika 72°C) ve 20 dakika 72°C'de inkübasyon. PCR'den sonra elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 12 saat süreyle 37°C'de inkübasyondan sonra klonlar ayıklanır, plazmit DNA izole edilir, kısıtlama analizi yapılır ve DNA'nın birincil yapısı belirlenir. Sonuç olarak, 3218 bp'lik bir pSX43 plazmiti elde edilir.
Rekombinant plazmid pSX45'in yapımı
Rekombinant plazmit pSX45'i elde etmek için, bir şablon olarak pSX43 plazmit DNA'sı ve IFN5 ve IFN6 primerleri kullanılarak PCR ile bir tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir:
PCR, aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilir: 95°C'de 5 dakika ısıtma, 20 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C, 10 dakika 72°C) ve 20 dakika 72°C'de inkübasyon. PCR'den sonra elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 12 saat süreyle 37°C'de inkübasyondan sonra klonlar ayıklanır, plazmit DNA izole edilir, kısıtlama analizi yapılır ve DNA'nın birincil yapısı belirlenir. Sonuç, bir 3218 bp pSX45 plazmitidir.
Rekombinant plazmid pSX50'nin yapımı.
Rekombinant plazmit pSX50 elde etmek için, bir şablon olarak pSX45 plazmit DNA ve IFN7 ve IFN8 primerleri kullanılarak PCR ile bir tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir:
PCR, aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilir: 95°C'de 5 dakika ısıtma, 20 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C, 10 dakika 72°C) ve 20 dakika 72°C'de inkübasyon. PCR'den sonra elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 12 saat süreyle 37°C'de inkübasyondan sonra klonlar ayıklanır, plazmit DNA izole edilir, kısıtlama analizi yapılır ve DNA'nın birincil yapısı belirlenir. Sonuç, 3218 bp'lik bir pSX50 plazmitidir.
Örnek 2. Bir interferon üreticisi olan E. coli SX50 suşunun elde edilmesi
E. coli SX50 interferon üreten suş, E. coli BL21 suş hücrelerinin rekombinant pSX50 plazmidi ile dönüştürülmesiyle elde edilir. İnterferon üreten suş, 30 L'lik bir fermenterde 25.0-30.0 o.u optik yoğunluğa büyütülür. %1 kazein (Difco), %1 glukoz, 40 ug/ml kanamisin içeren M9 ortamında, 38-39°C sıcaklıkta. Fermantasyon işlemi sırasında, bir gravimetrik kontrolör kullanılarak sürekli bir besin substratı ilavesi gerçekleştirilir.
Örnek 3 E. coli SX50 suşundan interferon izole etme yöntemi
İnterferon 4 aşamada elde edilmiştir:
1. Aşama. E. coli SX50 suşunun yetiştirilmesi.
2. aşama. Çözünmeyen interferon formunun izolasyonu ve saflaştırılması.
Sahne 3. İnterferonun çözünmesi ve renatürasyonu.
4. Aşama İnterferonun kromatografik saflaştırılması.
1. Aşama. E. coli SX50 soyunun yetiştirilmesi
26°C'de 12 saat boyunca 3 litre zengin LB ortamı hacminde büyütülen E. coli SX50 suşunun yetiştirilen aşısı, M9, %1 kazein asit hidrolizatı, 1 içeren 27 litre steril ortam içeren bir fermentere aseptik olarak verilir. % glikoz, 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 40 mg/mL kanamisin. Bir fermenterde yetiştirme, %40 sodyum hidroksit çözeltisi ile otomatik titrasyon yoluyla pH 7±0.15'te tutularak 38-39°C'lik bir sıcaklıkta gerçekleştirilir. Çözünmüş oksijen konsantrasyonu (50±10) doygunluk aralığında, karıştırıcı hızı 100'den 800 rpm'ye ve hava beslemesi 1'den 15 l/dak'ya değiştirilerek korunur. Substratların konsantrasyonu, özellikle glikoz ve maya özütü, fermantasyon sırasında ölçülür ve konsantrasyonları, bir gravimetrik kontrolör kullanılarak peristaltik pompalar aracılığıyla konsantre çözeltilerin besleme hızı değiştirilerek korunur.
Çözünmeyen bir form biçiminde interferon birikimi, faz kontrast mikroskobu, %15 poliakrilamid jel (SDS-PAAG) içinde elektroforez ve ters fazlı yüksek performanslı kromatografi (RF HPLC) kullanılarak izlenir. Maksimum optik yoğunluğa (~ 25-30 p.u.) ulaşıldığında ve interferon sentezi durdurulduğunda fermantasyon durdurulur. Fermentasyonun sonunda kültür sıvısı, 5000-10000 rpm dönüş hızında bir akış rotorunda santrifüjleme ile ayrılır. Biyokütle, plastik torbalarda paketlenir ve eksi 70°C'de dondurulur.
2. aşama. Çözünmeyen interferon formunun izolasyonu ve saflaştırılması
300-400 g donmuş E. coli SX50 biyokütlesi, 3000 ml tampon 1 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, %0.1 Triton X100) içinde süspanse edilir. Süspansiyon, Gaulin tipi bir akış homojenleştiricisinden geçirilir, 900 bar'da tutulur ve bir akış rotorunda 15.000 rpm'de santrifüjlenir. Elde edilen çökelti, arka arkaya benzer koşullar altında tamponlar 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 3 M üre) ve tampon 3 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) ve son olarak interferon ile yıkanır. çökelti 200 ml tampon 3 içinde süspanse edilir. Çözünmeyen interferon formunun izolasyon ve saflaştırma süresi 5 saatten fazla değildir.
Sahne 3. İnterferonun çözünmesi ve renatürasyonu
Kuru guanidin hidroklorür, önceki aşamada elde edilen çözünmeyen interferon formunun süspansiyonuna 6 M konsantrasyona eklenir, ditiyotreitol 50 mM konsantrasyona, Tris-HCl pH 8.0, 50 mM konsantrasyona, NaCl ila 150 mM'lik bir konsantrasyon ve %0.1'lik bir konsantrasyona kadar Triton X100, oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi Çözünmemiş malzeme, 0.22 mikron gözenek çaplarına sahip membranlardan sterilize edilerek süzülerek ayrılır.
İnterferon renatürasyonu, nihai çözeltinin, tampon 4 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) ile 100-200 kez yavaş yavaş seyreltilmesiyle gerçekleştirilir. Bundan sonra renatürasyon karışımı, 4-8°C'lik bir sıcaklıkta 12-15 saat boyunca sürekli karıştırılarak inkübe edilir. Daha sonra, 1 mm'lik bir konsantrasyona magnezyum sülfat eklenir ve agrege olan malzeme, gözenek çapı 0.22 mikron olan bir membran filtreden süzülerek sterilize edilerek çıkarılır.
4. Aşama interferonun kromatografik saflaştırılması
İnterferonun kromatografik saflaştırılması üç aşamada gerçekleştirilir.
1. Elde edilen renatüre interferon ilk önce Cu +2 iyonları ile hareketsizleştirilmiş Chelating Sepharose Fast Flow reçinesi (Amersham Biosciences) üzerinde afinite kromatografisiyle saflaştırılır. Bunu yapmak için, interferon solüsyonu Cu +2 Chelating Sepharose Fast Flow içeren bir kolona uygulanır ve interferon 0.1 M'lik bir tamponla ayrıştırılır. sitrik asit pH 2.2.
2. Kromatografik saflaştırmanın ikinci aşamasında, interferon solüsyonu bir CM Sepharose Fast Flow katyon değişim reçinesine (Amersham Biosciences) uygulanır ve interferon, 50 mM Na içinde bir solüsyon gradyanı (0.0-0.5 M NaCl) ile ayrıştırılır. (CH3COO) tamponu, pH 5.5.
3. İnterferonun monomerik formunun polimerik interferon formlarının kalıntılarından saflaştırılması, interferonun Superdex 75 tipi reçine (Amersham Biosciences) üzerinde jel filtrasyonu ile saflaştırılmasının üçüncü aşamasında gerçekleştirilir. Kromatografi, 0.15 M NaCl içeren 50 mM Na(CH3COO) tamponu, pH 5.0 içinde gerçekleştirilir.
İnterferonu izole etmek ve saflaştırmak için açıklanan yöntem, 10 litre kültür ortamından elde edilen biyokütleden 7-10 gün boyunca bir izolasyon döngüsünde 4-8 g yüksek oranda saflaştırılmış interferon elde etmeyi mümkün kılar. Ortaya çıkan interferonun kalitesi, interferon alfa-2b maddesi için "Avrupa Farmakopesi" gerekliliklerine tam olarak uygundur, yani:
İnterferon konsantrasyonu 2x108 IU/ml'den az değildir;
İnterferonun spesifik aktivitesi 2.0×108 IU/mg'den az değildir;
Jeller gümüş ile boyandığında indirgeyici ve indirgeyici olmayan koşullar altında ilacın elektroforetik saflığı %99'dan az değildir;
İzole interferonun izoelektrik noktası pH 5.8-6.3 aralığındadır;
İzole edilmiş interferonun peptit haritası, interferon alfa 2b CRS için Avrupa standardının peptit haritasından temel olarak farklı değildir;
Yukarıdaki örneklerden aşağıdaki gibi, talep edilen buluş grubu, nispeten basit ve güvenilir bir teknoloji ile yüksek verimle interferon alfa-2b elde etmeyi mümkün kılar.
İDDİA
1. Rekombinant insan alfa-2b interferonunun sentezini kodlayan rekombinant plazmit DNA pSX50, 3218 baz çifti (bp) boyutuna sahip olması ve aşağıdaki parçalardan oluşması ile karakterize edilir: 1 ila 176 nükleotid (n) dizisi şunları içerir: bir triptofan promotörü (P trp) içeren 176 bp DNA parçası, 177 ila 194 bp arası dizi. translasyonun başlatılmasından sorumlu Shine Delgarno dizisini, 195 ila 695 bp arasındaki diziyi içeren 18 bp'lik sentetik bir DNA fragmanını içerir. 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 (A>C) ile interferon alfa-2b genini içeren 501 bp'lik bir DNA parçasını içerir. ), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A >C) , 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A>C), 489 (A>T), 495 (G>A), dizi 696 ila 713 b.p. 714 ila 1138 bp arasında bir dizi sentetik poli-bağlayıcı içeren 18 bp'lik sentetik bir DNA parçasını içerir. 4129'dan 4553 b.p'ye kadar plazmit pKK223-3'ün bir DNA parçasını içerir. 425 bp boyutunda, katı transkripsiyon terminatörü rrnBT1 T2 dizisini, 1139 ila 1229 b.p arasındaki diziyi içerir. 2487'den 2577 b.p'ye kadar pUC19 plazmitinin bir DNA parçasını içerir. 91 bp boyutunda, β-laktoz gen promotörünü (ampisilin direnç geni -Amp R), 1230'dan 2045 b.p'ye kadar olan diziyi içerir. 720 b.p ile pUC4K plazmidinin bir DNA parçasını içerir. 1535'e kadar Kan geninin yapısal bölgesini içeren boyut olarak 816 bp, 2046 b.p. MS 3218'e 1625'ten 453 b.p'ye kadar plazmit pUC19'un bir DNA fragmanını içerir. boyut 1173 BP, plazmid (ori) ve lac promotörünün (P lac) replikasyonundan sorumlu diziyi içerir.
2. İstem l'e göre rekombinant plazmit ile transforme edilmiş bakteri suşu Eschcerichia coli SX50, bir rekombinant insan lökosit interferon alfa-2b üreticisidir.
3. İstem 2'ye göre Escherichia coli SX5 suşunun biyosentez sırasında besin substratlarının sürekli eklenmesi, 700-900 bar basınçta mikroorganizma hücrelerinin mekanik imhası ile bir besin ortamında yetiştirilmesini içeren insan interferon alfa-2b'nin üretilmesi için bir yöntem , interferonun bir guanidin hidroklorür tampon solüsyonunda çözülmesi, interferonun kaotropik ajanların varlığında fizyolojik tampon solüsyonlarında renatürasyonu, Cu +2 iyonları ile immobilize edilmiş Chelating Sepharose Fast Flow gibi reçineler üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması, iyon değişim kromatografisi CM Sepharose Fast Flow gibi iyon değişim reçineleri üzerinde ve Superdex 75 gibi reçineler üzerinde boyut dışlama kromatografisi.
4. Yetiştirmenin, besin substratlarının, tercihen glikoz ve maya ekstraktının sürekli eklenmesiyle azaltılmış triptofan içeriğine sahip bir besin ortamında gerçekleştirildiği, istem 3'e göre yöntem.
5. İstem 3'e göre yöntem olup, bu yöntemde, interferon çözülmeden önce, DNA, RNA, proteinler, lipopolisakaritler dahil olmak üzere çözünür hücresel bileşenlerin uzaklaştırılması, Triton XI 00, üreler gibi deterjanlar içeren tampon çözeltileri ile yıkanması yoluyla saflaştırılmaktadır.
6. İstem 3'e göre yöntem olup, bu yöntemde, her kromatografik saflaştırmadan sonra, gözenek boyutu 0,22 um olan filtreler aracılığıyla sterilizasyon filtrasyonu gerçekleştirilmektedir.
Serbest bırakma formu, kompozisyon ve paketleme
Enjeksiyon şeffaf, renksiz.
Yardımcı maddeler:
0,5 ml - ampuller (5) - blister ambalajlar (1) - karton ambalajlar.
0,5 ml - ampuller (5) - blister ambalajlar (2) - karton ambalajlar.
0,5 ml - şişeler (1) - karton paketleri.
0,5 ml - şişeler (5) - blister ambalajlar (1) - karton ambalajlar.
0,5 ml - cam şırıngalar (1) - blister paketler (1) - karton paketler.
0,5 ml - cam şırıngalar (1) - blister paketler (3) - karton paketler.
0,5 ml - cam şırıngalar (3) - kabarcıklı paketler (1) - karton paketler.
0,5 ml - cam şırıngalar (3) - kabarcıklı paketler (3) - karton paketler.
Enjeksiyon şeffaf, renksiz.
Yardımcı maddeler: sodyum asetat, sodyum klorür, etilendiamin tetraasetik asit disodyum tuzu, tween-80, dekstran 40, enjeksiyonluk su.
1 ml - ampuller (5) - blister ambalajlar (1) - karton ambalajlar.
1 ml - ampuller (5) - blister ambalajlar (2) - karton ambalajlar.
1 ml - şişeler (1) - karton paketleri.
1 ml - şişeler (5) - blister ambalajlar (1) - karton ambalajlar.
1 ml - cam şırıngalar (1) - blister ambalajlar (1) - karton ambalajlar.
1 ml - cam şırıngalar (1) - blister ambalajlar (3) - karton ambalajlar.
1 ml - cam şırıngalar (3) - blister ambalajlar (1) - karton ambalajlar.
1 ml - cam şırıngalar (3) - blister paketler (3) - karton paketler.
Klinik ve farmakolojik grup
interferon. Antitümör, antiviral ve immünomodülatör ilaçfarmakolojik etki
interferon. Altevir ® antiviral, immünomodülatör, antiproliferatif ve antitümör etkilere sahiptir.
Hücre yüzeyindeki spesifik reseptörlerle etkileşime giren interferon alfa-2b, hücre içinde bir dizi spesifik sitokin ve enzimin sentezinin indüklenmesi de dahil olmak üzere karmaşık bir değişiklik zincirini başlatır, hücre içindeki viral RNA ve viral proteinlerin sentezini bozar. hücre. Bu değişikliklerin sonucu, hücrede viral replikasyonun önlenmesi, hücre proliferasyonunun inhibisyonu ve interferonun immünomodülatör etkisi ile bağlantılı spesifik olmayan antiviral ve antiproliferatif aktivitedir. İnterferon alfa-2b, immünokompetan hücrelere antijen sunumu sürecini uyarır, makrofajların fagositik aktivitesini ve ayrıca T hücrelerinin sitotoksik aktivitesini ve antiviral bağışıklıkta yer alan "doğal öldürücü" hücrelerin sitotoksik aktivitesini uyarma yeteneğine sahiptir.
Hücre çoğalmasını, özellikle tümör hücrelerini engeller. Bazı onkogenlerin sentezi üzerinde depresif bir etkiye sahiptir ve tümör büyümesinin inhibisyonuna yol açar.
farmakokinetik
Emme
İnterferon alfa-2b'nin s / c veya / m uygulaması ile biyoyararlanımı% 80 ila% 100 arasındadır. İnterferon alfa-2b'nin eklenmesinden sonra, kan plazmasındaki T max 4-12 saat, T 1/2 - 2-6 saat, uygulamadan 16-24 saat sonra rekombinant interferon kan serumunda belirlenmemiştir.
Metabolizma
Metabolizma karaciğerde gerçekleştirilir.
Alfa interferonlar, sitokrom P450 sisteminin mikrozomal karaciğer enzimlerinin aktivitesini azaltarak oksidatif metabolik süreçleri bozabilir.
üreme
Esas olarak böbrekler tarafından glomerüler filtrasyon yoluyla atılır.
İlacın kullanımı için endikasyonlar
Yetişkinlerde karmaşık tedavinin bir parçası olarak:
- karaciğer sirozu belirtileri olmayan kronik viral hepatit B'de;
- semptomların yokluğunda kronik viral hepatit C ile Karaciğer yetmezliği(monoterapi veya ribavirin ile kombinasyon tedavisi);
- gırtlak papillomatozisi ile;
- genital siğiller ile;
- kıllı hücreli lösemi, kronik miyeloid lösemi, Hodgkin olmayan lenfoma, melanom, multipl miyelom, AIDS'in arka planında Kaposi sarkomu, ilerleyici böbrek kanseri.
Dozaj rejimi
s / c, / m ve / in uygulayın. Tedavi bir doktor tarafından başlatılmalıdır. Ayrıca, doktorun izni ile hasta kendisine bir idame dozu uygulayabilir (ilacın s / c veya / m reçete edildiği durumlarda).
Kronik hepatit B: Altevir ® 16-24 hafta boyunca haftada 3 kez 5-10 milyon IU dozda s/c veya/m olarak uygulanır. Pozitif dinamiklerin yokluğunda 3-4 aylık kullanımdan sonra tedavi durdurulur (hepatit B virüsünün DNA çalışmasına göre).
Kronik hepatit C: Altevir ® 24-48 hafta boyunca haftada 3 kez 3 milyon IU dozda s/c veya /m olarak uygulanır. Hastalığın tekrarlayan seyri olan hastalarda ve daha önce interferon alfa-2b tedavisi almamış hastalarda, ribavirin ile kombinasyon tedavisi ile tedavinin etkinliği artar. Kombinasyon tedavisinin süresi en az 24 haftadır. Altevir tedavisi, kronik hepatit C ve yüksek viral yüke sahip virüsün 1. genotipi olan hastalarda, tedavinin ilk 24 haftasının sonunda hepatit C virüs RNA'sının saptanmadığı hastalarda 48 hafta boyunca yapılmalıdır. kan serumu.
Larinksin papillomatozisi: Altevir ® haftada 3 kez 3 milyon IU/m2 dozunda s/c enjekte edilir. Tedavi, tümör dokusunun cerrahi (veya lazer) çıkarılmasından sonra başlar. Doz, ilacın tolere edilebilirliği dikkate alınarak seçilir. Olumlu bir yanıt elde etmek için 6 ay tedavi gerekebilir.
Tüylü hücreli lösemi: Splenektomili veya splenektomisiz hastalarda subkutan uygulama için önerilen Altevir dozu, haftada 3 kez 2 milyon IU/m2'dir. Çoğu durumda, 1-2 aylık tedaviden sonra bir veya daha fazla hematolojik parametrenin normalleşmesi meydana gelir, tedavi süresini 6 aya kadar artırmak mümkündür. Hastalığın hızlı ilerlemesi veya ilaca karşı şiddetli intolerans belirtileri olmadıkça, bu doz rejimi sürekli olarak izlenmelidir.
Kronik miyeloid lösemi: Altevir'in monoterapi olarak önerilen dozu günde 4-5 milyon IU/m2/gün s/c'dir. Lökosit sayısını korumak için 0,5-10 milyon IU/m2'lik bir doz kullanılması gerekebilir. Tedavi lökosit sayısının kontrolünü sağlayabilirse, hematolojik remisyonu sürdürmek için ilaç, tolere edilen maksimum dozda (günde 4-10 milyon IU / m2) kullanılmalıdır. Tedavi kısmi hematolojik remisyon veya lökosit sayısında klinik olarak anlamlı bir azalma ile sonuçlanmadıysa, ilaç 8-12 hafta sonra kesilmelidir.
Non-Hodgkin lenfoma: Altevir ®, standart kemoterapi rejimleriyle kombinasyon halinde adjuvan tedavi olarak kullanılır. İlaç 2-3 ay boyunca haftada 3 kez 5 milyon IU / m2 dozunda s / c uygulanır. Doz, ilacın tolere edilebilirliğine bağlı olarak ayarlanmalıdır.
Melanom: Altevir ®, tümörün çıkarılmasından sonra yüksek nüks riski olan yetişkinlerde adjuvan tedavi olarak kullanılır. Altevir ® 4 hafta boyunca haftada 5 kez 15 milyon IU/m2 dozunda intravenöz olarak, ardından 48 hafta boyunca haftada 3 kez 10 milyon IU/m2 dozunda s/c olarak uygulanır. Doz, ilacın tolere edilebilirliğine bağlı olarak ayarlanmalıdır.
multipil myeloma: Altevir ®, haftada 3 kez 3 milyon IU / m2'lik bir dozda stabil bir remisyon sağlama döneminde reçete edilir s / c.
AIDS'in arka planında Kaposi sarkomu: optimal doz belirlenmemiştir. İlaç 10-12 milyon IU/m2/gün s/c veya/m dozlarında kullanılabilir. Hastalığın stabilizasyonu veya tedaviye yanıt olması durumunda tümör gerileyene veya ilaç kesilmesi gerekene kadar tedaviye devam edilir.
Böbrek kanseri: optimal doz ve rejim belirlenmemiştir. İlaç s/c'nin haftada 3 kez 3 ila 10 milyon IU/m2 dozlarda kullanılması tavsiye edilir.
İntravenöz uygulama için bir çözeltinin hazırlanması
Gerekli dozu hazırlamak için gerekli Altevira çözeltisinin hacmi toplanır, 100 ml steril %0,9 sodyum klorür çözeltisine eklenir ve 20 dakika boyunca uygulanır.
Yan etki
Genel reaksiyonlar:çok sık - ateş, halsizlik (doza bağımlı ve geri dönüşümlü reaksiyonlardır, tedaviye ara verildikten veya sonlandırıldıktan sonra 72 saat içinde kaybolur), titreme; daha az sıklıkla - halsizlik.
Merkezi sinir sisteminin yanından:çok sık - baş ağrısı; daha az sıklıkla - asteni, uyuşukluk, baş dönmesi, sinirlilik, uykusuzluk, depresyon, intihar düşünceleri ve girişimleri; nadiren - sinirlilik, kaygı.
Kas-iskelet sisteminden:çok sık - miyalji; daha az sıklıkla - artralji.
Sindirim sisteminden:çok sık - iştahsızlık, mide bulantısı; daha az sıklıkla - kusma, ishal, ağız kuruluğu, tat değişikliği; nadiren - karın ağrısı, hazımsızlık; muhtemelen karaciğer enzimlerinde geri dönüşümlü bir artış.
Kardiyovasküler sistemin yanından: sık sık - kan basıncında bir azalma; nadiren - taşikardi.
Dermatolojik reaksiyonlar: daha az sıklıkla - alopesi, artan terleme; seyrek - deri döküntüsü, cilt kaşıntısı.
Hematopoetik sistemden: olası geri dönüşümlü lökopeni, granülositopeni, düşük hemoglobin seviyeleri, trombositopeni.
Diğerleri: nadiren - kilo kaybı, otoimmün tiroidit.
İlacın kullanımına kontrendikasyonlar
- Öyküde ağır kardiyovasküler hastalık (kontrol edilemeyen kronik kalp yetmezliği, yakın zamanda geçirilmiş miyokard enfarktüsü, şiddetli bozukluklar) kalp atış hızı);
- şiddetli böbrek ve/veya karaciğer yetmezliği (metastaz varlığından kaynaklananlar dahil);
- epilepsi ve ayrıca özellikle depresyon, intihar düşünceleri ve girişimleri (tarih dahil) ile ifade edilen merkezi sinir sisteminin ciddi bozuklukları;
- dekompanse karaciğer sirozu olan kronik hepatit ve immünosupresanlar alan veya yakın zamanda tedavi edilen hastalarda (kortikosteroidlerle tamamlanmış kısa süreli tedavi kürü hariç);
- otoimmün hepatit veya diğer otoimmün hastalıklar;
- transplantasyondan sonra immünosupresanlarla tedavi;
- hastalık tiroid bezi geleneksel terapötik yöntemlerle kontrol edilemez;
- dekompanse akciğer hastalıkları (KOAH dahil);
- dekompanse diyabet;
- hiper pıhtılaşma (tromboflebit, tromboembolizm dahil) pulmoner arter);
- şiddetli miyelodepresyon;
- hamilelik;
- emzirme dönemi (emzirme);
- İlacın bileşenlerine aşırı duyarlılık.
Hamilelik ve emzirme döneminde ilacın kullanımı
İlaç hamilelik ve emzirme döneminde (emzirme) kontrendikedir.
Karaciğer fonksiyon ihlalleri için başvuru
Böbrek fonksiyon ihlalleri için başvuru
İlaç şiddetli böbrek ve / veya karaciğer yetmezliğinde (metastaz varlığından kaynaklananlar dahil) kontrendikedir.
Özel Talimatlar
Altevir ile kronik tedaviden önce viral hepatit B ve C, karaciğer hasarının derecesini değerlendirmek için karaciğer biyopsisi önerilir (aktif inflamatuar süreç ve/veya fibroz). Altavir ve ribavirin ile kombinasyon tedavisi ile kronik hepatit C tedavisinin etkinliği artar. Altevira kullanımı, dekompanse karaciğer sirozu veya hepatik koma gelişiminde etkili değildir.
Altevir ile tedavi sırasında yan etkiler görülmesi durumunda ilacın dozu %50 oranında azaltılmalı veya bunlar kayboluncaya kadar ilaç geçici olarak kesilmelidir. Doz azaltıldıktan sonra yan etkiler devam ederse veya yeniden ortaya çıkarsa veya hastalığın ilerlemesi gözlenirse, Altevir tedavisi kesilmelidir.
Trombosit seviyesi 50x109 /l'nin altında veya granülosit seviyesi 0.75x109 /l'nin altında ise 1 hafta sonra kan testi kontrolü ile Altevir dozunun 2 kat azaltılması önerilir. Eğer bir söz konusu değişiklikler devam ederse ilaç kesilmelidir.
Trombosit seviyesi 25x109 /l'nin altında veya granülosit seviyesi 0,5 x10 9 /l'nin altındaysa, 1 hafta sonra kan testi kontrolü ile Altevir ® ilacının iptal edilmesi önerilir.
İnterferon alfa-2b preparatları alan hastalarda, kan serumunda antiviral aktivitesini nötralize eden antikorlar tespit edilebilir. Hemen hemen tüm durumlarda, antikor titreleri düşüktür, görünümleri tedavinin etkinliğinde bir azalmaya veya diğer otoimmün bozuklukların ortaya çıkmasına neden olmaz.
aşırı doz
Altevir ® ilacının aşırı dozuna ilişkin veriler sağlanmamıştır.
ilaç etkileşimi
ilaç etkileşimi Altevier ve diğerleri arasında ilaçlar tam olarak araştırılmamıştır. Altevir ®, hipnotikler ve yatıştırıcılar, narkotik analjezikler ve potansiyel bir miyelodepresif etkiye sahip ilaçlarla eşzamanlı olarak dikkatle kullanılmalıdır.
Altevir ve teofilinin eşzamanlı atanmasıyla, ikincisinin kan serumundaki konsantrasyonu izlenmeli ve gerekirse dozaj rejimi değiştirilmelidir.
Altevir'i kemoterapi ilaçları (sitarabin, siklofosfamid, doksorubisin, teniposid) ile birlikte kullanırken, toksik etki geliştirme riski artar.
Eczanelerden dağıtım şartları
İlaç reçete ile verilir.
Depolama şartları ve koşulları
İlaç, SP 3.3.2-1248-03'e göre çocukların erişemeyeceği bir yerde, 2° ila 8°C sıcaklıkta saklanmalıdır; dondurmayın. Son kullanma tarihi - 18 ay.
2° ila 8°C arasındaki sıcaklıklarda nakliye; dondurmayın.
"Altevir (Altevir), Alfarona (Alfarona), Viferon (Viferon), Intron-A (Intron-A), Realdiron (Realdiron), Eberon alpha R (Eberon alfa R).
Kompozisyon ve serbest bırakma şekli
İnterferon alfa-2b. Enjeksiyon için liyofilize toz (1 şişede - 3 milyon IU, 5 milyon IU, 10 milyon IU, 30 milyon IU). Rekombinant interferon alfa-2b.
Enjeksiyon için çözüm (kalem şırınga - 10 milyon IU, 18 milyon IU, 25 milyon IU; 1 şişede - 10 milyon IU, 18 milyon IU, 25 milyon IU; 1 doz - 3 milyon IU, 5 milyon IU, 10 milyon ME ). İnsan rekombinant interferon alfa-2b. Rektal fitiller (150.000 ME, 500.000 ME).
farmakolojik etki
İlaç, parenteral uygulama için oldukça saflaştırılmış bir rekombinant interferon alfa-2b'dir. Bir bakteriyel plazmitin interferon sentezini kodlayan insan lökosit geni ile hibridizasyonu yoluyla bir Escherichia coli klonundan elde edilir. Molekül ağırlığı 19.300 dalton olan suda çözünür bir proteindir.
İnterferonların biyolojik aktivitesi, onları hücrelerin spesifik membran reseptörlerine bağlayarak kendini gösterir. İnterferon alfa-2b, tümör hücreleri üzerinde antiproliferatif bir etkiye ve ayrıca bir antiviral ve immünomodülatör etkiye sahiptir.
farmakokinetik
S/c ve/m uygulaması ile biyoyararlanımı %100'dür. - s / c uygulama ile 2-3 saat, intramüsküler enjeksiyon ile - 6-7 saat, intravenöz ile - 2 saat Plazma interferon konsantrasyonu sırasıyla 16.24 ve 4 saat sonra belirlenmedi. Alfa interferonlar, sitokrom P450 sisteminin mikrozomal karaciğer enzimlerinin aktivitesini azaltarak oksidatif metabolik süreçleri bozabilir. İdrarla atılır.
Belirteçler
Multipl miyelom (genelleştirilmiş formlar), tüylü hücreli lösemi, kronik miyelojenöz lösemi, malign melanom, kanser Mesane, yüzeysel olarak yerleştirilmiş genital kondilomatoz, laringopapillomatozis, Kaposi sarkomu, AIDS, kronik hepatit C, kronik hepatit B.
Başvuru
Kullanım ve tedavi rejimi, hastalığın tipine bağlıdır. Hamilelik sırasında, interferon alfa-2b, yalnızca annenin tedavisinin beklenen etkisinin fetusun potansiyel riskinden daha ağır bastığı durumlarda kullanılır.
İlacın bileşenleri GRM'ye nüfuz eder. Bu nedenle emzirme döneminde interferon alfa-2b kullanımının anne için önemine bağlı olarak ya Emzirme veya ilaç tedavisi. İlacın çocuklarda kullanım deneyimi azdır: İlacın çocuklara atanması dikkatlice gerekçelendirilmelidir.
Yan etki
Merkezi sinir sisteminde, ruh: sık sık - yorgunluk hissi, baş ağrısı; olası bilinç bozuklukları, baş dönmesi, ataksi, anksiyete, depresyon, sinirlilik, uyuşukluk, parestezi; nadiren - uykusuzluk; okülomotor sinirlerin felç gelişimi izole vakaları, görme bozuklukları açıklanmıştır.
CCC'de: olası hipertansiyon veya hipotansiyon; nadiren - taşikardi; izole ortostatik hipotansiyon gelişimi vakaları, nefes darlığı tarif edilmiştir.
PS'de: sıklıkla - iştahsızlık, mide bulantısı, artan ACT ve ALT seviyeleri (ilaç dozu 100 milyon IU / gün'den fazla kullanıldığında), alkalin fosfataz; olası kusma; nadiren - kabızlık, stomatit; bireysel dispepsi vakaları, artan tükürük, ülseratif stomatit, şişkinlik tanımladı.
Birleşik Krallık'ta: sıklıkla - trombositopeni, granülositopeni; bazı durumlarda - pıhtılaşma bozuklukları (protrombin ve kısmi tromboplastin zamanında artış), burun kanaması; ayrı purpura gelişimi vakaları açıklanmaktadır.
Deride: alopesi, geçici döküntü, kaşıntı; nadiren - ürtiker, furunküloz, herpetik döküntüler, uçuk; izole eritem gelişimi vakaları açıklanmaktadır.
Lokal reaksiyonlar: Enjeksiyon bölgesinde izole edilmiş inflamasyon vakaları tanımlanmıştır.
Diğer: sık sık - ateş, kas ağrısı; olası artralji; nadiren - kasılmalar baldır kasları, paroksismal ısı hissi, dehidratasyon, öksürük, kreatinin artışı; izole hapşırma vakalarını, burundan salgı çıkışının ihlallerini, hiperglisemi tarif etti.
