A.A. Almabekova, A.K. Kusainova, O.A. Almabekov

Kazahstansko nacionalno medicinsko sveučilište Asfendiyarov, Odjel za kemiju Tehnološko sveučilište Almaty Odjel za kemiju, kemijsko inženjerstvo i ekologiju

RAZVOJ NOVIH KOMPOZITNIH MATERIJALA OTPORNIH NA VATRU

Sažetak: Pozornost autora ovog članka privukli su poliimidi na bazi dianhidrida aril-alicikličkih poliheterocikala koji sadrže fluor. Ovi spojevi imaju jedinstvena svojstva, kao što su visoka toplinska i vatrootpornost, kemijska otpornost, topljivost, što ih uz ostale pozitivne osobine čini nezamjenjivima u modernoj tehnologiji. U tu svrhu razvijeni su kompozitni materijali na bazi aril-alicikličkih poliimida koji sadrže fluor, pronađeni su optimalni uvjeti za dobivanje epoksidnih spojeva aril-alicikličke strukture kao učvršćivača pomoću lignosulfonata, fizikalno-kemijska, električna i toplinska svojstva sintetiziranog poliimida proučavan.

Ključne riječi: dianhidridi, diamini, polikondenzacija, epoksi spojevi, poliimid, termoplastičnost, vatrootpornost, viskoznost.

Kazahstansko nacionalno medicinsko sveučilište nazvano po S.D. Asfendiyarova, Odjel za psihijatriju i narkologiju, Znanstveni klinički dijagnostički laboratorij

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA CITOKINA (PREGLED)

U ovom pregledu velika je pozornost posvećena ključnim i trenutno relevantnim pitanjima sadržaja citokina u različitim biološkim tekućinama u procjeni funkcionalne aktivnosti imunokompetentnih stanica i regulacije imunološkog odgovora. Ključne riječi Ključne riječi: citokini, imunokemija.

Citokini.

Citokini se trenutno smatraju proteinsko-peptidnim molekulama koje proizvode različite stanice tijela i provode međustanične i međusustavne interakcije. Citokini su univerzalni regulatori životnog ciklusa stanice, oni kontroliraju procese diferencijacije, proliferacije, funkcionalne aktivacije i apoptoze potonjih. Citokini koje proizvode stanice imunološkog sustava nazivaju se imunocitokini; oni predstavljaju klasu topivih peptidnih medijatora imunološkog sustava neophodnih za njegov razvoj, funkcioniranje i interakciju s drugim tjelesnim sustavima (Kovalchuk L.V. i sur., 1999.).

Kao regulacijske molekule, citokini imaju važnu ulogu u provedbi reakcija urođene i adaptivne imunosti, osiguravaju njihovu međusobnu povezanost, kontroliraju hematopoezu, upalu, cijeljenje rana i nastanak novih. krvne žile(angiogeneza) i mnogi drugi vitalni procesi. Trenutno postoji nekoliko različitih klasifikacija citokina, uzimajući u obzir njihovu strukturu, funkcionalnu aktivnost,

porijeklo, vrsta citokinskih receptora. Tradicionalno, u skladu s biološkim učincima, uobičajeno je razlikovati sljedeće skupine citokina.

1) Interleukini (IL-1 - IL-18) - sekretorni regulatorni proteini imunološkog sustava koji osiguravaju posredničku interakciju u

imunološki sustav i njegov odnos s drugim tjelesnim sustavima;

2) Interferoni (IFNa, IFNr, IFNu) - antivirusni proteini s izraženim imunoregulacijskim i antitumorsko djelovanje;

3) Čimbenici nekroze tumora (TNFa, TNFor - limfotoksin) - citokini s citotoksičnim i regulatornim djelovanjem;

4) Čimbenici koji stimuliraju kolonije (CSF) - stimulatori rasta i diferencijacije hematopoetskih stanica (GM-CSF, G-CSF, M-CSF);

5) Kemokini - hemoatraktanti za leukocite;

6) Čimbenici rasta - regulatori rasta, diferencijacije i funkcionalne aktivnosti stanica različite tkivne pripadnosti (faktor rasta fibroblasta, faktor rasta endotelnih stanica, epidermalni faktor rasta) i transformirajući faktor rasta - TGFr. Citokini se razlikuju po strukturi, biološkoj aktivnosti i nizu drugih značajki, ali imaju zajednička svojstva karakteristična za ovu klasu peptida. Tipično, citokini su glikozilirani polipeptidi srednje molekularne težine (manje od 30 kD). Citokine proizvode aktivirane stanice u niskim koncentracijama kratko vrijeme, a njihova sinteza uvijek počinje transkripcijom gena. Citokini svoj biološki učinak na stanice ostvaruju preko receptora na površini ciljnih stanica. Vezanje citokina na odgovarajući receptor dovodi do aktivacije stanica, njihove proliferacije, diferencijacije ili smrti.

Citokini svoje biološko djelovanje ostvaruju pretežno lokalno, djelujući na principu mreže. Oni mogu djelovati usklađeno i izazvati kaskadnu reakciju, uzastopno potičući sintezu nekih citokina od strane drugih. Takva složena interakcija citokina nužna je za nastanak upale i regulaciju imunoloških odgovora. Primjer sinergističke interakcije citokina je stimulacija upalnih reakcija IL-1, IL-6 i TNF, kao i sinteza IgE kombiniranim djelovanjem IL-4, IL-5 i IL-13. Antagonistička interakcija citokina također može biti negativan regulatorni mehanizam za kontrolu razvoja upalne reakcije i sinteze proupalnih i protuupalnih citokina (inhibicija proizvodnje IL-6 kao odgovor na porast koncentracije TNF). Citokinska regulacija funkcija ciljnih stanica može se provesti autokrinim, parakrinim ili endokrinim mehanizmom. Citokinski sustav uključuje stanice proizvođače; topljivi citokini i njihovi antagonisti; ciljne stanice i njihove receptore. Stanice proizvođači:

I. Glavna skupina stanica koje proizvode citokine u imunološkom sustavu su limfociti.

ThO proizvodi širok raspon citokina u vrlo niskim koncentracijama.

Th1 proizvode IL-2, IFN-a, IL-3, TNF-a, koji su neophodni za razvoj reakcija stanične imunosti (HNL, antivirusni,

antitumorska citotoksičnost itd.) Skup citokina koje luči Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-3) određuje razvoj humoralnog imunološkog odgovora. NA posljednjih godina opisuje subpopulaciju Th3 koja proizvodi TGFr koja suprimira funkciju Th1 i Th2.

T-citotoksični (CD8+), B-limfociti, prirodni ubojice su slabi proizvođači citokina.

II. Stanice serije makrofaga-monocita proizvode citokine koji pokreću imunološki odgovor i sudjeluju u reakcijama upale i regeneracije.

III. Stanice koje nisu dio imunološkog sustava: stanice vezivno tkivo, epitel, endotel spontano, bez antigene stimulacije, luče citokine koji podupiru proliferaciju hematopoetskih stanica, te autokrine faktore rasta (FGF, EGF, TFRR i dr.).

Imunološki status je kompleksan pokazatelj stanja imunološkog sustava, kvantitativna je i kvalitativna karakteristika stanja

funkcionalna aktivnost organa imunološkog sustava i neki nespecifični mehanizmi antimikrobne zaštite. Metode određivanja citokina. Određivanje sadržaja citokina u različitim biološkim tekućinama od velike je važnosti u procjeni funkcionalne aktivnosti

imunokompetentne stanice i regulacija imunološkog odgovora. U nekim slučajevima ( septički šok, bakterijski meningitis), kada citokini, posebice TNFa, djeluju kao vodeći faktor u patogenezi, određivanje njegovog sadržaja u krvi ili cerebrospinalna tekućina postaje glavna metoda imunološke dijagnostike.

Ponekad se u svrhu diferencijalne dijagnoze određuje razina citokina. Primjerice, kod bakterijskog meningitisa TNFα se dokazuje u cerebrospinalnoj tekućini, dok se kod virusnog meningitisa u njoj u pravilu nalazi samo IL-1. Međutim, određivanje prisutnosti citokina u krvnom serumu i drugim biološkim tekućinama može dati negativne rezultate zbog osobitosti ovih peptida. Budući da su uglavnom kratkotrajni regulatori, citokini imaju kratko vrijeme poluraspada (do 10 min). Neki citokini sadržani su u krvi u iznimno niskim koncentracijama, nakupljajući se uglavnom u žarištu upale, osim toga, biološka aktivnost citokina može biti maskirana kada se vežu na molekule inhibitora koje cirkuliraju u krvi.

Postoje tri različiti pristupi na kvantitativno određivanje citokina: imunokemijsko (ELISA), biotestiranje i molekularno biološko ispitivanje. Biološka ispitivanja su najviše

osjetljiva metoda, ali inferiorna u specifičnosti od ELISA-e. Postoje 4 vrste biotestiranja: prema citotoksičnom učinku, prema indukciji proliferacije, prema indukciji diferencijacije i prema antivirusni učinak. Prema sposobnosti indukcije proliferacije ciljnih stanica biotestirani su sljedeći citokini: 1b-1, 1b-2, 1b-4, 1b-5, 1b-6, 1b-7. Prema citotoksičnom učinku na osjetljive ciljne stanice ^929) testiraju se Tn-a i TNF-p. SHI-y je testiran na sposobnost induciranja ekspresije IHA II molekula na ciljnim stanicama. 8 testira se na sposobnost pojačavanja kemotaksije neutrofila. Biotestovi se više koriste u istraživačke svrhe ili za potvrdu ELISA rezultata.

Određivanje citokina u krvnom serumu i drugim biološkim materijalima korištenjem čvrste faze ELISA postalo je sve raširenije. Studija se provodi u skladu s protokolom priloženim dijagnostičkom testnom sustavu. Najčešće korištena varijanta sendvič ELISA, koja se sastoji u sljedećem: jedna vrsta mAb na određeni citokin imobilizira se na unutarnjoj površini jažica testnih ploča. Ispitni materijal i odgovarajući standardi i kontrole dodaju se u jažice tablete. Nakon inkubacije i ispiranja, druga mAb se dodaju u jažice drugom epitopu ovog citokina, konjugiranog s indikatorskim enzimom (peroksidaza hrena). Nakon inkubacije i ispiranja u stanice se unosi supstrat - vodikov peroksid s kromogenom. Tijekom enzimske reakcije mijenja se intenzitet boje jažica, što se mjeri na automatskom fotometru ploče.

ELISA s korištenjem mAb protiv pojedinih epitopa u molekuli citokina karakterizira visoka osjetljivost i specifičnost, osim toga, prednost metode je objektivno automatizirano bilježenje rezultata. Međutim, ova metoda također nije bez nedostataka, budući da detekcija prisutnosti molekula citokina još nije pokazatelj njihove biološke aktivnosti, mogućnost lažno pozitivnih rezultata zbog

zbog križno reagirajućih antigenih epitopa primjena ELISA-e ne omogućuje određivanje citokina u sastavu imunoloških kompleksa.

ELISA se razlikuje od biotestiranja nižom osjetljivošću uz visoku specifičnost i ponovljivost. Citokin se otkriva po njegovoj sposobnosti da se veže na dva različita monoklonska protutijela usmjerena protiv dva različita antigenska epitopa u molekuli citokina. Na primjer, koristi se kompleks streptavidin-enzim-enzimski supstrat. Međutim, sposobnost većine citokina da tvore komplekse sa serumskim proteinima itd. može značajno iskriviti rezultate kvantitativnog određivanja razine citokina. Molekularno biološke metode omogućuju određivanje ekspresije gena citokina u ispitivanom materijalu, tj. prisutnost odgovarajuće mRNA. Najosjetljivijom se smatra polimeraza reverzne transkriptaze lančana reakcija(RT-PCR). Reverzna transkriptaza (revertaza) koristi se za stvaranje kopija cDNA iz mRNA izolirane iz stanica. Količina cDNA odražava početnu količinu mRNA i neizravno odražava aktivnost proizvodnje ovog citokina. monociti krvi,

izazvan mitogenima: Con A, PGA, LPS. Interpretacija podataka kroz vrijeme omogućuje predviđanje daljnjeg tijeka kod organospecifičnih autoimunih bolesti, kod multiple skleroze, u procjeni učinkovitosti primijenjenih metoda imunoterapije tumora itd.

Testiranje bioloških učinaka općenito nije dovoljno osjetljivo, a ponekad i nedovoljno informativno. Prisutnost molekula inhibitora ili antagonista u istoj biološkoj tekućini može prikriti biološku aktivnost citokina. U isto vrijeme, različiti citokini često pokazuju istu biološku aktivnost. Osim toga, izvođenje bioloških testova zahtijeva posebnu dodatnu opremu, provodi se u nestandardnim uvjetima i koristi se prvenstveno u istraživačke svrhe. Zaključak.

Dakle, trenutno nema sumnje da su citokini najvažniji čimbenici imunopatogeneze. Proučavanje razine citokina omogućuje dobivanje informacija o funkcionalnoj aktivnosti različitih vrsta imunokompetentnih stanica, omjeru procesa aktivacije T-pomagača tipa I i II, što je vrlo važno u diferencijalnoj dijagnozi niza zaraznih i imunopatološki procesi.

BIBLIOGRAFIJA

1 Gumilevskaya O.P., Gumilevsky B.Yu., Antonov Yu.V. Sposobnost limfocita periferne krvi u bolesnika s peludnom groznicom da izlučuju IL-4, INF tijekom poliklonske stimulacije in vitro // Citokini i upala. Međunarodni znanstveni i praktičniškole – konferencije. - St. Petersburg: 2002. - T. 1. - S. 94-98.

2 Bulina O.V., Kalinina N.M. Analiza parametara citokinske veze imuniteta kod djece koja boluju od atopijskog dermatitisa // Citokini i upala. - 2002. - br. 2. - S. 92-97.

3 Sklyar L.F., Markelova E.V. Terapija citokinima rekombinantnim interleukinom-2 (ronkoleukinom) u bolesnika s virusni hepatitis// Citokini i upala. - 2002. - br. 4. - S. 43-66.

4 Marty C., Misset B, Tamion F, et al. Cirkulirajuće koncentracije interleukina-8 u bolesnika s višestrukim zatajenjem organa septičkog i neseptičkog podrijetla // Critical Care Medicine. - 1994. - V. 22. - P. 673-679.

5 Shaimova V.A., Simbirtsev, A.Yu.Kotov. Proupalni citokini u različitim vrstama naravno gnojni čir rožnica // Citokini i upala. Materijali međunarodne znanstveno-praktične škole. - St. Petersburg: 2002. - br. 2. - S. 52-58.

6 Teitelbaum S.L. Resorpcija kosti osteoklastima // Science. - 2000. - V. 289. - P. 1504-1508.

7 Borisov L.B. Medicinska mikrobiologija, virusologija, imunologija. - M.: 2002. - 736 str.

8 W. Paul Imunologija. - M.: Mir, 1987. - 274 str.

9 G. Frimel Imunološke metode. - M.: Medicina, 1987. - 472 str.

10 A.V. Karaulov Klinička imunologija. - M .: Medicinska informacijska agencija, 1999 - 604 str.

11 Lebedev K.A., Ponyakina I.D. imunološki nedostatak. - M.: Medicinska knjiga, 2003. - 240 str.

12 J. Klaus Limfociti. Metode. - M.: Mir, 1990. - 214 str.

13 Menshikov I.V., Berulova L.V. Osnove imunologije. Laboratorijske vježbe. - Izhevsk: 2001. - 134 str.

14 Petrov R.V. Imunologija. - M.: Medicina, 1987. - 329 str.

15 Royt A. Osnove imunologije. - M.: Mir, 1991. - 327 str.

16 Totolyan A.A., Freidlin I.S.// Stanice imunološkog sustava. 1,2 vol. - Sankt Peterburg, Znanost, - 2000 - 321s.

17 Stephanie D.V., Veltishchev Yu.E. Klinička imunologija djetinjstvo. - M.: Medicina, 1996. - 383 str.

18 Freidlin I.S., Totolyan A.A. Stanice imunološkog sustava. - St. Petersburg: Nauka, 2001. - 391 str.

19 Khaitov R.M., Ignatieva G.A., Sidorova I.G. Imunologija. - M.: Medicina, 2000. - 430 str.

20 Khaitov R.M., Pinegin B.V., Istamov Kh.I. Ekološka imunologija. - M.: VNIRO, 1995. - 219 str.

21 Belyaeva O. V., Kevorkov N. N. Utjecaj kompleksne terapije na pokazatelje lokalne imunosti u bolesnika s parodontitisom // Citokini i upala. - 2002. - T. 1. - Broj 4. - S. 34-37.

22 Y.T. Polimorfizam Chang citokinskog gena u kineskih pacijenata s psorijazom // British Journal of Dermatology. - 2007. -Vol. 156. - Str. 899-905.

23 W. Baran IL-6 i IL-10 promotivni polimorfizmi gena u psorijazi vulgaris // Acta Derm Venereol. - 2008. - Vol. 88.-Str. 113-116 (prikaz, ostalo).

24 L. Borska Imunološke promjene u TNF-alfa, sE-selektinu, sP-selektinu, sICAM-1 i IL-8 u pedijatrijskih bolesnika liječenih od psorijaze Goeckermanovim režimom // Pediatric Dermatology. - 2007. - Vol. 24. - Broj 6. - Str. 607-612.

25 M. O "Kane Povećana ekspresija nuklearnog receptora siročadi NURR1 u psorijazi i modulacija nakon inhibicije TNF-a // Journal of Investigative Dermatology. - 2008. - Vol. 128. - P. 300-310.

26 G. Fiorino Pregledni članak: anti-TNF-a inducirana psorijaza u bolesnika s upalnom bolesti crijeva // Aliment Pharmacol Ther. - 2009. - Vol. 29. - Str. 921-927.

27 ujutro Tobin, B. Kirby TNFa inhibitori u liječenju psorijaze i psorijatičnog artritisa // Biodrugs. - 2005. - Vol. 19. - Broj 1. - Str. 47-57.

28 A.B. Serwin Faktor nekroze tumora alfa (TNF-a) pretvara enzim i topivi TNF-a receptor tipa 1 u bolesnika s psorijazom u odnosu na kroničnu konzumaciju alkohola // Journal European Academy of Dermatology and Venereology. -2008. - Vol. 22. - Str. 712-717.

29 O. Arican Serumske razine TNF-a, IFN-y, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17 i IL-18 u bolesnika s aktivnom psorijazom i korelacija s težinom bolesti // Medijatori upale . - 2005. - Vol. 5. - Str. 273-279.

30 A. Mastroianni Citokinski profili tijekom monoterapije infliksimabom kod psorijatičnog artritisa // British Journal of Dermatology. -2005. - Vol. 153. - P. 531-536.

Pepeo. Oradova, K.Z. Saduakasova, S.D. Lesova

S.Zh. Asfendiyarov atyndagy K, azats ¥lttyts Medicinsko sveučilište Narcology zhene Psihijatrijski odjeli, gylym klinike-dijagnostika zertkhana

CYTOKINNYN, ZERTKHANALSHCH DIJAGNOSTIKA

Tušn: Sholuy bul ulken nazar man, yzdy belshgen jene sura; kekeikesp K; a3ipri ya; ytta er TYrli biologija; suyshtyk;tarda imuno kuzyrly zhasushalardy funkcionalan; belsendshkt bagalauda cytokinderdsch mazmuniya zhene immunodi zhauaptyn, retteuk

TYYindi sezder: citokin, imunitet; tysty kemija.

Pepeo. Oradova, K.Z. Saduakasova, S.D. Lesova

Kazahstansko nacionalno medicinsko sveučilište Asfendiyarov, Odjel za psihijatriju i narkologiju, znanstveni klinički i dijagnostički laboratorij

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA CITOKINA

Sažetak: U ovom pregledu velika pozornost posvećena je trenutno kritičnim i novonastalim pitanjima sadržaja citokina u različitim biološkim tekućinama u procjeni funkcionalne aktivnosti imunoloških stanica i regulacije imunološkog odgovora. Ključne riječi: citokini, imunokemija.

UDK 616.831-005.1-056:616.12-008.331.1

Pepeo. Oradova, A.D. Sapargalijeva, B.K. Djusembajev

Kazahstansko nacionalno medicinsko sveučilište nazvano po S.D. Asfendijarov, odjel patološka anatomija

MOLEKULARNI MARKERI ZA RAZVOJ ISHEMIJSKOG MOŽDANOG UDARA (PREGLED)

Nedavno je značajan broj studija posvećen potrazi za nasljednim čimbenicima koji predisponiraju razvoj vaskularne bolesti mozak. Jedan od glavnih smjerova u tim studijama je proučavanje uloge gena kandidata. U ovom pregledu sistematiziramo rezultate nedavnih molekularno-genetičkih studija o odnosu između različitih klasa "gena kandidata" i rizika od ishemijskog moždanog udara kod ljudi. Ključne riječi: ishemijski moždani udar, geni kandidati.

Trenutno je uloga takvih čimbenika rizika za razvoj ishemijskog moždanog udara, kao što su arterijska hipertenzija, ateroskleroza, srčane aritmije, srčani udar, pušenje, dijabetes melitus, poremećaji metabolizma lipida, promjene u sustavu hemostaze, uporaba oralnih kontraceptiva, zlouporaba

alkohol itd. Poznato je da se težina ishemijskog moždanog udara povećava kombinacijom nekoliko čimbenika rizika, među kojima su značajni arterijska hipertenzija, hiperkolesterolemija, porast razine lipoproteina niske gustoće i pušenje. Uvođenje u kliničku praksu racionalnog

Citokini su po svojoj prirodi proteini koje proizvode stanice imunološkog sustava (u literaturi se često nazivaju "čimbenici"). Oni su uključeni u diferencijaciju novorođenih stanica imunološkog sustava, dajući im određena svojstva koja su izvor raznolikosti. imunološke stanice a također osiguravaju međustaničnu interakciju. Kako bismo ovaj proces lakše razumjeli, možemo usporediti proizvodnju imunoloških stanica s tvornicom. U prvoj fazi identične praznine stanica napuštaju transporter, a zatim u drugoj fazi, uz pomoć različitih skupina citokina, svaka stanica je obdarena posebnim funkcijama i razvrstava se u skupine za naknadno sudjelovanje u imunološkim procesima. Tako se od identičnih stanica dobivaju T-limfociti, B-limfociti, neutrofili, bazofili, eozinofili, monociti.

Od interesa za znanost je osobitost utjecaja citokina na stanicu, što generira proizvodnju drugih citokina od strane ove stanice. To jest, jedan citokin pokreće proizvodnju drugih citokini.

Citokine, ovisno o djelovanju na imunološke stanice, dijelimo u šest skupina:

• Interferoni
• Interleukini
• čimbenici stimulacije kolonije
• čimbenici rasta
• Kemokini
• Čimbenici nekroze tumora

Interferoni su citokini koje proizvode stanice kao odgovor na virusnu infekciju ili druge mogućnosti podražaja. Ovi proteini (citokini) blokiraju reprodukciju virusa u drugim stanicama i sudjeluju u imunološkoj međustaničnoj interakciji.

Prvi tip (ima antivirusno i antitumorsko djelovanje):

interferon-alfa

interferon-beta

Interferon-gama

Interferoni alfa i beta imaju sličan mehanizam djelovanja, ali ih proizvode različite stanice.

Interferon alfa proizvode mononuklearni fagociti. Iz ovoga slijedi njegovo ime - " leukocitni interferon».

Interferon-beta proizvode fibroblasti. Otuda mu i naziv - fibroblastni interferon».

Interferoni prve vrste imaju svoje zadatke:

• Pospješuje proizvodnju interleukina (IL1)
• Snizite pH razinu u međustaničnom okruženju s povećanjem temperature
• Veže se za zdrave stanice i štiti ih od virusa
• Sposoban inhibirati staničnu proliferaciju (rast) blokiranjem sinteze aminokiselina
• Zajedno s prirodnim stanicama ubojicama potiču ili suzbijaju (ovisno o situaciji) stvaranje antigena

Interferon-gama proizvode T-limfociti i prirodne stanice ubojice. Nosi ime - imunološki interferon»

Interferon druge vrste također ima zadatke:

• Aktivira T-limfocite, B-limfocite, makrofage, neutrofile,
• Inhibira proliferaciju timocita,
• Jača stanični imunitet i autoimunitet,
• Regulira apoptozu normalnih i inficiranih stanica.

Interleukini(skraćeno IL) su citokini koji reguliraju interakciju između leukocita. Znanost je identificirala 27 interleukina.

čimbenici stimulacije kolonije su citokini koji reguliraju diobu i diferencijaciju matičnih stanica koštane srži i prekursora krvnih stanica. Ovi citokini su odgovorni za sposobnost limfocita da kloniraju, a također su sposobni stimulirati funkcionalnost stanica izvan koštane srži.

Čimbenici rasta – reguliraju rast, diferencijaciju i funkcionalnost stanica u različitim tkivima

Do danas su otkriveni sljedeći faktori rasta:

• transformirajući faktori rasta alfa i beta
• epidermalni faktor rasta
• faktor rasta fibroblasta
• faktor rasta trombocita
• faktor rasta živaca
• faktor rasta sličan inzulinu
• faktor rasta koji veže heparin
• faktor rasta endotelnih stanica

Najviše su proučavane funkcije transformirajućeg faktora rasta beta. Odgovoran je za suzbijanje rasta i aktivnosti T-limfocita, inhibira neke funkcije makrofaga, neutrofila, B-limfocita. Iako se ovaj čimbenik odnosi na čimbenike rasta, zapravo je uključen u obrnute procese, odnosno potiskuje imunološki odgovor (potiskuje funkcije stanica uključenih u imunološka zaštita), kada je infekcija eliminirana i rad imunoloških stanica više nije potreban. Pod utjecajem ovog čimbenika pojačava se sinteza kolagena i proizvodnja IgA imunoglobulina tijekom cijeljenja rana, te se stvaraju memorijske stanice.

Kemokini su citokini niske molekularne težine. Njihova glavna funkcija je privući leukocite iz krvotoka u žarište upale, kao i regulirati pokretljivost leukocita.

Čimbenici nekroze tumora(skraćeno TNF) su dvije vrste citokina (TNF-alfa i TNF-beta). Rezultati njihovog djelovanja: razvoj kaheksije (ekstremna iscrpljenost tijela kao posljedica usporavanja aktivnosti enzima, što pridonosi nakupljanju masti u tijelu); razvoj toksičnog šoka; inhibicija apoptoze (stanične smrti) stanica imunološkog sustava, indukcija apoptoze tumorskih i drugih stanica; aktivacija trombocita i zacjeljivanje rana; inhibicija angiogeneze (proliferacija krvnih žila) i fibrogeneze (degeneracija tkiva u vezivno tkivo), granulomatoze (stvaranje granuloma - proliferacija i transformacija fagocita) i mnogi drugi rezultati.

“Citokinski sustav. Klasifikacija. Glavni
Svojstva. Mehanizmi djelovanja. Vrste citokina
regulacija. Producentske i ciljne stanice.
Citokinska regulacija upale i imunološkog sustava
odgovor."
Ciklus 1 - Imunologija.
Lekcija #3 a.

Citokini

Signalne (bioregulacijske) molekule,
upravljanje gotovo svim procesima u
organizam - embriogeneza, hematopoeza,
procesi sazrijevanja i diferencijacije
stanice, aktivacija i smrt stanica, inicijacija i
održavanje različitih vrsta imunološkog odgovora,
razvoj upale, procesi popravljanja,
remodeliranje tkiva, koordinacija rada
imuno – neuro – endokrini sustav na razini
organizam u cjelini.

Citokini

Topljivi glikoproteini (više od 1300 molekula, 550 kDa) neimunoglobulinske prirode,
oslobađaju stanice domaćina
s neenzimskom aktivnošću na niskoj razini
koncentracije (od pikomolarnih do nanomolarnih),
djelujući preko specifičnih receptora
ciljne stanice koje reguliraju razne funkcije
tjelesne stanice.
Trenutno je poznato oko 200 citokina.

Citokini i životni ciklus
Stanice
Citokini – bioregulacijski
molekule koje kontroliraju
različite faze životnog ciklusa
Stanice:
procesi diferencijacije.
procesi proliferacije.
funkcionalni procesi
aktiviranje.
procesi stanične smrti.
Citokini i imunološki odgovor
Citokini igraju važnu ulogu u
provođenje reakcija kao
isto tako urođena
adaptivni imunitet.
Citokini pružaju
odnos između urođenih i
adaptivni imuni
odgovori.

Svojstva citokina

Karakterizira ga kratko razdoblje
Pola zivota:
citokini brzo
su inaktivirani i
su uništeni.
Većina citokina
djeluje lokalno
(parakrino - na stanicama
mikrookruženje).
Postoji više citokina od
receptore (mnogi citokini
koristiti zajedničku
podjedinice receptora) na
ciljne stanice za
signaliziranje jezgri
ciljne stanice
Pleiotropija je jedina
molekula može izazvati
mnoge efekte kroz
aktivacija raznih gena u
ciljne stanice
Konvergencija funkcija - Razno
molekule citokina mogu
izvesti u tijelu
slične funkcije
Polisferizam – mnogo
citokini mogu
proizvoditi isti
ista stanica kao odgovor na jednu
poticaj

Plejotropija citokina na primjeru interferona-gama

granulociti
endotel
aktiviranje
aktiviranje
lučenje
interferon-gama
makrofagi
aktiviranje
NK
aktiviranje
mnoge vrste stanica
promocija
antivirusno
aktivnost
Aktivacija T stanica
mnoge vrste stanica
diferencijacija
U stanicama
indukcija izraza
MHC I ili MHCII

Tipovi regulacije citokina

Parakrina regulacija (u
većini slučajeva
citokini djeluju lokalno,
na mjestu upale).
Autokrina regulacija -
proizvodi se citokin
stanica, za njega je stanica proizvođač ovoga
citokin izražava
receptore, kao rezultat
citokin djeluje na stanicu
proizvodeći ga.
Endokrina regulacija -
usporenog djejstva:
interleukin 1 -beta -
endogeni pirogen
(utječe na centar
termoregulacija u mozgu
mozak),
interleukin 6 djeluje na
hepatocita, uzrokujući sintezu
proteini akutne faze
čimbenici rasta
djeluju na koštanu srž
aktiviraju hematopoezu itd.

10. Razumijevanje citokinskog sustava u kliničkoj praksi

Za klinička praksa važno
pratiti glavni lanac
interakcije u
imunopatogeneza
bolesti:
1. Stanice proizvođača
citokini.
2. Citokini i njihovi antagonisti.
3. Ciljne stanice,
ekspresijske receptore
citokini.
4. Proizveden od citokina
učinaka na razini tijela.
Namjena: razvoj i implementacija u
uvježbavanje novih strategija
terapija bolesti:
citokinsku terapiju
(klinička uporaba)
pripravci citokina)
ili
anticitokinsku terapiju
(klinička uporaba)
antagonisti citokina ili
monoklonska antitijela na
citokini).

11. Glavne vrste citokina - uobičajene kratice: interleukini

U ranijem
klasifikacije citokina
korištena je podjela
po principu stanica
sintetizirajući citokine:
limfokini (citokini,
izlučuje uglavnom
aktivirao T
pomoćni limfociti)
i
monokini (citokini,
luče stanice
serija monocitnih makrofaga)
Ovaj pristup nije uvijek opravdan.
što se tiče citokina
karakteriziran djelomičnim
preklapanje funkcija.
Kao rezultat toga, uveden je
jedinstven izraz "interleukini"
IL (ili IL):
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,1
5,16,17 …..35
Izraz "interleukini" znači
molekule uključene u
odnosi, razgovori
između leukocita.

12. Glavne vrste citokina - općeprihvaćene kratice:

čimbenici nekroze tumora
(TNF ili TNF)
TNF- (kahektin)
TNF- (limfotoksin)
Interferoni (IFN ili IFN)
IFN-ovi i IFN-ovi
IFN
transformirajući rast
faktori:
transformativni
faktor rasta -alfa -
TGF-
transformativni
faktor rasta -beta -
TGF-
-kemokini:
IL-8
NAP-2 (aktivacija neutrofila
protein-2)
PF-4 (trombocitni faktor 4)

13. Glavne vrste citokina - općeprihvaćene kratice:

stimuliranje kolonija
faktori:
G-CSF – kolonija granulocita
stimulirajući faktor
GM - CSF - stimulacija kolonija granulocitnih makrofaga
faktor
M - CSF - kolonija makrofaga
stimulirajući faktor
Multi-CSF-IL-3
Limfokini se izlučuju u
uglavnom aktiviran T h
Stanice:
MAF - aktiviranje makrofaga
faktor
MCF - kemotaktika makrofaga
faktor
Migracija MMIF-makrofaga
faktor inhibicije
LMIF- migracija leukocita
faktor inhibicije

14. Glavne vrste citokina - općeprihvaćene kratice:

Rast polipeptida
faktori stanica:
a FGF - kiseli fibroblast
faktor rasta
b FGF - osnovni fibroblast
faktor rasta
EGF - epidermalni rast
faktor
NGF – faktor rasta živaca
PDGF-potječe od trombocita
faktor rasta
VEGF - vaskularni endotel
faktor rasta
Moderne domaće knjige i
časopisi

15. Klasifikacija citokina na temelju njihovih bioloških učinaka

1. Interleukini (IL-1 ÷
IL-35) - signal
molekule,
djelujući između
leukocita.
2. Čimbenici nekroze
tumori - citokini sa
citotoksični i
regulatorni
djelovanje (TNF).
3. Interferoni -
antivirusno
citokini:
tip 1 - IFN α, β itd.
2 tipa - IFN γ
4. Čimbenici rasta matičnih stanica (IL-3, IL
-7, IL-11, eritropoetin, trombopoetin,
čimbenici stimulacije kolonija (CSF): GMCSF (granulocitno-makrofagni
faktor stimulacije kolonija), G-CSF
(granulocitni likvor), M-CSF
(makrofagni likvor), regul
hematopoeze.
5. Kemokini (CC, CXC (IL-8), CX3C, C),
reguliranje kemotaksije raznih stanica.
6. Faktori rasta stanica (faktor rasta
fibroblasti, faktor rasta
endotelne stanice, faktor rasta
epidermis, itd.), transformirajući
faktor rasta – uključeni su u regulaciju
rast, diferencijacija različitih stanica.

16. Klasifikacija citokina na temelju njihove uloge u regulaciji upale

Proupalni
Sintetizirani su
pretežno
aktivirane stanice
monocit/makrofag
redati i povećavati
upalna aktivnost
postupak.
Proupalni citokini
mnogo više od
protuupalno.
Protuupalni
Uglavnom T-stanice
citokini koji smanjuju
aktivnost upale.
IL-10,
THF β (transformirajući
faktor rasta beta);
kao i receptor
antagonista interleukina-1
(ŽELJEZNICA).

17. Citokini s regulacijskim (protuupalnim) djelovanjem

citokin
Posljedica
IL-10
potiskuje proizvodnju
citokini, potiskuje
aktivacija T-pomagača tipa 1
TRF - beta 1
(transformativno
faktor rasta-beta 1)
inhibira aktivaciju tipova pomoćnika 1 i 2,
potiče rast
fibroblasti

18. 1. Citokini urođene imunosti

Glavne stanice koje proizvode su stanice
mijeloidni
podrijetlo.
Nakon aktivacije
prepoznavanje slike
receptore
počinje
unutarstanični
signalna kaskada,
dovodi do
aktivacija gena
proupalni
citokini i
interferon tip 1
(α; β itd.).

19. RECEPTORIMA IMUNITETA PREPOZNAVANJE PATOGENA

uzročnici bolesti
Povezano s patogenom
molekularne strukture ili uzorci
(PAMPs)
Receptori za prepoznavanje uzoraka (PRR):
1. Topiv (sustav komplementa)
2. Membrana (TLRs - Toll-like receptors, CD14)
3. Intracelularni (NOD, itd.).

20.

Signalni putovi receptora nalik cestarini
Dimeri Toll-like receptora
Stanični
membrana
TIR domene
MojD88
IRAK-1
TRIF
IRAK-4
TRAF6
TAK1
IKKa
JNK
TBK
1
IKKb
IRF3
AP-1
NFkB
Ekspresija gena citokina iz obitelji IL-1,
proupalne citokine i kemokine
ANTIBAKTERIJSKA ZAŠTITA
Ekspresija gena za interferon
ANTIVIRUSNA ZAŠTITA

21. Funkcionalna aktivnost proupalnih citokina ovisno o njihovoj koncentraciji - lokalno i sistemsko djelovanje

Na lokalnoj razini
Najraniji učinak
proupalnih citokina
je povećati ljepljivost
svojstva endotela i privlačnost
aktivirane stanice u žarištu
upale s periferne
krv.
Proupalni citokini
kontrolira lokalnu upalu
njegove tipične manifestacije
(otok, crvenilo, izgled
bolni sindrom).
Na razini sustava
S povećanjem koncentracije
proupalni
citokina u krvi
rade praktično
svih organa i sustava
sudjelovanje u
održavanje homeostaze
Primjer ovisnosti učinaka proupalnih citokina o njihovim
razine u krvi mogu poslužiti kao faktor nekroze tumora-alfa

22.

RAZINE PROUPALNIH CITOKINA U PLAZMI
10-7 M
TNF
10-8 M
10-9 M
lokalna upala
Sistemski
upalni
reakcija
Septički šok
aktivacija fagocitoze i
produkti kisika
radikali. dobitak
ekspresija molekula
adhezija na endotel.
Stimulacija sinteze
citokini i kemokini.
Povećanje metabolizma
vezivno tkivo.
Groznica.
Povećanje razina
steroidni hormoni.
Leukocitoza.
Povećanje sinteze
akutna faza
bjelančevine.
Smanjena kontraktilnost
miokarda i glatkih mišićnih stanica krvnih žila.
Povećanje propusnosti
endotel. Kršenje
mikrocirkulacija. Pad
krvni tlak.
Hipoglikemija.

23. Uloga nekih citokina u patogenezi upalnih odgovora: Jačanje reakcija urođenog imunološkog odgovora

citokin
Posljedica
IL-6
Odgovor akutne faze (djelovanje na hepatocite)
IL-8
Faktor kemotaksije za neutrofile i druge leukocite
Faktor nekroze
tumori -
alfa (TNF-α)
Aktivira neutrofile, endotelne stanice, hepatocite
(proizvodnja proteina akutne faze), katabol
učinak – dovodi do kaheksije
Interferonalfa (IFNα)
Aktivira makrofage, endotelne stanice, prirodne
ubojice

24. Interleukin-1-beta: svojstva

Ćelija - meta
Posljedica
makrofagi,
fibroblasti,
osteoblasti,
epitel
proliferacija, aktivacija
osteoklasti
Jačanje procesa reapsorpcije u kostima
Hepatociti
Sinteza proteina akutne faze upale
Stanice
hipotalamus
Sinteza prostaglandina i kasnije
porast tjelesne temperature

25. Interleukin-1-beta: svojstva

ciljna stanica
Posljedica
T-limfociti
proliferacija, diferencijacija,
sinteza i izlučivanje citokina,
povećana razina ekspresije
receptore za IL-2
B-limfociti
Proliferacija, diferencijacija
Neutrofili
Oslobađanje iz koštane srži
kemotaksija, aktivacija
Endotel
Aktivacija ekspresije adhezijskih molekula

26. Biološko značenje djelovanja citokina u sustavnoj upali

Na razini holističkog
citokini organizma
komunicirati između
imun, nervozan,
endokrini, hematopoetski i
drugim sustavima
regulacija homeostaze i
služe za njihovo uključivanje
organizacija jedinstvenog
obrambena reakcija.
Citokini pružaju
"upozorenje",
znači da je vrijeme
vrijeme za uključivanje svih rezervi,
prebaciti energiju
teče i obnavlja rad
svi sustavi za izvođenje
jedan, ali najvažniji
zadatak preživljavanja – borba
s unesenim patogenom.
Primjer višestrukih učinaka proupalnih citokina
interleukin 1 beta može poslužiti kao okidač za sustavnu upalu

27.

INFα
IL-6
IL-12, IL-23
TNFα
IL-1β
IL-8
Sinteza citokina
Regulacija
temperatura,
ponašanje,
sinteza hormona
Aktivacija limfocita
IL-1β
Ekspresija molekula
adhezija na endoteliocite,
prokoagulantna aktivnost,
sinteza citokina
Proizvodnja proteina
akutna faza upale
PG
Aktivacija
hematopoeze
LT
NE
Aktivacija fagocitoze
Aktivacija iNOS-a i metabolizma
arahidonske kiseline

28. IL-1 i TNF-

IL-1 i TNF-
Interleukin-1 - beta (IL-1)
i faktor nekroze
tumori-alfa (TNF-)
igraju glavnu ulogu u
upalne reakcije,
od uvoda
antagonista receptora
interleukin 1 (IL-1 ra) i
također monoklonski
protutijela ili topljivi
TNF-receptori
blokovi oštri i
kronični
upalne reakcije u
eksperimenti na
životinje.
.
Neki od ovih
antagonisti i
monoklonski
već antitijela
korišteno u
klinika, na primjer
u liječenju sepse,
reumatoidni
artritis, sistemski
lupus erythematosus i
druge bolesti
osoba.

29. Čimbenici rasta

citokin
GM-CSF
(granulocitno-makrofagni
faktor stimulacije kolonije)
M-CSF
(Makrofagi - stimuliraju kolonije
faktor)
G-CSF
(stimulacija kolonija granulocita
faktor)
Posljedica
stimulirati rast i
diferencijacija
progenitorske stanice
monociti i
polimorfonuklearni leukociti

30.

31.

REGULACIJA STEČENOG IMUN
Citokini - rast i diferencijacija
čimbenici svih vrsta T- i B-limfocita
Glavne funkcije: regulacija diferencijacije klonova T-helpera određivanje vrsta upale tkiva, efektorskih T-stanica i klasa antitijela
Th1 - vrsta stanice koji uključuju makrofage
i T-limfociti (granulom

S tuberkulozom; sa sarkoidozom, kontaktnim dermatitisom, Crohnovom bolešću)
Th2 - alergijski tip odgovora koji uključuje histamin i prostaglandine
T h 17 - neutrofilna upala
Tfn (folikularni T pomagači) – humoralni imunološki odgovor
T reg –T h regulatorno (ograničenje snage svih vrsta imunološkog odgovora i
upala)

Citokini su oko 100 složenih proteina uključenih u mnoge imunološke i upalne procese u ljudskom tijelu. Ne nakupljaju se u stanicama koje ih proizvode i brzo se sintetiziraju i izlučuju.

Ispravno funkcioniranje citokina održava rad imunološkog sustava glatkim i učinkovitim. Njihova karakteristika je svestranost djelovanja. U većini slučajeva oni pokazuju kaskadni učinak, koji se temelji na međusobnoj neovisnoj sintezi drugih citokina. Upalni proces koji se razvija kontroliraju međusobno povezani proupalni citokini.

Što su citokini

Citokini su velika skupina regulatornih proteina čija se molekulska masa kreće od 15 do 25 kDa (kilodalton je jedinica atomske mase). Djeluju kao posrednici međustanične signalizacije. Njihova karakteristika je prijenos informacija između stanica na kratkim udaljenostima. Oni su uključeni u kontrolu ključnih životnih procesa u tijelu. Oni su odgovorni za početak proliferacija, tj. proces umnožavanja stanica, zatim njihove diferencijacije, rasta, aktivnosti i apoptoze. Citokini određuju humoralnu i staničnu fazu imunološkog odgovora.

Citokini se mogu smatrati vrstom hormoni imunološkog sustava. Među ostalim svojstvima ovih proteina posebno se izdvaja sposobnost utjecaja na energetsku ravnotežu tijela kroz promjene u apetitu i brzini metabolizma, utjecaj na raspoloženje, funkcije i strukture kardiovaskularnog sustava, te povećana pospanost.

Posebnu pozornost treba posvetiti proupalne i protuupalne citokine. Prevladavanje prvog dovodi do upalne reakcije s vrućicom, ubrzanim disanjem i leukocitozom. Drugi imaju prednost generiranja protuupalnog odgovora.

Značajke citokina

Glavne karakteristike citokina:

• zalihost- sposobnost da proizvede isti učinak
• pliotropija- sposobnost utjecaja na različite vrste stanica i izazivanja različitih djelovanja u njima
• sinergija- interakcija
• indukcija faze pozitivne i negativne povratne sprege
• antagonizam– Međusobno blokiranje učinaka djelovanja

Citokini i njihov učinak na druge stanice

Citokini posebno djeluju na:

• Limfociti B su stanice imunološkog sustava odgovorne za humoralni imunološki odgovor, tj. proizvodnja antitijela;
• T-limfociti - stanice imunološkog sustava odgovorne za stanični imunološki odgovor; oni proizvode, posebno, Th1 i Th2 limfocite, između kojih se opaža antagonizam; Th1 potporni odgovor stanica i Th2 humoralni odgovor; Th1 citokini negativno utječu na razvoj Th2, i obrnuto;
• NK stanice – skupina stanica imunološkog sustava koja je odgovorna za fenomene prirodne citotoksičnosti (toksični učinci na citokine koji ne zahtijevaju stimulaciju specifičnih mehanizama u obliku protutijela);
• Monociti su morfološki elementi krvi, nazivaju se bijele krvne stanice;
• Makrofagi su populacija stanica u imunološkom sustavu koja dolazi od prekursora krvnih monocita; djeluju i u procesima urođene imunosti i stečene (adaptivne);
• Granulociti su vrsta bijelih krvnih stanica koje pokazuju svojstva fagocita, što treba shvatiti kao sposobnost apsorbiranja i uništavanja bakterija, mrtvih stanica i nekih virusa.

Proupalni citokini

Proupalni citokini sudjeluju u regulaciji imunološkog odgovora i hematopoeze (proces stvaranja i diferencijacije morfotskih krvnih elemenata) te iniciraju razvoj upalne reakcije. Često se nazivaju imunotransmiterima.

Glavni proupalni citokini uključuju:

• TNF ili faktor nekroze tumora, ranije zvan kektsin. Pod tim nazivom je skupina proteina koji određuju aktivnost limfocita. Oni mogu pokrenuti apoptozu, prirodni proces programirane smrti. stanice raka. Izoliraju se TNF-α i TNF-β.
• IL-1, tj. interleukin 1. Jedan je od glavnih regulatora upalnog imunološkog odgovora. Posebno aktivno sudjeluje u upalnim reakcijama crijeva. Među njegovih 10 varijanti razlikuju se IL-1α, IL-1β, IL-1γ. Trenutno se opisuje kao interleukin 18.
• IL-6, odnosno interleukin 6, koji ima pleiotropni ili višesmjerni učinak. Njegova koncentracija raste u serumu bolesnika s ulceroznim kolitisom. Potiče hematopoezu, pokazujući sinergiju s interleukinom 3. Potiče diferencijaciju B-limfocita u plazma stanice.

Protuupalni citokini

Protuupalni citokini smanjuju upalni odgovor supresijom proizvodnje proupalnih citokina od strane monocita i makrofaga, posebice IL-1, IL-6, IL-8.

Među glavnim protuupalnim citokinima posebno se spominju IL-10, odnosno interleukin 10 (čimbenik koji inhibira sintezu citokina), IL 13, IL 4, koji kao rezultat indukcije lučenja citokina koji utječu na hematopoezu, ima pozitivan učinak na proizvodnju krvnih stanica.

U ovom poglavlju razmatrat će se integrirani pristup procjeni citokinskog sustava pomoću prethodno opisanih suvremenih istraživačkih metoda.

Prvo ćemo prikazati osnovne koncepte citokinskog sustava.

Citokini se trenutno smatraju proteinsko-peptidnim molekulama koje proizvode različite stanice tijela i provode međustanične i međusustavne interakcije. Citokini su univerzalni regulatori životnog ciklusa stanice, oni kontroliraju procese diferencijacije, proliferacije, funkcionalne aktivacije i apoptoze potonjih.

Citokini koje proizvode stanice imunološkog sustava nazivaju se imunocitokini; oni predstavljaju klasu topivih peptidnih medijatora imunološkog sustava neophodnih za njegov razvoj, funkcioniranje i interakciju s drugim tjelesnim sustavima (Kovalchuk L.V. i sur., 1999.).

Kao regulatorne molekule, citokini imaju važnu ulogu u provedbi reakcija urođene i adaptivne imunosti, osiguravaju njihovu međusobnu povezanost, kontroliraju hematopoezu, upalu, cijeljenje rana, stvaranje novih krvnih žila (angiogeneza) i mnoge druge vitalne procese.

Trenutno postoji nekoliko različitih klasifikacija citokina, uzimajući u obzir njihovu strukturu, funkcionalnu aktivnost, podrijetlo i vrstu citokinskih receptora. Tradicionalno, u skladu s biološkim učincima, uobičajeno je razlikovati sljedeće skupine citokina.

1. Interleukini(IL-1-IL-33) - sekretorni regulatorni proteini imunološkog sustava, osiguravajući interakcije posrednika u imunološkom sustavu i njegovu vezu s drugim tjelesnim sustavima. Interleukine prema funkcionalnoj aktivnosti dijelimo na pro- i protuupalne citokine, faktore rasta limfocita, regulacijske citokine itd.

3. Čimbenici nekroze tumora (TNF)- citokini s citotoksičnim i regulatornim djelovanjem: TNFa i limfotoksini (LT).

4. Čimbenici rasta hematopoetskih stanica- faktor rasta matičnih stanica (Kit - ligand), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoetin, trobopoetin, čimbenik stimulacije kolonija granulocita-makrofaga - GM-CSF, granulocitni likvor - G-CSF, makrofag-

ny KSF - M-CSF).

5. Kemokini- S, SS, SHS (IL-8), SH3S - regulatori kemotaksije različitih vrsta stanica.

6. Čimbenici rasta nelimfoidnih stanica- regulatori rasta, diferencijacije i funkcionalne aktivnosti stanica različite tkivne pripadnosti (faktor rasta fibroblasta - FGF, faktor rasta endotelnih stanica, epidermalni faktor rasta - epidermalni EGF) i transformirajući faktori rasta (TGFβ, TGFα).

Među ostalim, posljednjih godina aktivno se proučava faktor koji inhibira migraciju makrofaga (inhibicijski faktor migracije - MIF), koji se smatra neurohormonom s citokinskom i enzimskom aktivnošću (Suslov A.P., 2003; Kovalchuk L.V. et al. ,

Citokini se razlikuju po strukturi, biološkoj aktivnosti i drugim svojstvima. Međutim, uz razlike, citokini imaju opća svojstva, karakterističan za ovu klasu bioregulacijskih molekula.

1. Citokini su u pravilu glikozilirani polipeptidi srednje molekulske mase (manje od 30 kD).

2. Citokine proizvode stanice imunološkog sustava i druge stanice (na primjer, endotel, fibroblasti itd.) kao odgovor na aktivirajući podražaj (molekularne strukture povezane s patogenom, antigeni, citokini itd.) i sudjeluju u reakcijama urođene i adaptivne imunosti, regulirajući njihovu snagu i trajanje. Neki citokini se sintetiziraju konstitutivno.

3. Izlučivanje citokina je kratak proces. Citokini ne postoje kao prethodno oblikovane molekule, već

sinteza uvijek počinje transkripcijom gena. Stanice proizvode citokine u niskim koncentracijama (pikograma po mililitru).

4. U većini slučajeva citokini se proizvode i djeluju na ciljne stanice koje su u neposrednoj blizini (djelovanje kratkog dometa). Glavno mjesto djelovanja citokina je međustanična sinapsa.

5. Redundancija Citokinski sustav očituje se u činjenici da je svaka vrsta stanice sposobna proizvesti nekoliko citokina, a svaki citokin mogu lučiti različite stanice.

6. Karakterizirani su svi citokini pleiotropija, odnosno multifunkcionalnost djelovanja. Dakle, manifestacija znakova upale posljedica je utjecaja IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Dupliciranje funkcija osigurava pouzdanost citokinskog sustava.

7. Djelovanje citokina na ciljne stanice posredovano je visoko specifičnim membranskim receptorima visokog afiniteta, koji su transmembranski glikoproteini, koji se obično sastoje od više od jedne podjedinice. Izvanstanični dio receptora odgovoran je za vezanje citokina. Postoje receptori koji eliminiraju višak citokina u patološkom fokusu. To su takozvani receptori mamac. Topljivi receptori su izvanstanična domena membranskog receptora odvojena enzimom. Topljivi receptori sposobni su neutralizirati citokine, sudjelovati u njihovom transportu do žarišta upale i u izlučivanju iz tijela.

8. Citokini rade kao mreža. Oni mogu djelovati usklađeno. Čini se da su mnoge funkcije koje su izvorno pripisane jednom citokinu rezultat usklađenog djelovanja nekoliko citokina. (sinergizam akcije). Primjeri sinergističke interakcije citokina su stimulacija upalnih reakcija (IL-1, IL-6 i TNFa), kao i sinteza IgE

(IL-4, IL-5 i IL-13).

Neki citokini induciraju sintezu drugih citokina (kaskada). Kaskadno djelovanje citokina neophodno je za razvoj upalnih i imunoloških odgovora. Sposobnost nekih citokina da povećaju ili smanje proizvodnju drugih određuje važne pozitivne i negativne regulatorne mehanizme.

Poznat je antagonistički učinak citokina, na primjer, proizvodnja IL-6 kao odgovor na povećanje koncentracije TNF-a može biti

negativni regulatorni mehanizam za kontrolu proizvodnje ovog medijatora tijekom upale.

Citokinska regulacija funkcija ciljnih stanica provodi se pomoću autokrinih, parakrinih ili endokrinih mehanizama. Neki citokini (IL-1, IL-6, TNFα itd.) mogu sudjelovati u provedbi svih navedenih mehanizama.

Odgovor stanice na utjecaj citokina ovisi o nekoliko čimbenika:

Od vrste stanica i njihove početne funkcionalne aktivnosti;

Iz lokalne koncentracije citokina;

Od prisutnosti drugih molekula posrednika.

Stoga stanice proizvođači, citokini i njihovi specifični receptori na ciljnim stanicama tvore jedinstvenu posredničku mrežu. To je skup regulacijskih peptida, a ne pojedinačni citokini, koji određuju konačni odgovor stanice. Trenutno se sustav citokina smatra univerzalnim sustavom regulacije na razini cijelog organizma, koji osigurava razvoj zaštitnih reakcija (na primjer, tijekom infekcije).

Posljednjih godina pojavila se ideja o sustavu citokina koji kombinira:

1) stanice proizvođača;

2) topljivi citokini i njihovi antagonisti;

3) ciljne stanice i njihovi receptori (slika 7.1).

Povrede različitih komponenti citokinskog sustava dovode do razvoja brojnih patoloških procesa, pa je otkrivanje nedostataka u ovom regulatornom sustavu važno za ispravnu dijagnozu i imenovanje odgovarajuće terapije.

Razmotrimo prvo glavne komponente citokinskog sustava.

Stanice koje proizvode citokine

I. Glavna skupina stanica koje proizvode citokine u adaptivnom imunološkom odgovoru su limfociti. Stanice u mirovanju ne izlučuju citokine. Nakon prepoznavanja antigena i uz sudjelovanje receptorskih interakcija (CD28-CD80/86 za T-limfocite i CD40-CD40L za B-limfocite), dolazi do aktivacije stanica, što dovodi do transkripcije gena za citokine, translacije i izlučivanja glikoziliranih peptida. u izvanstanični prostor.

Riža. 7.1. Citokinski sustav

CD4 T-helperi predstavljeni su subpopulacijama: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, koje se međusobno razlikuju po spektru izlučenih citokina kao odgovora na različite antigene.

Th0 proizvode širok raspon citokina u vrlo niskim koncentracijama.

Smjer diferencijacije Th0 određuje razvoj dvaju oblika imunološkog odgovora s prevlašću humoralnih ili staničnih mehanizama.

Priroda antigena, njegova koncentracija, lokalizacija u stanici, vrsta stanica koje prezentiraju antigen i određeni skup citokina reguliraju smjer diferencijacije Th0.

Dendritičke stanice, nakon hvatanja i obrade antigena, prezentiraju antigene peptide Th0 stanicama i proizvode citokine koji reguliraju smjer njihove diferencijacije u efektorske stanice. Uloga pojedinih citokina u ovom procesu prikazana je na sl. 7.2. IL-12 inducira sintezu IFNγ od strane T-limfocita i ]ChGK. IFNu omogućuje diferencijaciju Th1, koji počinju lučiti citokine (IL-2, IFNu, IL-3, TNFa, limfotoksine), koji reguliraju razvoj reakcija na intracelularne patogene

(odgođena preosjetljivost (DTH) i različite vrste stanične citotoksičnosti).

IL-4 osigurava diferencijaciju Th0 u Th2. Aktivirani Th2 proizvodi citokine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 itd.), koji određuju proliferaciju B-limfocita, njihovu daljnju diferencijaciju u plazma stanice i razvoj odgovora protutijela, uglavnom na izvanstanični patogeni.

IFNy negativno regulira funkciju Th2 stanica i, obrnuto, IL-4, IL-10, koje luči Th2, inhibiraju funkciju Th1 (slika 7.3). Molekularni mehanizam ove regulacije povezan je s transkripcijskim faktorima. Ekspresija T-bet i STAT4, određena IFNy, usmjerava diferencijaciju T-stanica duž Th1 puta i potiskuje razvoj Th2. IL-4 inducira ekspresiju GATA-3 i STAT6, što, sukladno tome, osigurava pretvorbu naivnih Th0 u Th2 stanice (slika 7.2).

Posljednjih godina opisana je jasna subpopulacija T pomoćnih stanica (Th17) koje proizvode IL-17. Članovi obitelji IL-17 mogu se eksprimirati pomoću aktiviranih memorijskih stanica (CD4CD45RO), y5T stanica, NKT stanica, neutrofila, monocita pod utjecajem IL-23, IL-6, TGFβ koje proizvode makrofagi i dendritične stanice. ROR-C je glavni faktor diferencijacije kod ljudi, a ROR-γ kod miševa. l Kardinalna uloga IL-17 u razvoju kronične upale i autoimuna patologija (vidi sliku 7.2).

Osim toga, limfociti T u timusu mogu se diferencirati u prirodne regulatorne stanice (Treg) koje izražavaju CD4+ CD25+ površinske markere i transkripcijski faktor FOXP3. Ove stanice mogu potisnuti imunološki odgovor posredovan Th1 i Th2 stanicama kroz izravni međustanični kontakt i sintezu TGFβ i IL-10.

Sheme diferencijacije Th0 klonova i citokina koje oni izlučuju prikazane su na Sl. 7.2 i 7.3 (vidi i umetak u boji).

T-citotoksične stanice (CD8 +), prirodne ubojice - slabi proizvođači citokina, kao što su interferoni, TNFa i limfotoksini.

Prekomjerna aktivacija jedne od subpopulacija Th može odrediti razvoj jedne od varijanti imunološkog odgovora. Kronična neravnoteža aktivacije Th može dovesti do stvaranja imunopatoloških stanja povezanih s manifestacijama

mi alergije, autoimune patologije, kronični upalni procesi itd.

Riža. 7.2. Različite subpopulacije T-limfocita koji proizvode citokine

II. U urođenom imunološkom sustavu glavni proizvođači citokina su mijeloidne stanice. Koristeći Toll-like receptore (TLR), oni prepoznaju slične molekularne strukture različitih patogena, takozvane molekularne obrasce povezane s patogenom (PAMP), npr. ponavljanja, itd. Kao rezultat

Ova interakcija s TLR-om pokreće unutarstaničnu kaskadu transdukcije signala koja dovodi do ekspresije gena za dvije glavne skupine citokina: proupalni i IFN tipa 1 (Slika 7.4, vidi i umetak u boji). Uglavnom ovi citokini (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, kemokini i dr.) potiču razvoj upale i sudjeluju u zaštiti organizma od bakterijskih i virusnih infekcija.

Riža. 7.3. Spektar citokina koje izlučuju Th1 i Th12 stanice

III. Stanice koje nisu dio imunološkog sustava (stanice vezivnog tkiva, epitela, endotela) konstitutivno luče autokrine faktore rasta (GGF, EGF, TGFr i dr.). i citokini koji podržavaju proliferaciju hematopoetskih stanica.

Citokini i njihovi antagonisti detaljno su opisani u brojnim monografijama (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Riža. 7.4. TLR-posredovana indukcija proizvodnje citokina od strane urođenih imunoloških stanica

Prekomjerna ekspresija citokina nije sigurna za tijelo i može dovesti do razvoja prekomjerne upalne reakcije, odgovora akutne faze. U regulaciju proizvodnje proupalnih citokina uključeni su različiti inhibitori. Tako je opisan niz tvari koje nespecifično vežu citokin IL-1 i sprječavaju ispoljavanje njegovog biološkog djelovanja (a2-makroglobulin, C3-komponenta komplementa, uromodulin). Specifični inhibitori IL-1 mogu biti topljivi mamac receptori, antitijela i antagonist IL-1 receptora (IL-1RA). S razvojem upale dolazi do povećanja ekspresije gena IL-1RA. Ali čak i normalno, ovaj antagonist je prisutan u krvi u visokoj koncentraciji (do 1 ng / ml ili više), blokirajući djelovanje endogenog IL-1.

ciljne stanice

Djelovanje citokina na ciljne stanice posredovano je preko specifičnih receptora koji vežu citokine s vrlo visokim afinitetom, a pojedinačni citokini mogu koristiti

zajedničke podjedinice receptora. Svaki citokin veže se za svoj specifični receptor.

Citokinski receptori su transmembranski proteini i dijele se u 5 glavnih tipova. Najčešći je takozvani hematopoetski tip receptora, koji ima dvije izvanstanične domene, od kojih jedna sadrži zajedničku sekvencu aminokiselinskih ostataka od dva ponavljanja triptofana i serina odvojenih bilo kojom aminokiselinom (WSXWS motiv). Drugi tip receptora može imati dvije izvanstanične domene s velikim brojem očuvanih cisteina. To su receptori obitelji IL-10 i IFN. Treći tip predstavljaju citokinski receptori koji pripadaju skupini TNF. Četvrti tip citokinskih receptora pripada superobitelji imunoglobulinskih receptora, koji imaju izvanstanične domene slične strukture onima molekula imunoglobulina. Petu vrstu receptora koji vežu molekule iz obitelji kemokina predstavljaju transmembranski proteini koji prolaze staničnu membranu na 7 mjesta. Citokinski receptori mogu postojati u topljivom obliku, zadržavajući sposobnost vezanja liganda (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Citokini mogu utjecati na proliferaciju, diferencijaciju, funkcionalnu aktivnost i apoptozu ciljnih stanica (vidi sliku 7.1). Manifestacija biološke aktivnosti citokina u ciljnim stanicama ovisi o sudjelovanju različitih unutarstaničnih sustava u prijenosu signala s receptora, što je povezano s karakteristikama ciljnih stanica. Signal za apoptozu provodi se, između ostalog, uz pomoć specifične regije obitelji TNF receptora, takozvane domene “smrti” (slika 7.5, vidi umetak u boji). Signali diferencijacije i aktivacije prenose se kroz unutarstanične Jak-STAT proteine ​​- pretvarače signala i aktivatore transkripcije (slika 7.6, vidi umetak u boji). G-proteini sudjeluju u prijenosu signala iz kemokina, što dovodi do povećane migracije i adhezije stanica.

Kompleksna analiza citokinskog sustava uključuje sljedeće.

I. Procjena stanica proizvođača.

1. Definicija izraza:

Receptori koji prepoznaju patogen ili TCR antigen, TLR) na razini gena i proteinskih molekula (PCR, metoda protočne citometrije);

Adapterske molekule koje provode signal koji pokreće transkripciju gena citokina (PCR, itd.);

Riža. 7.5. Transdukcija signala s TNF receptora

Riža. 7.6. Jak-STAT - signalni put receptora citokina tipa 1

Citokinski geni (PCR); proteinske molekule citokina (procjena citokinosintetičke funkcije ljudskih mononuklearnih stanica).

2. Kvantitativno određivanje staničnih subpopulacija koje sadrže određene citokine: Th1, Th2 Th17 (metoda intracelularnog bojenja citokina); određivanje broja stanica koje luče određene citokine (ELISPOT metoda, vidi Poglavlje 4).

II. Procjena citokina i njihovih antagonista u biološkim medijima tijela.

1. Ispitivanje biološke aktivnosti citokina.

2. Kvantitativno određivanje citokina pomoću ELISA.

3. Imunohistokemijsko bojenje citokina u tkivima.

4. Određivanje omjera suprotnih citokina (pro- i protuupalnih), citokina i antagonista citokinskih receptora.

III. Evaluacija ciljne stanice.

1. Određivanje ekspresije citokinskih receptora na razini gena i proteinskih molekula (PCR, metoda protočne citometrije).

2. Određivanje signalnih molekula u unutarstaničnom sadržaju.

3. Određivanje funkcionalne aktivnosti ciljnih stanica.

Razvijene su brojne metode za procjenu citokinskog sustava kako bi se dobile različite informacije. Među njima se razlikuju:

1) molekularno biološke metode;

2) metode kvantitativnog određivanja citokina primjenom imunotestova;

3) ispitivanje biološke aktivnosti citokina;

4) intracelularno bojenje citokina;

5) ELISPOT metoda, koja omogućuje otkrivanje citokina oko jedne stanice koja proizvodi citokine;

6) imunofluorescencija.

Predstavljamo Kratak opis ove metode.

Pomoću molekularno biološke metode moguće je proučavati ekspresiju gena citokina, njihovih receptora, signalnih molekula, proučavati polimorfizam tih gena. Posljednjih godina proveden je veliki broj studija koje su otkrile povezanost između varijanti alela molekula gena citokinskog sustava i predispozicije

na brojne bolesti. Proučavanje alelnih varijanti gena citokina može pružiti informacije o genetski programiranoj proizvodnji određenog citokina. Najosjetljivija je lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu - PCR-RT (vidi pogl. 6). metoda hibridizacije in situ omogućuje vam razjašnjavanje tkivne i stanične lokalizacije ekspresije gena citokina.

Kvantitativno određivanje citokina u biološkim tekućinama iu kulturama mononuklearnih stanica periferne krvi pomoću ELISA može se opisati na sljedeći način. Budući da su citokini lokalni medijatori, prikladnije je mjeriti njihove razine u odgovarajućim tkivima nakon ekstrakcije tkivnih proteina ili u prirodnim tekućinama kao što su suze, oralna lavaža, urin, amnionska tekućina, cerebrospinalna tekućina itd. Razine citokina u serumu ili drugim tjelesnim tekućinama odražavaju trenutno stanje imunološkog sustava, tj. sinteza citokina u tjelesnim stanicama in vivo.

Određivanje razine proizvodnje citokina u mononuklearnim stanicama periferne krvi (PBMC) pokazuje funkcionalno stanje stanica. Spontana proizvodnja MNC citokina u kulturi ukazuje da su stanice već aktivirane. in vivo. Inducirana sinteza citokina (različitim stimulansima, mitogenima) odražava potencijalnu, rezervnu sposobnost stanica da odgovore na antigenski podražaj (osobito na djelovanje lijekovi). Smanjena inducirana proizvodnja citokina može poslužiti kao jedan od znakova stanja imunodeficijencije. Citokini nisu specifični za određeni antigen. Stoga je specifična dijagnoza zaraznih, autoimunih i alergijske bolesti pomoću određivanja razine određenih citokina nemoguće je. Istodobno, procjena razine citokina omogućuje dobivanje podataka o težini upalnog procesa, njegovom prijelazu na sustavnu razinu i prognozi, funkcionalnoj aktivnosti stanica imunološkog sustava, omjeru Th1 i Th2 stanica, što je vrlo važno u diferencijalnoj dijagnozi niza infektivnih i imunopatoloških procesa.

U biološkim medijima, citokini se mogu kvantificirati pomoću niza metode imunotestiranja, pomoću poliklonskih i monoklonskih protutijela (vidi poglavlje 4). ELISA vam omogućuje da saznate koje su točne koncentracije citokina u bio-

logične tjelesne tekućine. ELISA detekcija citokina ima niz prednosti u odnosu na druge metode (visoka osjetljivost, specifičnost, neovisnost o prisutnosti antagonista, mogućnost točnog automatiziranog obračuna, standardizacija računovodstva). Međutim, ova metoda također ima svoja ograničenja: ELISA ne karakterizira biološku aktivnost citokina i može dati lažne rezultate zbog unakrsnog reagiranja epitopa.

biološka ispitivanja provodi se na temelju poznavanja osnovnih svojstava citokina, njihova djelovanja na ciljne stanice. Proučavanje bioloških učinaka citokina dovelo je do razvoja četiri vrste testiranja citokina:

1) indukcijom proliferacije ciljnih stanica;

2) citotoksičnim učinkom;

3) indukcijom diferencijacije progenitora koštane srži;

4) antivirusnim djelovanjem.

IL-1 određen je stimulirajućim učinkom na proliferaciju mišjih timocita aktiviranih mitogenom in vitro; IL-2 - prema sposobnosti stimulacije proliferativne aktivnosti limfoblasta; za citotoksične učinke na mišje fibroblaste (L929), testirani su TNFa i limfotoksini. Čimbenici stimulacije kolonija procjenjuju se prema njihovoj sposobnosti da podrže rast progenitora koštane srži kao kolonija na agaru. Antivirusno djelovanje IFN-a detektira se inhibicijom citopatskog djelovanja virusa u kulturi diploidnih humanih fibroblasta i tumorske linije mišjih fibroblasta L-929.

Stvorene su stanične linije čiji rast ovisi o prisutnosti određenih citokina. U tablici. 7.1 je popis staničnih linija korištenih za testiranje citokina. Prema sposobnosti indukcije proliferacije osjetljivih ciljnih stanica provodi se biotestiranje IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 itd. Međutim, ove metode ispitivanja nisu jako osjetljivi i informativni. Molekule inhibitora i antagonista mogu prikriti biološku aktivnost citokina. Neki citokini pokazuju opću biološku aktivnost. Ipak, ove su metode idealne za ispitivanje specifične aktivnosti rekombinantnih citokina.

Tablica 7.1. Stanične linije koje se koriste za testiranje biološke aktivnosti citokina

Kraj stola. 7.1

Laboratorij 7-1

Određivanje biološke aktivnosti IL-1 njegovim komitogenim učinkom na proliferaciju mišjih timocita

Metoda biološkog testiranja IL-1 temelji se na sposobnosti citokina da stimulira proliferaciju mišjih timocita.

IL-1 se može odrediti u kulturi monocita stimuliranoj LPS-om, kao iu bilo kojoj tjelesnoj tekućini. Potrebno je obratiti pozornost na niz detalja.

1. Za testiranje se koriste timociti C3H/HeJ miševa stimulirani na proliferaciju mitogenima (konkanavalinom A - ConA i fitohemaglutininom - PHA). C3H/HeJ timociti nisu odabrani slučajno: miševi ove inbred linije ne reagiraju na LPS, koji može biti prisutan u ispitivanom materijalu i uzrokovati proizvodnju IL-1.

2. Timociti reagiraju na IL-2 i mitogene, stoga u preparatima testiranim na IL-1 treba utvrditi i prisutnost IL-2 i mitogena.

Radni postupak

1. Dobiti suspenziju timocita u koncentraciji od 12×10 6 /ml medija RPMI 1640 koja sadrži 10% seruma fetalnih krava i 2-merkaptoetanol (5×10 -5 M).

2. Priprema se niz uzastopnih dvostrukih razrjeđenja eksperimentalnih (tjelesnih tekućina) i kontrolnih uzoraka. Kao kontrole koriste se biološke tekućine koje sadrže IL-1 ili uzorci dobiveni inkubacijom mononuklearnih stanica bez LPS-a i laboratorijski standardni pripravak koji sadrži IL-1. U pločama s okruglim dnom s 96 jažica, 50 µl svakog razrjeđenja preneseno je u 6 jažica.

3. Dodajte 50 µl pročišćenog PHA (Wellcome) otopljenog u potpunom mediju u koncentraciji od 3 µg/ml u tri jažice svakog razrjeđenja i 50 µl medija u druge 3 jažice.

4. Dodajte 50 µl suspenzije timocita u svaku jažicu i inkubirajte 48 sati na 37°C.

6. Prije završetka uzgoja, u jažice se doda 50 μl otopine (1 μCi / ml) [" 3 H]-timidina i inkubira još 20 sati.

7. Kako bi se odredila razina radioaktivnosti, kulture stanica se prenesu na filtar papir pomoću automatskog sakupljača stanica, filtri se osuše i uključivanje oznake se utvrdi tekućim scintilacijskim brojačem.

8. Rezultati se izražavaju kao koeficijent stimulacije.

gdje je m cp prosječan broj impulsa u 3 rupe.

Ako timociti odgovaraju na stimulaciju standardnim IL-1, tada indeks stimulacije testnog uzorka, veći od 3, pouzdano ukazuje na aktivnost IL-1.

Biotest je jedina metoda za procjenu funkcije citokina, ali ovu metodu treba dopuniti različiti tipovi odgovarajuću kontrolu specifičnosti pomoću monoklonskih protutijela. Dodatak određenih monoklonskih protutijela na citokin u kulturi blokira biološku aktivnost citokina, što dokazuje da je signal za proliferaciju stanične linije determinirani citokin.

Korištenje biološke analize za otkrivanje interferona. Načelo procjene biološke aktivnosti IFN-a temelji se na njegovom antivirusnom učinku, koji je određen stupnjem inhibicije reprodukcije testnog virusa u kulturi stanica.

U radu se mogu koristiti stanice osjetljive na djelovanje IFN-a: inicijalno tripsinizirane stanice kokošjih i ljudskih embrionalnih fibroblasta, transplantirane stanice diploidnih humanih fibroblasta i kultura mišjih stanica (L929).

Za procjenu antivirusnog učinka IFN-a preporučljivo je koristiti viruse s kratkim ciklusom reprodukcije, visoke osjetljivosti na djelovanje IFN-a: virus mišjeg encefalomijelitisa, mišji vezikularni stomatitis i dr.

Laboratorij 7-2

Određivanje aktivnosti interferona

1. Suspenzija diploidnih humanih fetalnih fibroblasta na mediju s 10% seruma goveđih embrija (koncentracija stanica - 15-20×10 6 /ml) se izlije u sterilne ploče ravnog dna s 96 jažica, 100 μl po jažici i stavi u CO 2 -inkubatoru na temperaturi od 37 °C.

2. Nakon formiranja potpunog monosloja, medij za rast se uklanja iz jažica i dodaje se 100 µl medija za održavanje u svaku jažicu.

3. Titracija aktivnosti IFN-a u ispitivanim uzorcima provodi se metodom dvostrukih razrjeđenja na monosloju fibroblasta.

Istovremeno s uzorcima u jažice se unosi virus mišjeg encefalomijelitisa (MEM) u dozi koja uzrokuje 100% oštećenje stanica 48 sati nakon infekcije.

4. Jažice s intaktnim (netretiranim) stanicama zaraženim virusom koriste se kao kontrole.

Kao referentni pripravci u svakoj studiji koriste se referentni uzorci IFN-a s poznatom aktivnošću.

5. Ploče za razrjeđivanje uzorka se inkubiraju 24 sata na 37°C u atmosferi od 5% CO 2 .

6. Razina aktivnosti IFN-a određena je recipročnom vrijednošću maksimalnog razrjeđenja ispitnog uzorka, koja odgađa citopatski učinak virusa za 50%, a izražava se u jedinicama aktivnosti po 1 ml.

7. Za određivanje vrste IFN-a u sustav se dodaje antiserum protiv IFNα, IFNβ ili IFNγ. Antiserum poništava djelovanje odgovarajućeg citokina, što omogućuje prepoznavanje vrste IFN-a.

Određivanje biološke aktivnosti migracije inhibitornog faktora. Trenutno su formirane potpuno nove ideje o prirodi i svojstvima MYTH-a, otkrivenog 60-ih godina prošlog stoljeća kao posrednika stanične imunosti i dugi niz godina ostavljenog bez dužne pažnje (Bloom B.R., Bennet B., 1966.; David J.R. , 1966). Tek u posljednjih 10-15 godina postalo je jasno da je MYTH jedan od najvažnijih bioloških medijatora u tijelu sa širokim spektrom bioloških funkcija citokina, hormona i enzima. Djelovanje MIF-a na ciljne stanice ostvaruje se putem CD74 - receptora ili neklasičnim putem endocitoze.

MIT se vidi kao važan posrednik upala, aktiviranje funkcije makrofaga (proizvodnja citokina, fagocitoza, citotoksičnost itd.), kao i endogeni imunoregulacijski hormon koji modulira aktivnost glukokortikoida.

Prikuplja se sve više informacija o ulozi MYTH-a u patogenezi mnogih upalnih bolesti, uključujući sepsu, reumatoidni artritis (RA), glomerulonefritis, itd. Kod RA, koncentracija MYTH-a u tekućini zahvaćenih zglobova značajno je povećana. , što je u korelaciji s težinom bolesti. Pod utjecajem MIF-a povećava se proizvodnja proupalnih citokina i od strane makrofaga i sinovijalnih stanica.

Postoje različite metode za ispitivanje aktivnosti MIF-a, kada se migrirajuće stanice (ciljne stanice za MIF) stave u staklenu kapilaru (kapilarni test), u kap agaroze ili u agaroznu jažicu.

Predstavljamo relativno jednostavnu metodu probira koja se temelji na stvaranju staničnih mikrokultura (leukocita ili makrofaga) standardne površine i broja stanica na dnu jažica ploče ravnog dna s 96 jažica, nakon čega slijedi njihov uzgoj u hranjivom mediju. i određivanje promjene u području ovih mikrokultura pod djelovanjem MIF (Suslov A.P., 1989).

Laboratorij 7-3

Definicija MYTH aktivnosti

Određivanje biološke aktivnosti MIF-a provodi se pomoću uređaja za formiranje staničnih mikrokultura (slika 7.7) - MIGROSCRIN (Istraživački institut za epidemiologiju i mikrobiologiju nazvan po N.F. Gamaleya Ruske akademije medicinskih znanosti).

1. U jažice ploče s 96 jažica (Flow, UK ili slično) dodajte 100 µl uzorka razrijeđenog u mediju kulture, u kojem se određuje aktivnost MIF (svako razrjeđenje u 4 paralele, eksperimentalni uzorci). Medij kulture uključuje RPMI 1640, 2 mM L-glutamina, 5% fetalnog goveđeg seruma, 40 μg/ml gentamicina.

2. U kontrolne jažice dodajte medij kulture (u 4 paralele) 100 µl.

3. Priprema se stanična suspenzija peritonealnih makrofaga, za što se 2 hibridna miša (CBAxC57B1 / 6) F1 intraperitonealno injicira s 10 ml Hankove otopine s heparinom (10 U / ml), trbuh se nježno masira 2-3 minute. . Zatim se životinja zakolje dekapitacijom, trbušna stijenka se pažljivo probije u predjelu prepona, a eksudat se štrcaljkom aspirira kroz iglu. Stanice peritonealnog eksudata dva puta se isperu Hankovom otopinom, centrifugiraju 10-15 minuta na 200 g. Zatim se priprema stanična suspenzija s koncentracijom od 10±1 milijuna/ml medija RPMI 1640. Brojenje se provodi u Goryaevljevoj komori.

4. Sastavljen je sustav MIGROSCRIN, koji je stalak za usmjerenu i standardnu ​​fiksaciju vrhova sa staničnim kulturama u strogo okomiti položaj na zadanoj visini iznad središta jažice ploče s kulturom s 96 jažica, a uključuje i 92 vrha za automatsku pipetu iz Costara, SAD (Sl. 7.7).

Umetnite noge stativa u kutne otvore ploče. Suspenzija stanica skuplja se automatskom pipetom u vrhove - po 5 μl, ispire se od viška stanica jednim uranjanjem u medij i umeće okomito u utičnice postolja sustava. Napunjeni stalak s vrhovima drži se na sobnoj temperaturi 1 sat na strogo vodoravnoj površini. Tijekom tog vremena stanice suspenzije talože se na dnu jažica, gdje se formiraju standardne stanične mikrokulture.

5. Pažljivo uklonite stalak za vrhove s ploče. Ploča s mikrokulturom stanica postavlja se u strogo vodoravan položaj u CO 2 inkubator, gdje se kultivira 20 sati.Tijekom kultivacije stanice migriraju po dnu jažice.

6. Kvantifikacija rezultata nakon inkubacije provodi se na binokularnoj lupi, uz vizualnu procjenu veličine kolonije na skali unutar okulara. Mikrokulture imaju oblik kruga. Istraživači zatim određuju prosječni promjer kolonije iz rezultata mjerenja kolonija u 4 ispitne ili kontrolne jažice. Pogreška mjerenja je ±1 mm.

Indeks migracije (MI) izračunava se po formuli:

Uzorak ima MYTH aktivnost ako su MI vrijednosti jednake

Za konvencionalnu jedinicu (U) aktivnosti MYTH uzima se inverzna vrijednost jednaka vrijednosti najvećeg razrjeđenja uzorka (uzorka), pri čemu je indeks migracije 0,6 ± 0,2.

Biološka aktivnost PEOα se procjenjuje njegovim citotoksičnim učinkom na liniju transformiranih fibroblasta L-929. Rekombinantni TNFa koristi se kao pozitivna kontrola, a stanice u mediju kulture koriste se kao negativna kontrola.

Citotoksični indeks (CI) izračunava se:

gdje a- broj živih stanica u kontroli; b- broj živih stanica u pokusu.

Riža. 7.7. Shema MIGROSCRIN - uređaji za kvantitativnu procjenu migracije staničnih kultura

Stanice se boje bojom (metilensko modrilo) koja se nalazi samo u mrtvim stanicama.

Za konvencionalnu jedinicu aktivnosti TNF-a uzima se vrijednost obrnutog razrjeđenja uzorka koja je neophodna za dobivanje 50% stanične citotoksičnosti. Specifična aktivnost uzorka je omjer aktivnosti u proizvoljnim jedinicama po 1 ml i koncentracije proteina sadržanog u uzorku.

Intracelularno bojenje citokina. Promjena u omjeru stanica koje proizvode različite citokine može odražavati patogenezu bolesti i služiti kao kriterij za prognozu bolesti i procjenu terapije.

Metodom intracelularnog bojenja utvrđuje se ekspresija citokina na razini jedne stanice. Protočna citometrija vam omogućuje da izbrojite broj stanica koje izražavaju određeni citokin.

Nabrojimo glavne korake u određivanju intracelularnih citokina.

Nestimulirane stanice proizvode male količine citokina, koji se u pravilu ne talože, stoga je važan korak u procjeni intracelularnih citokina stimulacija limfocita i blokada oslobađanja tih produkata iz stanica.

Kao induktor citokina najčešće se koristi aktivator protein kinaze C forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) u kombinaciji s kalcijevim ionoforom ionomicinom (IN). Korištenje takve kombinacije uzrokuje sintezu širok raspon citokini: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. Nedostatak primjene FMA-IN je problem detekcije CD4 molekula na površini limfocita nakon takve aktivacije. Također, stvaranje citokina od strane T-limfocita inducira se pomoću mitogena (PHA). B stanice i monociti stimuliraju

Mononuklearne stanice se inkubiraju u prisutnosti induktora proizvodnje citokina i blokatora njihovog unutarstaničnog transporta, brefeldina A ili monensina, 2-6 sati.

Stanice se zatim resuspendiraju u puferskoj otopini. Za fiksaciju dodati 2% formaldehida, inkubirati 10-15 min na sobnoj temperaturi.

Zatim se stanice tretiraju saponinom, što povećava propusnost stanična membrana, i obojen monoklonskim antitijelima specifičnim za citokine koji se određuju. Preliminarno bojenje površinskih markera (CD4, CD8) povećava količinu dobivenih informacija o stanici i omogućuje točnije određivanje njezine populacijske pripadnosti.

Postoje neka ograničenja u primjeni gore opisanih metoda. Stoga je pomoću njih nemoguće analizirati sintezu citokina u jednoj stanici, nemoguće je odrediti broj stanica koje proizvode citokine u subpopulaciji, nemoguće je utvrditi izražavaju li stanice koje proizvode citokine jedinstvene markere, jesu li različiti citokine sintetiziraju različite stanice ili iste. Odgovor na ova pitanja dobiva se drugim istraživačkim metodama. Kako bi se odredila učestalost stanica koje proizvode citokine u populaciji, koristi se metoda ograničavajućeg razrjeđenja i ELISPOT varijanta imunoenzimskog testa (vidi Poglavlje 4).

Metoda in situ hibridizacije. Metoda uključuje:

2) fiksacija paraformaldehidom;

3) detekcija mRNA pomoću obilježene cDNA. U nekim slučajevima, citokin mRNA se određuje na rezovima pomoću radioizotopne PCR.

Imunofluorescencija. Metoda uključuje:

1) zamrzavanje organa i priprema kriostatskih presjeka;

2) fiksacija;

3) tretiranje presjeka fluoresceinom obilježenim anticitokin antitijelima;

4) vizualno promatranje fluorescencije.

Ove tehnike (hibridizacija in situ i imunofluorescencija) su brzi i ne ovise o graničnim koncentracijama izlučenog produkta. Međutim, oni ne određuju količinu izlučenog citokina i mogu biti tehnički složeni. Neophodno je pažljivo praćenje nespecifičnih reakcija.

Prikazanim metodama procjene citokina identificirani su patološki procesi povezani s poremećajima u citokinskom sustavu na različitim razinama.

Stoga je procjena citokinskog sustava izuzetno važna za karakterizaciju stanja imunološkog sustava organizma. Proučavanje različitih razina citokinskog sustava omogućuje dobivanje informacija o funkcionalnoj aktivnosti različitih vrsta imunokompetentnih stanica, težini upalnog procesa, njegovom prijelazu na sustavnu razinu i prognozi bolesti.

Pitanja i zadaci

1. Nabrojite opća svojstva citokina.

2. Dajte klasifikaciju citokina.

3. Nabrojite glavne komponente citokinskog sustava.

4. Nabrojite stanice koje proizvode citokine.

5. Opišite obitelji citokinskih receptora.

6. Koji su mehanizmi funkcioniranja citokinske mreže?

7. Recite nam nešto o proizvodnji citokina u urođenom imunološkom sustavu.

8. Koji su glavni pristupi kompleksnoj procjeni citokinskog sustava?

9. Koje su metode za ispitivanje citokina u tjelesnim tekućinama?

10. Koji su defekti u citokinskom sustavu kod različitih patologija?

11. Koje su glavne metode biološkog testiranja IL-1, IFN, MIF, TNFa u biološkim tekućinama?

12. Opišite postupak određivanja intracelularnog sadržaja citokina.

13. Opišite postupak određivanja citokina koje luči pojedinačna stanica.

14. Opišite redoslijed metoda korištenih za otkrivanje defekta na razini citokinskog receptora.

15. Opišite redoslijed metoda korištenih za otkrivanje defekta na razini stanica koje proizvode citokine.

16. Koje se informacije mogu dobiti proučavanjem proizvodnje citokina u kulturi mononuklearnih stanica, u krvnom serumu?