A.A. Almabekova, A.K. Kusainova, O.A. Almabekovas

Asfendiyarov Kazachstano nacionalinis medicinos universitetas, Chemijos katedra Almatos technologijos universitetas Chemijos, chemijos inžinerijos ir ekologijos katedra

NAUJŲ UGNIAI ATSPARIŲ KOMPOZITINIŲ MEDŽIAGŲ KŪRIMAS

Tęsti: Šio straipsnio autorių dėmesį patraukė poliimidai, kurių pagrindą sudaro arilaliciklinio fluoro turinčių poliheterociklų dianhidridai. Šie junginiai pasižymi unikaliomis savybėmis, tokiomis kaip didelis atsparumas šiluminiam ir ugniai, cheminis atsparumas, tirpumas, dėl kurių kartu su kitomis teigiamomis savybėmis jie yra būtini šiuolaikinėse technologijose. Tam buvo sukurtos kompozicinės medžiagos fluoro turinčių aril-aliciklinių poliimidų pagrindu, sukurtos optimalios sąlygos gauti arilaliciklinės struktūros epoksidinius junginius kaip kietiklius naudojant lignosulfonatą, susintetinto poliimido fizikinės-cheminės, elektrinės ir šiluminės savybės. buvo ištirtas.

Raktažodžiai: dianhidridai, diaminai, polikondensacija, epoksidiniai junginiai, poliimidas, termoplastiškumas, atsparumas ugniai, klampumas.

Kazachstano nacionalinis medicinos universitetas, pavadintas S.D. Asfendiyarova, Psichiatrijos ir narkologijos skyrius, Mokslinė klinikinė diagnostinė laboratorija

LABORATORINĖ CITOKINO DIAGNOSTIKA (APŽVALGA)

Šioje apžvalgoje daug dėmesio skiriama svarbiausiems ir šiuo metu aktualiems citokinų kiekio įvairiuose biologiniuose skysčiuose klausimams, vertinant imunokompetentingų ląstelių funkcinį aktyvumą ir imuninio atsako reguliavimą. Raktažodžiai Raktažodžiai: citokinai, imunochemija.

Citokinai.

Citokinai šiuo metu laikomi baltymų-peptidų molekulėmis, kurias gamina įvairios kūno ląstelės ir kurios atlieka tarpląstelinę ir tarpsisteminę sąveiką. Citokinai yra universalūs ląstelės gyvavimo ciklo reguliatoriai, jie kontroliuoja pastarųjų diferenciacijos, proliferacijos, funkcinio aktyvavimo ir apoptozės procesus. Citokinai, kuriuos gamina imuninės sistemos ląstelės, vadinami imunocitokinais; jie atstovauja imuninės sistemos tirpių peptidinių mediatorių klasei, būtinų jos vystymuisi, veikimui ir sąveikai su kitomis organizmo sistemomis (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Kaip reguliacinės molekulės, citokinai atlieka svarbų vaidmenį įgyvendinant įgimtas ir adaptacines imuniteto reakcijas, užtikrina jų tarpusavio ryšį, kontroliuoja kraujodarą, uždegimus, žaizdų gijimą, naujų formavimąsi. kraujagyslės(angiogenezė) ir daugelis kitų gyvybiškai svarbių procesų. Šiuo metu yra keletas skirtingų citokinų klasifikacijų, atsižvelgiant į jų struktūrą, funkcinį aktyvumą,

kilmė, citokinų receptorių tipas. Tradiciškai, atsižvelgiant į biologinį poveikį, įprasta išskirti šias citokinų grupes.

1) Interleukinai (IL-1 – IL-18) – sekreciją reguliuojantys imuninės sistemos baltymai, užtikrinantys tarpininko sąveiką

imuninė sistema ir jos ryšys su kitomis organizmo sistemomis;

2) Interferonai (IFNa, IFNr, IFNu) – antivirusiniai baltymai, turintys ryškią imunoreguliacinę ir priešnavikinis aktyvumas;

3) Naviko nekrozės faktoriai (TNFa, TNFor – limfotoksinas) – citokinai, turintys citotoksinį ir reguliuojantį poveikį;

4) Kolonijas stimuliuojantys faktoriai (CSF) – kraujodaros ląstelių augimo ir diferenciacijos stimuliatoriai (GM-CSF, G-CSF, M-CSF);

5) Chemokinai – chemoatraktantai leukocitams;

6) Augimo faktoriai – įvairių audinių priklausomybių ląstelių augimo, diferenciacijos ir funkcinio aktyvumo reguliatoriai (fibroblastų augimo faktorius, endotelio ląstelių augimo faktorius, epidermio augimo faktorius) ir transformuojantis augimo faktorius – TGFr. Citokinai skiriasi struktūra, biologiniu aktyvumu ir daugybe kitų savybių, tačiau jie turi bendrų šiai peptidų klasei būdingų savybių. Paprastai citokinai yra glikozilinti vidutinės molekulinės masės (mažiau nei 30 kD) polipeptidai. Citokinus aktyvuotos ląstelės gamina nedidelėmis koncentracijomis trumpą laiką, o jų sintezė visada prasideda nuo genų transkripcijos. Citokinai daro savo biologinį poveikį ląstelėms per receptorius, esančius tikslinių ląstelių paviršiuje. Citokinų prisijungimas prie atitinkamų receptorių sukelia ląstelių aktyvaciją, jų dauginimąsi, diferenciaciją arba mirtį.

Citokinai savo biologinį poveikį daugiausia atlieka lokaliai, veikdami tinklo principu. Jie gali veikti kartu ir sukelti kaskadinę reakciją, nuosekliai sukeldami kai kurių citokinų sintezę kitų. Tokia sudėtinga citokinų sąveika būtina uždegimui formuotis ir imuninių atsakų reguliavimui. Citokinų sinergetinės sąveikos pavyzdys yra IL-1, IL-6 ir TNF uždegiminių reakcijų stimuliavimas, taip pat IgE sintezė, bendrai veikiant IL-4, IL-5 ir IL-13. Antagoninė citokinų sąveika taip pat gali būti neigiamas reguliavimo mechanizmas, kontroliuojantis uždegiminės reakcijos vystymąsi ir priešuždegiminių bei priešuždegiminių citokinų sintezę (IL-6 gamybos slopinimas reaguojant į TNF koncentracijos padidėjimą). Tikslinių ląstelių funkcijų citokinų reguliavimas gali būti atliekamas autokrininiu, parakrininiu arba endokrininiu mechanizmu. Citokinų sistema apima gamintojo ląsteles; tirpūs citokinai ir jų antagonistai; tikslinės ląstelės ir jų receptoriai. Ląstelių gamintojai:

I. Pagrindinė imuninės sistemos ląstelių, gaminančių citokinus, grupė yra limfocitai.

ThO gamina platų citokinų spektrą labai mažomis koncentracijomis.

Th1 gamina IL-2, IFN-a, IL-3, TNF-a, kurie yra būtini ląstelinio imuniteto reakcijoms atsirasti (HRT, antivirusiniai,

priešnavikinis citotoksiškumas ir kt.) Th2 išskiriamų citokinų rinkinys (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-3) lemia humoralinio imuninio atsako vystymąsi. AT pastaraisiais metais aprašo Th3, gaminančio TGFr, subpopuliaciją, kuri slopina ir Th1, ir Th2 funkcijas.

T-citotoksiniai (CD8+), B-limfocitai, natūralūs žudikai yra silpni citokinų gamintojai.

II. Makrofagų-monocitų serijos ląstelės gamina citokinus, kurie inicijuoja imuninį atsaką ir dalyvauja uždegimo ir regeneracijos reakcijose.

III. Ląstelės, kurios nėra imuninės sistemos dalis: ląstelės jungiamasis audinys, epitelis, endotelis spontaniškai, be antigeninės stimuliacijos, išskiria citokinus, kurie palaiko kraujodaros ląstelių dauginimąsi, ir autokrininius augimo faktorius (FGF, EGF, TFRR ir kt.).

Imuninė būklė yra kompleksinis imuninės sistemos būklės rodiklis, tai kiekybinė ir kokybinė būklės charakteristika.

imuninės sistemos organų funkcinis aktyvumas ir kai kurie nespecifiniai antimikrobinės apsaugos mechanizmai. Citokinų nustatymo metodai. Vertinant funkcinį aktyvumą, didelę reikšmę turi citokinų kiekio nustatymas įvairiuose biologiniuose skysčiuose

imunokompetentingos ląstelės ir imuninio atsako reguliavimas. Kai kuriais atvejais ( septinis šokas, bakterinis meningitas), kai citokinai, ypač TNFa, veikia kaip pagrindinis patogenezės veiksnys, nustatant jo kiekį kraujyje arba cerebrospinalinis skystis tampa pagrindiniu imunologinės diagnostikos metodu.

Kartais citokinų lygis nustatomas diferencinės diagnostikos tikslais. Pavyzdžiui, sergant bakteriniu meningitu, TNFα aptinkamas smegenų skystyje, o sergant virusiniu meningitu, jame paprastai randamas tik IL-1. Tačiau citokinų buvimo kraujo serume ir kituose biologiniuose skysčiuose nustatymas gali duoti neigiamų rezultatų dėl šių peptidų ypatumų. Kadangi citokinai daugiausia yra trumpalaikiai reguliatoriai, jų pusinės eliminacijos laikas yra trumpas (iki 10 min.). Kai kurių citokinų kraujyje yra itin mažos koncentracijos, kaupiasi daugiausia uždegimo židinyje, be to, gali būti užmaskuotas biologinis citokinų aktyvumas, kai jie prisijungia prie kraujyje cirkuliuojančių inhibitorių molekulių.

Yra trys skirtingus požiūrius kiekybiniam citokinų nustatymui: imunocheminis (ELISA), biotestavimas ir molekuliniai biologiniai tyrimai. Biologiniai tyrimai yra labiausiai

jautrus metodas, tačiau specifiškumas prastesnis nei ELISA. Yra 4 biotestavimo tipai: pagal citotoksinį poveikį, pagal proliferacijos indukciją, pagal diferenciacijos indukciją ir pagal antivirusinis poveikis. Pagal gebėjimą sukelti tikslinių ląstelių dauginimąsi, biotestuojami šie citokinai: 1b-1, 1b-2, 1b-4, 1b-5, 1b-6, 1b-7. Pagal citotoksinį poveikį jautrioms tikslinėms ląstelėms ^929), Tn-a ir TNF-p tiriami. SHI-y yra išbandytas dėl gebėjimo sukelti IHA II molekulių ekspresiją tikslinėse ląstelėse. 8 yra išbandytas dėl gebėjimo sustiprinti neutrofilų chemotaksę. Biotestai labiau naudojami tyrimų tikslais arba ELISA rezultatams patvirtinti.

Citokinų nustatymas kraujo serume ir kitose biologinėse medžiagose, naudojant kietosios fazės ELISA metodą, tapo plačiau paplitęs. Tyrimas atliekamas pagal protokolą, pridedamą prie diagnostinių tyrimų sistemos. Dažniausiai naudojamas sumuštinių ELISA variantas, kurį sudaro: vieno tipo mAb konkrečiam citokinui yra imobilizuotas ant tyrimo plokštelių šulinėlių vidinio paviršiaus. Tiriamoji medžiaga ir atitinkami standartai bei kontrolinės medžiagos pridedamos prie tabletės šulinėlių. Po inkubacijos ir plovimo antrieji mAb pridedami prie šulinėlių prie kito šio citokino epitopo, konjuguoto su indikatoriniu fermentu (krienų peroksidaze). Po inkubacijos ir plovimo į ląsteles įvedamas substratas-vandenilio peroksidas su chromogenu. Fermentinės reakcijos metu kinta šulinėlių spalvos intensyvumas, kuris matuojamas automatiniu plokšteliniu fotometru.

ELISA, naudojant mAb prieš atskirus epitopus citokinų molekulėje, pasižymi dideliu jautrumu ir specifiškumu, be to, metodo privalumas – objektyvus automatizuotas rezultatų registravimas. Tačiau šis metodas taip pat nėra be trūkumų, nes citokinų molekulių buvimo nustatymas dar nėra jų biologinio aktyvumo rodiklis, klaidingai teigiamų rezultatų tikimybė dėl

Dėl kryžmiškai reaguojančių antigeninių epitopų ELISA metodas neleidžia nustatyti citokinų imuninių kompleksų sudėtyje.

ELISA nuo biotestavimo skiriasi mažesniu jautrumu, dideliu specifiškumu ir atkuriamumu. Citokinas aptinkamas pagal jo gebėjimą prisijungti prie dviejų skirtingų monokloninių antikūnų, nukreiptų prieš du skirtingus antigeninius epitopus citokino molekulėje. Pavyzdžiui, naudojamas streptavidino-fermento-fermento substrato kompleksas. Tačiau daugumos citokinų gebėjimas sudaryti kompleksus su serumo baltymais ir kt. gali gerokai iškreipti kiekybinio citokinų lygio nustatymo rezultatus. Molekuliniai biologiniai metodai leidžia nustatyti citokinų genų raišką tiriamoje medžiagoje, t.y. atitinkamos mRNR buvimas. Atvirkštinės transkriptazės polimerazė laikoma jautriausia grandininė reakcija(RT-PGR). Atvirkštinė transkriptazė (revertazė) naudojama kDNR kopijoms iš ląstelių, išskirtų mRNR, gaminti. KDNR kiekis atspindi pradinį mRNR kiekį ir netiesiogiai atspindi šio citokino gamybos aktyvumą. kraujo monocitai,

sukelia mitogenai: Con A, PGA, LPS. Duomenų interpretavimas laikui bėgant leidžia numatyti tolesnę eigą sergant organų specifinėmis autoimuninėmis ligomis, sergant išsėtine skleroze, vertinant taikomų naviko imunoterapijos metodų efektyvumą ir kt.

Biologinio poveikio bandymai paprastai nėra pakankamai jautrūs ir kartais nepakankamai informatyvūs. Inhibitorių arba antagonistų molekulių buvimas tame pačiame biologiniame skystyje gali užmaskuoti citokinų biologinį aktyvumą. Tuo pačiu metu skirtingi citokinai dažnai turi tą patį biologinį aktyvumą. Be to, biologiniams tyrimams atlikti reikalinga speciali papildoma įranga, jie atliekami nestandartinėmis sąlygomis ir pirmiausia naudojami mokslinių tyrimų tikslais. Išvada.

Taigi šiuo metu nėra jokių abejonių, kad citokinai yra svarbiausi imunopatogenezės veiksniai. Citokinų lygio tyrimas leidžia gauti informacijos apie įvairių tipų imunokompetentingų ląstelių funkcinį aktyvumą, I ir II tipų T pagalbininkų aktyvacijos procesų santykį, o tai labai svarbu diferencijuojant daugelio infekcinių ir infekcinių ligų diagnozę. imunopatologiniai procesai.

BIBLIOGRAFIJA

1 Gumilevskaya O.P., Gumilevsky B.Yu., Antonov Yu.V. Periferinio kraujo limfocitų gebėjimas pacientams, sergantiems šienlige, išskirti IL-4, INF polikloninės stimuliacijos metu in vitro // Citokinai ir uždegimas. Tarptautinė mokslinis ir praktinis mokyklos – konferencijos. - Sankt Peterburgas: 2002. - T. 1. - S. 94-98.

2 Bulina O.V., Kalinina N.M. Vaikų, sergančių atopiniu dermatitu, imuniteto citokinų ryšio parametrų analizė // Citokinai ir uždegimas. - 2002. - Nr. 2. - S. 92-97.

3 Sklyar L.F., Markelova E.V. Citokinų terapija rekombinantiniu interleukinu-2 (ronkoleukinu) pacientams, sergantiems virusinis hepatitas// Citokinai ir uždegimas. - 2002. - Nr. 4. - S. 43-66.

4 Marty C., Misset B, Tamion F ir kt. Cirkuliuojančios interleukino-8 koncentracijos pacientams, kuriems yra daugybinis septinės ir neseptinės kilmės organų nepakankamumas // Critical Care Medicine. - 1994. - V. 22. - P. 673-679.

5 Šaimova V.A., Simbircevas, A.Ju.Kotovas. Įvairių tipų uždegimą skatinantys citokinai pūlingos opos ragena // Citokinai ir uždegimas. Tarptautinės mokslinės – praktinės mokyklos medžiaga. - Sankt Peterburgas: 2002. - Nr. 2. - S. 52-58.

6 Teitelbaum S.L. Kaulų rezorbcija osteoklastais // Mokslas. - 2000. - V. 289. - P. 1504-1508.

7 Borisovas L.B. Medicininė mikrobiologija, virusologija, imunologija. - M.: 2002. - 736 p.

8 W. Paul Imunologija. - M.: Mir, 1987 m. - 274 p.

9 G. Frimel Imunologiniai metodai. - M.: Medicina, 1987. - 472 p.

10 A.V.Karaulovo klinikinė imunologija. - M.: Medicinos informacijos agentūra, 1999 - 604 p.

11 Lebedevas K.A., Ponyakina I.D. imunodeficitas. - M.: Medicinos knyga, 2003 - 240 p.

12 J. Klauso limfocitai. Metodai. - M.: Mir, 1990. - 214 p.

13 Menšikovas I.V., Berulova L.V. Imunologijos pagrindai. Laboratorinė praktika. - Iževskas: 2001. - 134 p.

14 Petrovas R.V. Imunologija. - M.: Medicina, 1987. - 329 p.

15 Royt A. Imunologijos pagrindai. - M.: Mir, 1991. - 327 p.

16 Totolyan A.A., Freidlin I.S.// Imuninės sistemos ląstelės. 1,2 t. - Sankt Peterburgas, Mokslas, - 2000 - 321s.

17 Stephanie D.V., Veltishchev Yu.E. Klinikinė imunologija vaikystė. - M.: Medicina, 1996. - 383 p.

18 Freidlin I.S., Totolyan A.A. Imuninės sistemos ląstelės. - Sankt Peterburgas: Nauka, 2001. - 391 p.

19 Khaitovas R.M., Ignatieva G.A., Sidorova I.G. Imunologija. - M.: Medicina, 2000. - 430 p.

20 Khaitov R.M., Pinegin B.V., Istamov Kh.I. Ekologinė imunologija. - M.: VNIRO, 1995. - 219 p.

21 Belyaeva O. V., Kevorkov N. N. Kompleksinės terapijos įtaka vietinio imuniteto rodikliams pacientams, sergantiems periodontitu // Citokinai ir uždegimas. - 2002. - T. 1. - Nr. 4. - S. 34-37.

22 Y.T. Chang citokino geno polimorfizmai psoriaze sergantiems Kinijos pacientams // British Journal of Dermatology. - 2007. -T. 156. - P. 899-905.

23 W. Baran IL-6 ir IL-10 promotoriaus genų polimorfizmai sergant psoriaze vulgaris // Acta Derm Venereol. - 2008. - T. 88.-P. 113-116.

24 L. Borska Imunologiniai TNF-alfa, sE-selektino, sP-selektino, sICAM-1 ir IL-8 pokyčiai vaikams, gydytiems nuo psoriazės Goeckerman režimu // Vaikų dermatologija. - 2007. - T. 24. - Nr. 6. - P. 607-612.

25 M. O "Kane Padidėjusi našlaičių branduolinio receptoriaus NURR1 ekspresija sergant psoriaze ir moduliacija po TNF-a slopinimo // Journal of Investigative Dermatology. - 2008. - T. 128. - P. 300-310.

26 G. Fiorino Apžvalgos straipsnis: anti TNF-a sukelta psoriazė pacientams, sergantiems uždegimine žarnyno liga // Aliment Pharmacol Ther. - 2009. - T. 29. - P. 921-927.

27 val. Tobin, B. Kirby TNFa inhibitoriai gydant psoriazę ir psoriazinį artritą // Biodrugs. - 2005. - T. 19. - Nr. 1. - P. 47-57.

28 A.B. Servino naviko nekrozės faktoriaus alfa (TNF-a) konvertuojantis fermentas ir 1 tipo tirpūs TNF-a receptoriai sergantiesiems psoriaze, susiję su lėtiniu alkoholio vartojimu // Journal European Academy of Dermatology and Venereology. -2008 m. – t. 22. - P. 712-717.

29 O. Arican TNF-a, IFN-y, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17 ir IL-18 koncentracija serume pacientams, sergantiems aktyvia psoriaze ir koreliacija su ligos sunkumu // Uždegimo mediatoriai . - 2005. - T. 5. - P. 273-279.

30 A. Mastroianni Citokinų profiliai psoriazinio artrito monoterapijos metu infliksimabu // British Journal of Dermatology. -2005 m. – t. 153. - P. 531-536.

A.Sh. Oradova, K.Z. Saduakasova, S.D. Lesova

S.Zh. Asfendiyarov atyndagy K, azats ¥lttyts medicinos universiteto Narkologijos zhene psichiatrijos skyriai, gylym klinikos-diagnostikos zertkhana

CYTOKINNYN, ZERTKHANALSHCH DIAGNOSTIKA

Tushn: Sholuy bul ulken nazar man, yzdy belshgen jene sura; kekeikesp K; a3ipri ya; ytta er TYrli biologija; suyshtyk; tarda imuno kuzyrly zhasushalardy funkcinis; belsendshkt bagalauda cytokinderdsch mazmuniya zhene immunodi zhauaptyn, retteuk

TYYindi sezder: citokinas, imunitetas; tysty chemija.

A.Sh. Oradova, K.Z. Saduakasova, S.D. Lesova

Asfendiyarov Kazachstano nacionalinis medicinos universitetas, Psichiatrijos ir narkologijos katedra, Mokslinė klinikinė ir diagnostinė laboratorija

CITOKINO LABORATORINĖ DIAGNOSTIKA

CV: Šioje apžvalgoje didelis dėmesys buvo skiriamas kritinėms ir šiuo metu kylančioms problemoms, susijusioms su citokinų kiekiu įvairiuose biologiniuose skysčiuose, vertinant imuninių ląstelių funkcinį aktyvumą ir imuninio atsako reguliavimą. Raktažodžiai: citokinai, imunochemija.

UDC 616.831-005.1-056:616.12-008.331.1

A.Sh. Oradova, A.D. Sapargalijeva, B.K. Dusembajevas

Kazachstano nacionalinis medicinos universitetas, pavadintas S.D. Asfendiyarov, skyrius patologinė anatomija

MOLEKULINIAI ŽYMENYS, SKIRTI IŠEMINIAM INsultui SKIRTI (APŽVALGA)

Pastaruoju metu nemažai tyrimų buvo skirta paveldimų veiksnių, skatinančių vystymąsi, paieškai. kraujagyslių ligos smegenys. Viena iš pagrindinių šių tyrimų krypčių yra kandidatų genų vaidmens tyrimas. Šioje apžvalgoje susisteminame naujausių molekulinių genetinių tyrimų rezultatus apie ryšį tarp įvairių klasių „genų kandidatų“ ir išeminio insulto rizikos žmonėms. Raktažodžiai: išeminis insultas, kandidatiniai genai.

Šiuo metu išeminio insulto išsivystymui turi įtakos tokie rizikos veiksniai, kaip pvz arterinė hipertenzija, aterosklerozė, širdies aritmijos, infarktas, rūkymas, cukrinis diabetas, lipidų apykaitos sutrikimai, hemostazės sistemos pokyčiai, geriamųjų kontraceptikų vartojimas, piktnaudžiavimas

alkoholis ir kt. Yra žinoma, kad išeminio insulto sunkumas didėja dėl kelių rizikos veiksnių derinio, tarp kurių yra arterinė hipertenzija, hipercholesterolemija, padidėjęs mažo tankio lipoproteinų kiekis ir rūkymas. Įvadas į racionalaus klinikinę praktiką

Citokinai pagal savo prigimtį yra baltymai, kuriuos gamina imuninės sistemos ląstelės (literatūroje dažnai vadinami „faktoriais“). Jie dalyvauja naujagimių imuninės sistemos ląstelių diferenciacijoje, suteikdami joms tam tikras savybes, kurios yra įvairovės šaltinis. imuninės ląstelės taip pat užtikrina tarpląstelinę sąveiką. Kad šį procesą būtų lengviau suprasti, galime palyginti imuninių ląstelių gamybą su gamykla. Pirmajame etape iš konvejerio palieka identiški ląstelių ruošiniai, tada antrajame etape, naudojant įvairias citokinų grupes, kiekviena ląstelė yra aprūpinta specialiomis funkcijomis ir surūšiuojama į grupes, kad vėliau galėtų dalyvauti imuniniuose procesuose. Taip iš identiškų ląstelių gaunami T limfocitai, B limfocitai, neutrofilai, bazofilai, eozinofilai, monocitai.

Mokslą domina citokino poveikio ląstelei ypatumai, dėl kurių ši ląstelė gamina kitus citokinus. Tai yra, vienas citokinas sukelia kitų gamybą citokinų.

Citokinai, priklausomai nuo poveikio imuninėms ląstelėms, skirstomi į šešias grupes:

• Interferonai
• Interleukinai
• kolonijas stimuliuojantys veiksniai
• augimo faktoriai
• Chemokinai
• Naviko nekrozės veiksniai

Interferonai yra citokinai, kuriuos gamina ląstelės, reaguodamos į virusinę infekciją ar kitus stimulus. Šie baltymai (citokinai) blokuoja viruso dauginimąsi kitose ląstelėse ir dalyvauja imuninėje tarpląstelinėje sąveikoje.

Pirmasis tipas (turi antivirusinį ir priešnavikinį poveikį):

interferonas-alfa

interferonas-beta

Interferonas-gama

Interferonai alfa ir beta veikia panašiai, tačiau juos gamina skirtingos ląstelės.

Interferoną-alfa gamina mononukleariniai fagocitai. Iš to išplaukia jo pavadinimas - " leukocitų interferonas».

Beta interferoną gamina fibroblastai. Iš čia ir pavadinimas - fibroblastų interferonas».

Pirmojo tipo interferonai turi savo užduotis:

• Padidinti interleukinų (IL1) gamybą
• Sumažinkite pH lygį tarpląstelinėje aplinkoje, kylant temperatūrai
• Prisijungia prie sveikų ląstelių ir apsaugo jas nuo virusų
• Gali slopinti ląstelių dauginimąsi (augimą), blokuodamas aminorūgščių sintezę
• Kartu su natūraliomis žudančiomis ląstelėmis jos skatina arba slopina (priklausomai nuo situacijos) antigenų susidarymą

Gama interferoną gamina T limfocitai ir natūralios žudikų ląstelės. Turi vardą - imuninis interferonas»

Antrojo tipo interferonas taip pat turi užduotis:

• Suaktyvina T-limfocitus, B-limfocitus, makrofagus, neutrofilus,
• Slopina timocitų dauginimąsi,
• Stiprina ląstelinį imunitetą ir autoimunitetą,
• Reguliuoja normalių ir užkrėstų ląstelių apoptozę.

Interleukinai(sutrumpintai kaip IL) yra citokinai, reguliuojantys leukocitų sąveiką. Mokslas nustatė 27 interleukinus.

kolonijas stimuliuojantys veiksniai yra citokinai, reguliuojantys kaulų čiulpų kamieninių ląstelių ir kraujo ląstelių pirmtakų dalijimąsi ir diferenciaciją. Šie citokinai yra atsakingi už limfocitų gebėjimą klonuotis, taip pat gali stimuliuoti ląstelių, esančių už kaulų čiulpų ribų, funkcionalumą.

Augimo faktoriai – reguliuoja įvairių audinių ląstelių augimą, diferenciaciją ir funkcionalumą

Iki šiol buvo nustatyti šie augimo veiksniai:

• transformuojantys augimo faktorius alfa ir beta
• epidermio augimo faktorius
• fibroblastų augimo faktorius
• trombocitų augimo faktorius
• nervų augimo faktorius
• į insuliną panašus augimo faktorius
• hepariną surišantis augimo faktorius
• endotelio ląstelių augimo faktorius

Labiausiai ištirtos yra augimo faktoriaus beta transformavimo funkcijos. Jis yra atsakingas už T-limfocitų augimo ir aktyvumo slopinimą, slopina kai kurias makrofagų, neutrofilų, B limfocitų funkcijas. Nors šis veiksnys yra susijęs su augimo faktoriais, iš tikrųjų jis dalyvauja atvirkštiniuose procesuose, tai yra, slopina imuninį atsaką (slopina ląstelių, dalyvaujančių imuninė apsauga), kai infekcija pašalinama ir imuninių ląstelių darbas nebereikalingas. Būtent šio veiksnio įtakoje žaizdų gijimo metu sustiprėja kolageno sintezė ir IgA imunoglobulino gamyba, generuojamos atminties ląstelės.

Chemokinai yra mažos molekulinės masės citokinai. Pagrindinė jų funkcija – pritraukti leukocitus iš kraujotakos į uždegimo židinį, taip pat reguliuoti leukocitų judrumą.

Naviko nekrozės veiksniai(sutrumpintai kaip TNF) yra dviejų tipų citokinai (TNF-alfa ir TNF-beta). Jų veikimo rezultatai: kacheksijos išsivystymas (dėl to labai išsekus organizmui sulėtėja fermento, prisidedančio prie riebalų kaupimosi organizme, veikla); toksinio šoko vystymasis; imuninės sistemos ląstelių apoptozės (ląstelių mirties) slopinimas, naviko ir kitų ląstelių apoptozės indukcija; trombocitų aktyvinimas ir žaizdų gijimas; angiogenezės (kraujagyslių proliferacijos) ir fibrogenezės (audinio degeneracijos į jungiamąjį audinį) slopinimas, granulomatozė (granuliomų susidarymas – fagocitų proliferacija ir transformacija) ir daugelis kitų rezultatų.

„Citokinų sistema. Klasifikacija. Pagrindinis
savybių. Veikimo mechanizmai. Citokinų rūšys
reglamentas. Gamintojo ir tikslinės ląstelės.
Citokinų uždegimo ir imuninės sistemos reguliavimas
atsakymas“.
1 ciklas – Imunologija.
3 pamoka a.

Citokinai

Signalinės (bioreguliacinės) molekulės,
valdyti beveik visus procesus
organizmas – embriogenezė, hematopoezė,
brendimo ir diferenciacijos procesai
ląstelės, ląstelių aktyvacija ir mirtis, iniciacija ir
įvairių tipų imuninio atsako palaikymas,
uždegimo vystymasis, atstatymo procesai,
audinių remodeliavimas, darbo koordinavimas
imuninės – neuro – endokrininės sistemos lygiu
organizmas kaip visuma.

Citokinai

tirpūs glikoproteinai (daugiau nei 1300 molekulių, 550 kDa), neturintys imunoglobulino pobūdžio,
išskiria šeimininkų ląstelės
su žemu nefermentiniu aktyvumu
koncentracijos (nuo pikomolinės iki nanomolių),
veikiantis per specifinius receptorius
tikslinės ląstelės, reguliuojančios įvairias funkcijas
kūno ląstelės.
Šiuo metu žinoma apie 200 citokinų.

Citokinai ir gyvavimo ciklas
ląstelės
Citokinai – bioreguliaciniai
kontroliuojančios molekulės
skirtingi gyvenimo ciklo etapai
ląstelės:
diferenciacijos procesai.
platinimo procesai.
funkciniai procesai
aktyvinimas.
ląstelių mirties procesai.
Citokinai ir imuninis atsakas
Citokinai vaidina svarbų vaidmenį
vykdanti reakcijas kaip
taip pat įgimtas
adaptyvus imunitetas.
Citokinai suteikia
santykis tarp įgimto ir
adaptyvus imunitetas
atsakymai.

Citokinų savybės

Būdingas trumpas laikotarpis
pusė gyvenimo:
greitai pašalina citokinus
yra išjungti ir
yra sunaikinti.
Dauguma citokinų
veikia lokaliai
(parakrinas – ant ląstelių
mikroaplinka).
Citokinų yra daugiau nei
receptoriai (daug citokinų
naudoti bendrą
receptorių subvienetai).
tikslinės ląstelės
signalizuojantis branduoliui
tikslinės ląstelės
Pleiotropija yra vienintelė
molekulė gali sukelti
per daug efektų
Įvairių genų aktyvavimas
tikslinės ląstelės
Funkcijų konvergencija – įvairios
citokinų molekulės gali
atlikti kūne
panašias funkcijas
Polisferizmas – daug
citokinai gali
būti gaminamas to paties
ta pati ląstelė reaguodama į vieną
stimulas

Citokinų pleiotropija gama interferono pavyzdžiu

granulocitai
endotelis
aktyvinimas
aktyvinimas
Sekrecija
gama interferonas
makrofagai
aktyvinimas
NK
aktyvinimas
daug ląstelių tipų
skatinimas
antivirusinis
veikla
T ląstelių aktyvacija
daug ląstelių tipų
diferenciacija
Ląstelėse
išraiškos indukcija
MHC I arba MHCII

Citokinų reguliavimo tipai

Parakrininis reguliavimas (in
dauguma atvejų
citokinai veikia lokaliai,
uždegimo vietoje).
Autokrininis reguliavimas -
gaminamas citokinas
ląstelė, jam ląstelė yra jos gamintoja
citokinas išreiškia
receptorius, todėl
citokinas veikia ląstelę
jį gaminant.
Endokrininė reguliacija -
atidėtas veiksmas:
interleukinas 1 - beta -
endogeninis pirogenas
(paveikia centrą
termoreguliacija smegenyse
smegenys),
veikia interleukinas 6
hepatocitai, sukeliantys sintezę
ūminės fazės baltymai
augimo faktoriai
veikia kaulų čiulpus
aktyvuoti kraujodarą ir kt.

10. Citokinų sistemos supratimas klinikinėje praktikoje

Dėl klinikinė praktika svarbu
atsekti pagrindinę grandinę
sąveikos
imunopatogenezė
ligos:
1. Gamintojo ląstelės
citokinų.
2. Citokinai ir jų antagonistai.
3. Tikslinės ląstelės,
ekspresuojančius receptorius
citokinų.
4. Gaminamas citokinų
poveikis organizmo lygiu.
Tikslas: kūrimas ir įgyvendinimas
naujų strategijų praktika
ligos terapija:
citokinų terapija
(klinikiniam naudojimui)
citokinų preparatai)
arba
anticitokinų terapija
(klinikiniam naudojimui)
citokinų antagonistai arba
monokloniniai antikūnai prieš
citokinai).

11. Pagrindinės citokinų rūšys – dažnos santrumpos: interleukinai

Anksčiau
citokinų klasifikacijos
buvo naudojamas padalijimas
pagal ląstelių principą
Citokinų sintezė:
limfokinai (citokinai,
išskiriama daugiausia
aktyvuota T
pagalbiniai limfocitai)
ir
monokinai (citokinai,
išskiriamos ląstelės
monocitinių makrofagų serija)
Šis požiūris ne visada pateisinamas.
kaip ir citokinams
būdingas dalinis
funkcijų sutapimas.
Dėl to jis buvo pristatytas
vienas terminas "interleukinai"
IL (arba IL):
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,1
5,16,17 …..35
Terminas „interleukinai“ reiškia
dalyvaujančios molekulės
santykiai, pokalbiai
tarp leukocitų.

12. Pagrindiniai citokinų tipai – visuotinai priimtinos santrumpos:

naviko nekrozės veiksniai
(TNF arba TNF)
TNF (kachektinas)
TNF (limfotoksinas)
Interferonai (IFN arba IFN)
IFN ir IFN
IFN
transformuojantis augimas
faktoriai:
transformuojantis
augimo faktorius alfa
TGF-
transformuojantis
augimo faktorius - beta -
TGF-
-chemokinai:
IL-8
NAP-2 (aktyvuojantis neutrofilus
baltymai-2)
PF-4 (trombocitų faktorius 4)

13. Pagrindiniai citokinų tipai – visuotinai priimtinos santrumpos:

kolonijas stimuliuojantis
faktoriai:
G-CSF – granulocitų kolonija
stimuliuojantis veiksnys
GM – CSF – granulocitų makrofagų kolonijas stimuliuojantis
veiksnys
M - CSF - makrofagų kolonija
stimuliuojantis veiksnys
Multi-CSF-IL-3
Limfokinai išskiriami į
dažniausiai aktyvuota T h
ląstelės:
MAF – aktyvuojantis makrofagus
veiksnys
MCF – makrofagų chemotaktinis
veiksnys
MMIF-makrofagų migracija
slopinimo faktorius
LMIF – leukocitų migracija
slopinimo faktorius

14. Pagrindiniai citokinų tipai – visuotinai priimtinos santrumpos:

Polipeptidų augimas
ląstelių faktoriai:
FGF – rūgštinis fibroblastas
augimo faktorius
b FGF – bazinis fibroblastas
augimo faktorius
EGF – epidermio augimas
veiksnys
NGF – nervų augimo faktorius
PDGF-trombocitų kilmės
augimo faktorius
VEGF – kraujagyslių endotelis
augimo faktorius
Šiuolaikinės buitinės knygos ir
žurnalai

15. Citokinų klasifikavimas pagal jų biologinį poveikį

1. Interleukinai (IL-1 ÷
IL-35) – signalas
molekulės,
veikiantys tarp
leukocitų.
2. Nekrozės veiksniai
navikai – citokinai su
citotoksinis ir
reguliavimo
veiksmas (TNF).
3. Interferonai -
antivirusinis
citokinai:
1 tipas – IFN α, β ir kt.
2 tipai – IFN γ
4. Kamieninių ląstelių augimo faktoriai (IL-3, IL
-7, IL-11, eritropoetinas, trombopoetinas,
kolonijas stimuliuojantys faktoriai (CSF): GMCSF (granulocitai-makrofagai).
kolonijas stimuliuojantis faktorius), G-CSF
(granulocitinis CSF), M-CSF
(makrofagų CSF), reguliuojanti
kraujodaros.
5. Chemokinai (CC, CXC (IL-8), CX3C, C),
reguliuojanti įvairių ląstelių chemotaksę.
6. Ląstelių augimo faktoriai (augimo faktorius
fibroblastai, augimo faktorius
endotelio ląstelės, augimo faktorius
epidermis ir kt.), transformuojantis
augimo faktorius – dalyvauja reguliavime
augimas, skirtingų ląstelių diferenciacija.

16. Citokinų klasifikacija pagal jų vaidmenį reguliuojant uždegimą

Priešuždegiminis
Yra sintetinami
daugiausia
aktyvuotos ląstelės
monocitai/makrofagai
eilutę ir padidinkite
uždegiminis aktyvumas
procesas.
Priešuždegiminiai citokinai
daug daugiau nei
priešuždegiminis.
Priešuždegiminis
Dažniausiai T ląstelės
citokinų, kurie mažina
uždegiminis aktyvumas.
IL-10,
THF β (transformuojantis
augimo faktorius beta);
taip pat receptorius
interleukino-1 antagonistas
(GELEŽINKELIS).

17. Citokinai, turintys reguliacinį (priešuždegiminį) aktyvumą

citokinas
Efektas
IL-10
slopina gamybą
citokinus, slopina
1 tipo T pagalbininkų aktyvavimas
TRF – beta 1
(transformuojantis
augimo faktorius-beta 1)
slopina 1 ir 2 tipų pagalbininkų aktyvavimą,
skatina augimą
fibroblastai

18. 1. Įgimto imuniteto citokinai

Pagrindinės gaminančios ląstelės yra ląstelės
mieloidinis
kilmės.
Po aktyvavimo
atpažįstantys vaizdą
receptoriai
prasideda
tarpląstelinis
signalų kaskada,
vedantis
genų aktyvacija
priešuždegiminis
citokinai ir
1 tipo interferonas
(α ; β ir tt).

19. IMUNITETO RECEPTORIŲ ATPAŽINIMAS PATogenų

patogenų
Susijęs su patogenu
molekulinės struktūros ar modeliai
(PAMP)
Patterną atpažįstantys receptoriai (PRR):
1. Tirpus (komplemento sistema)
2. Membrana (TLR – į rinkliavą panašūs receptoriai, CD14)
3. Intraląstelinis (NOD ir kt.).

20.

Į rinkliavą panašūs receptorių signalizacijos keliai
Mokesčius primenančių receptorių dimeriai
Ląstelinis
membrana
TIR domenai
ManoD88
IRAK-1
TRIF
IRAK-4
TRAF6
TAK1
IKKa
JNK
TBK
1
IKKb
IRF3
AP-1
NFkB
IL-1 šeimos citokinų genų ekspresija,
priešuždegiminiai citokinai ir chemokinai
ANTIBAKTERINĖ APSAUGA
Interferono genų ekspresija
ANTIVIRUSINĖ APSAUGA

21. Prouždegiminių citokinų funkcinis aktyvumas priklausomai nuo jų koncentracijos – lokalus ir sisteminis veikimas

Vietos lygiu
Ankstyviausias poveikis
priešuždegiminiai citokinai
yra padidinti klijų kiekį
endotelio savybės ir patrauklumas
aktyvuotos ląstelės židinyje
uždegimas iš periferinių
kraujo.
Priešuždegiminiai citokinai
kontroliuoti vietinį uždegimą
tipiškos jo apraiškos
(patinimas, paraudimas, išvaizda
skausmo sindromas).
Sistemos lygiu
Didėjant koncentracijai
priešuždegiminis
citokinų kraujyje
jie dirba praktiškai
visi organai ir sistemos
dalyvaujant
palaikyti homeostazę
Priešuždegiminių citokinų poveikio priklausomybės nuo jų pavyzdys
koncentracija kraujyje gali būti naudojama kaip naviko nekrozės faktorius-alfa

22.

UŽDŽEDMĄ SUMAŽANČIŲ CIOKINO KIEKIS PLAZMOJE
10-7 mln
TNF
10-8 mln
10-9 mln
vietinis uždegimas
Sisteminis
uždegiminis
reakcija
Septinis šokas
fagocitozės aktyvinimas ir
deguonies produktai
radikalai. Pelnas
molekulių išraiška
sukibimas su endoteliu.
Sintezės stimuliavimas
citokinai ir chemokinai.
Metabolizmo padidėjimas
jungiamasis audinys.
Karščiavimas.
Didėjantys lygiai
steroidiniai hormonai.
Leukocitozė.
Sintezės padidėjimas
ūminė fazė
baltymai.
Sumažėjęs kontraktiliškumas
miokardo ir kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelės.
Pralaidumo padidėjimas
endotelis. Pažeidimas
mikrocirkuliacija. Krioklys
kraujo spaudimas.
Hipoglikemija.

23. Kai kurių citokinų vaidmuo uždegiminių reakcijų patogenezėje: įgimto imuninio atsako reakcijų stiprinimas

citokinas
Efektas
IL-6
Ūminės fazės atsakas (poveikis hepatocitams)
IL-8
Chemotaksės faktorius neutrofilams ir kitiems leukocitams
Nekrozės faktorius
navikai -
alfa (TNF-α)
Aktyvina neutrofilus, endotelio ląsteles, hepatocitus
(ūminės fazės baltymų gamyba), katabolinis
poveikis – sukelia kacheksiją
Interferonalfa (IFNα)
Aktyvina makrofagus, endotelio ląsteles, natūralias
žudikai

24. Interleukinas-1-beta: savybės

Ląstelė – taikinys
Efektas
makrofagai,
fibroblastai,
osteoblastai,
epitelis
proliferacija, aktyvacija
osteoklastų
Reabsorbcijos procesų kauluose stiprinimas
Hepatocitai
Ūminės uždegimo fazės baltymų sintezė
Ląstelės
pagumburio
Prostaglandinų sintezė ir vėlesnė
kūno temperatūros kilimas

25. Interleukin-1-beta: savybės

tikslinė ląstelė
Efektas
T-limfocitai
platinimas, diferenciacija,
citokinų sintezė ir sekrecija,
padidėjęs išraiškos lygis
IL-2 receptoriai
B-limfocitai
Platinimas, diferenciacija
Neutrofilai
Išlaisvinimas iš kaulų čiulpų
chemotaksė, aktyvacija
Endotelis
Adhezijos molekulių ekspresijos aktyvinimas

26. Biologinė citokinų veikimo prasmė esant sisteminiam uždegimui

Holistinio lygmens
organizmo citokinai
bendrauti tarp
imunitetas, nervingas,
endokrininės, kraujodaros ir
kitos sistemos
homeostazės reguliavimas ir
padeda juos įtraukti
vieningos organizacijos
gynybinė reakcija.
Citokinai suteikia
"budrus",
reiškia, kad laikas
laikas įjungti visus rezervus,
perjungti energiją
srautus ir atstatymo darbus
visas sistemas atlikti
vienas, bet pats svarbiausias
išlikimo užduotis – kova
su įvestu patogenu.
Daugelio priešuždegiminių citokinų poveikio pavyzdys
interleukinas 1 beta gali būti sisteminio uždegimo sukėlėjas

27.

INFα
IL-6
IL-12, IL-23
TNFα
IL-1β
IL-8
Citokinų sintezė
reglamentas
temperatūra,
elgesys,
hormonų sintezė
Limfocitų aktyvinimas
IL-1β
Molekulių raiška
sukibimas su endoteliocitais,
prokoaguliantinis aktyvumas,
citokinų sintezė
Baltymų gamyba
ūminė uždegimo fazė
PG
Aktyvinimas
kraujodaros
LT
NE
Fagocitozės aktyvinimas
iNOS ir medžiagų apykaitos aktyvinimas
arachidono rūgštis

28. IL-1 ir TNF-

IL-1 ir TNF-
Interleukinas-1 – beta (IL-1)
ir nekrozės faktorius
navikai-alfa (TNF-)
vaidina svarbų vaidmenį
uždegiminės reakcijos,
nuo įžangos
receptorių antagonistas
interleukinas 1 (IL-1 ra) ir
taip pat monokloninis
antikūnai arba tirpūs
TNF receptoriai
blokai aštrūs ir
lėtinis
uždegiminės reakcijos
eksperimentai ant
gyvūnai.
.
Kaikurie iš šitų
antagonistai ir
monokloninis
jau yra antikūnų
naudojamas
pavyzdžiui, klinikoje
gydant sepsį,
reumatoidinis
artritas, sisteminis
raudonoji vilkligė ir
kitos ligos
asmuo.

29. Augimo veiksniai

citokinas
GM-CSF
(granulocitinis-makrofagas
kolonijas stimuliuojantis faktorius)
M-CSF
(Makrofagai – kolonijas stimuliuojantys
veiksnys)
G-CSF
(Granulocitų kolonijas stimuliuojantis
veiksnys)
Efektas
skatinti augimą ir
diferenciacija
progenitorinės ląstelės
monocitai ir
polimorfonukleariniai leukocitai

30.

31.

ĮGYTO IMUNINO REGULIAVIMAS
Citokinai – augimas ir diferenciacija
visų tipų T ir B limfocitų faktoriai
Pagrindinės funkcijos: T pagalbininkų klonų diferenciacijos reguliavimas, audinių uždegimo tipų, efektorinių T ląstelių ir antikūnų klasių nustatymas
Th1 - ląstelės tipasįtraukiant makrofagus
ir T-limfocitai (granuloma

Su tuberkulioze; sergant sarkoidoze, kontaktiniu dermatitu, Krono liga)
Th2 – alerginio tipo atsakas, apimantis histaminą ir prostaglandinus
T h 17 – neutrofilinis uždegimas
Tfn (folikuliniai T pagalbininkai) – humoralinis imuninis atsakas
T reg – T h reguliavimo (visų tipų imuninio atsako stiprumo apribojimas ir
uždegimas)

Citokinai yra apie 100 sudėtingų baltymų, dalyvaujančių daugelyje imuninių ir uždegiminių procesų žmogaus organizme. Jie nesikaupia juos gaminančiose ląstelėse ir greitai sintetinami bei išskiriami.

Tinkamai veikiantys citokinai užtikrina, kad imuninė sistema veiktų sklandžiai ir efektyviai. Jų būdingas bruožas yra veiksmų universalumas. Daugeliu atvejų jie turi kaskadinį efektą, kuris pagrįstas abipuse nepriklausoma kitų citokinų sinteze. Besivystantį uždegiminį procesą kontroliuoja tarpusavyje susiję priešuždegiminiai citokinai.

Kas yra citokinai

Citokinai – tai didelė grupė reguliuojančių baltymų, kurių molekulinė masė svyruoja nuo 15 iki 25 kDa (kilodaltonas yra atominės masės vienetas). Jie veikia kaip tarpląstelinio signalo tarpininkai. Jų būdingas bruožas yra informacijos perdavimas tarp ląstelių nedideliais atstumais. Jie dalyvauja pagrindinių organizmo gyvybinių procesų valdyme. Jie yra atsakingi už pradžią platinimas, t.y. ląstelių dauginimosi procesas, po kurio vyksta jų diferenciacija, augimas, aktyvumas ir apoptozė. Citokinai nustato imuninio atsako humoralinę ir ląstelinę fazę.

Citokinai gali būti laikomi tam tikra imuninės sistemos hormonai. Be kitų šių baltymų savybių, visų pirma išskiriamas gebėjimas paveikti organizmo energijos balansą keičiantis apetitui ir medžiagų apykaitai, įtaka nuotaikai, širdies ir kraujagyslių sistemos funkcijoms ir struktūroms, padidėjęs mieguistumas.

Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas priešuždegiminiai ir priešuždegiminiai citokinai. Pirmųjų vyravimas sukelia uždegiminę reakciją su karščiavimu, pagreitėjusiu kvėpavimo dažniu ir leukocitoze. Kiti turi pranašumą, nes sukelia priešuždegiminį atsaką.

Citokinų savybės

Pagrindinės citokinų savybės:

• perteklius- galimybė sukurti tą patį efektą
• pliotropija- gebėjimas paveikti įvairių tipų ląsteles ir sukelti jose skirtingus veiksmus
• sinergija- sąveika
• indukcija teigiamo ir neigiamo grįžtamojo ryšio etapai
• antagonizmas– Abipusis veiksmo efektų blokavimas

Citokinai ir jų poveikis kitoms ląstelėms

Citokinai ypač veikia:

• B limfocitai – tai imuninės sistemos ląstelės, atsakingos už humoralinį imuninį atsaką, t.y. antikūnų gamyba;
• T-limfocitai – imuninės sistemos ląstelės, atsakingos už ląstelinį imuninį atsaką; jie gamina ypač Th1 ir Th2 limfocitus, tarp kurių stebimas antagonizmas; Th1 palaiko ląstelių atsaką ir Th2 humoralinį atsaką; Th1 citokinai neigiamai veikia Th2 vystymąsi ir atvirkščiai;
• NK ląstelės – imuninės sistemos ląstelių grupė, atsakinga už natūralaus citotoksiškumo reiškinius (toksinį poveikį citokinams, kuriems nereikia stimuliuoti specifinių mechanizmų antikūnų pavidalu);
• Monocitai yra morfologiniai kraujo elementai, jie vadinami baltaisiais kraujo kūneliais;
• Makrofagai yra imuninės sistemos ląstelių populiacija, gaunama iš kraujo monocitų pirmtakų; jie veikia tiek įgimto imuniteto procesuose, tiek įgytuose (adaptyviai);
• Granulocitai yra baltųjų kraujo kūnelių tipas, pasižymintis fagocitų savybėmis, kurios turėtų būti suprantamos kaip gebėjimas absorbuoti ir sunaikinti bakterijas, negyvas ląsteles ir kai kuriuos virusus.

Priešuždegiminiai citokinai

Priešuždegiminiai citokinai dalyvauja reguliuojant imuninį atsaką ir hematopoezę (morfozinių kraujo elementų gamybos ir diferenciacijos procesą) ir inicijuoja uždegiminės reakcijos vystymąsi. Jie dažnai vadinami imunotransmiteriais.

Pagrindiniai priešuždegiminiai citokinai yra šie:

• TNF arba naviko nekrozės faktorius, anksčiau vadintas kektsin. Šiuo pavadinimu yra baltymų grupė, kuri lemia limfocitų aktyvumą. Jie gali sukelti apoptozę, natūralų užprogramuotos mirties procesą. vėžio ląstelės. Išskirti TNF-α ir TNF-β.
• IL-1, t.y. interleukinas 1. Tai vienas iš pagrindinių uždegiminio imuninio atsako reguliatorių. Ypač aktyviai dalyvauja uždegiminėse žarnyno reakcijose. Tarp 10 jo veislių išskiriami IL-1α, IL-1β, IL-1γ. Šiuo metu jis apibūdinamas kaip interleukinas 18.
• IL-6, t.y. interleukinas 6, kuris turi pleiotropinį arba daugiakryptį poveikį. Jo koncentracija padidėja opiniu kolitu sergančių pacientų serume. Jis stimuliuoja hematopoezę, parodydamas sinergiją su interleukinu 3. Stimuliuoja B limfocitų diferenciaciją į plazmines ląsteles.

Priešuždegiminiai citokinai

Priešuždegiminiai citokinai mažina uždegiminį atsaką, slopindami monocitų ir makrofagų, ypač IL-1, IL-6, IL-8, gamybą priešuždegiminių citokinų.

Tarp pagrindinių priešuždegiminių citokinų visų pirma minimas IL-10, t.y. interleukinas 10 (faktorius, slopinantis citokinų sintezę), IL 13, IL 4, kurie dėl citokinų sekrecijos indukcijos. kurie veikia kraujodarą, teigiamai veikia kraujo ląstelių gamybą.

Šiame skyriuje bus nagrinėjamas integruotas požiūris į citokinų sistemos vertinimą, naudojant anksčiau aprašytus šiuolaikinius tyrimo metodus.

Pirmiausia aprašome pagrindines citokinų sistemos sąvokas.

Citokinai šiuo metu laikomi baltymų-peptidų molekulėmis, kurias gamina įvairios kūno ląstelės ir kurios atlieka tarpląstelinę ir tarpsisteminę sąveiką. Citokinai yra universalūs ląstelės gyvavimo ciklo reguliatoriai, jie kontroliuoja pastarųjų diferenciacijos, proliferacijos, funkcinio aktyvavimo ir apoptozės procesus.

Citokinai, kuriuos gamina imuninės sistemos ląstelės, vadinami imunocitokinais; jie atstovauja imuninės sistemos tirpių peptidinių mediatorių klasei, būtinų jos vystymuisi, veikimui ir sąveikai su kitomis organizmo sistemomis (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Kaip reguliacinės molekulės, citokinai atlieka svarbų vaidmenį įgyvendinant įgimtas ir adaptacines imuniteto reakcijas, užtikrina jų tarpusavio ryšį, kontroliuoja kraujodarą, uždegimus, žaizdų gijimą, naujų kraujagyslių formavimąsi (angiogenezę) ir daugelį kitų gyvybiškai svarbių procesų.

Šiuo metu yra keletas skirtingų citokinų klasifikacijų, atsižvelgiant į jų struktūrą, funkcinį aktyvumą, kilmę ir citokinų receptorių tipą. Tradiciškai, atsižvelgiant į biologinį poveikį, įprasta išskirti šias citokinų grupes.

1. Interleukinai(IL-1-IL-33) – imuninės sistemos sekreciją reguliuojantys baltymai, užtikrinantys mediatorių sąveiką imuninėje sistemoje ir jos ryšį su kitomis organizmo sistemomis. Interleukinai pagal funkcinį aktyvumą skirstomi į priešuždegiminius ir priešuždegiminius citokinus, limfocitų augimo faktorius, reguliuojančius citokinus ir kt.

3. Naviko nekrozės faktoriai (TNF)- citokinai, turintys citotoksinį ir reguliuojantį poveikį: TNFa ir limfotoksinai (LT).

4. Hematopoetinių ląstelių augimo faktoriai- kamieninių ląstelių augimo faktorius (Kit - ligandas), IL-3, IL-7, IL-11, eritropoetinas, trobopoetinas, granulocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius - GM-CSF, granulocitinis CSF - G-CSF, makrofagas-

ny KSF – M-CSF).

5. Chemokinai- С, СС, СХС (IL-8), СХ3С - įvairių ląstelių tipų chemotaksės reguliatoriai.

6. Ne limfoidinių ląstelių augimo faktoriai- įvairių audinių priklausomybių ląstelių augimo, diferenciacijos ir funkcinio aktyvumo reguliatoriai (fibroblastų augimo faktorius – FGF, endotelio ląstelių augimo faktorius, epidermio augimo faktorius – epidermio EGF) ir transformuojantys augimo faktoriai (TGFβ, TGFα).

Be kita ko, pastaraisiais metais buvo aktyviai tiriamas makrofagų migraciją slopinantis veiksnys (migraciją slopinantis faktorius – MIF), kuris laikomas neurohormonu, turinčiu citokinų ir fermentų aktyvumą (Suslov A.P., 2003; Kovalchuk L.V. ir kt.). ,

Citokinai skiriasi struktūra, biologiniu aktyvumu ir kitomis savybėmis. Tačiau, kartu su skirtumais, citokinai turi bendrosios savybės, būdingas šiai bioreguliacinių molekulių klasei.

1. Citokinai, kaip taisyklė, yra vidutinės molekulinės masės (mažiau nei 30 kD) glikozilinti polipeptidai.

2. Citokinus gamina imuninės sistemos ląstelės ir kitos ląstelės (pavyzdžiui, endotelis, fibroblastai ir kt.), reaguodamos į aktyvuojantį dirgiklį (su patogenais susijusias molekulines struktūras, antigenus, citokinus ir kt.) ir dalyvauja reakcijose. įgimto ir adaptyvaus imuniteto, reguliuojančio jų stiprumą ir trukmę. Kai kurie citokinai sintetinami iš esmės.

3. Citokinų sekrecija yra trumpas procesas. Citokinai išlieka ne kaip iš anksto suformuotos molekulės, o veikiau

sintezė visada prasideda nuo genų transkripcijos. Ląstelės gamina citokinus mažomis koncentracijomis (pikogramų mililitre).

4. Daugeliu atvejų citokinai gaminami ir veikia tikslines ląsteles, kurios yra arti (trumpojo nuotolio veikimas). Pagrindinė citokinų veikimo vieta yra tarpląstelinė sinapsė.

5. Perteklius Citokinų sistema pasireiškia tuo, kad kiekvienas ląstelių tipas gali gaminti keletą citokinų, o kiekvieną citokiną gali išskirti skirtingos ląstelės.

6. Visi citokinai yra charakterizuojami pleiotropija, arba veiksmo daugiafunkciškumas. Taigi uždegimo požymiai pasireiškia dėl IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 įtakos. Funkcijų dubliavimas užtikrina citokinų sistemos patikimumą.

7. Citokinų poveikį tikslinėms ląstelėms sąlygoja labai specifiniai, didelio afiniteto membraniniai receptoriai, kurie yra transmembraniniai glikoproteinai, dažniausiai susidedantys iš daugiau nei vieno subvieneto. Tarpląstelinė receptorių dalis yra atsakinga už citokinų surišimą. Yra receptorių, kurie pašalina citokinų perteklių patologiniame židinyje. Tai yra vadinamieji apgaulės receptoriai. Tirpieji receptoriai yra tarpląstelinis membranos receptoriaus domenas, atskirtas fermentu. Tirpieji receptoriai geba neutralizuoti citokinus, dalyvauti juos transportuojant į uždegimo židinį ir pašalinant iš organizmo.

8. Citokinai veikia kaip tinklas. Jie gali veikti kartu. Atrodo, kad daugelis funkcijų, iš pradžių priskirtų vienam citokinui, atsirado dėl kelių citokinų suderinto veikimo. (sinergizmas veiksmai). Citokinų sinergetinės sąveikos pavyzdžiai yra uždegiminių reakcijų (IL-1, IL-6 ir TNFa) stimuliavimas, taip pat IgE sintezė.

(IL-4, IL-5 ir IL-13).

Kai kurie citokinai skatina kitų citokinų sintezę (kaskados). Kaskadinis citokinų veikimas yra būtinas uždegiminiam ir imuniniam atsakui vystytis. Vienų citokinų gebėjimas padidinti arba sumažinti kitų gamybą lemia svarbius teigiamus ir neigiamus reguliavimo mechanizmus.

Antagoninis citokinų poveikis yra žinomas, pavyzdžiui, IL-6 gamyba reaguojant į TNF-a koncentracijos padidėjimą gali būti

neigiamas reguliavimo mechanizmas, skirtas kontroliuoti šio mediatoriaus gamybą uždegimo metu.

Tikslinių ląstelių funkcijų citokinų reguliavimas atliekamas naudojant autokrininius, parakrininius arba endokrininius mechanizmus. Kai kurie citokinai (IL-1, IL-6, TNFα ir kt.) gali dalyvauti įgyvendinant visus aukščiau išvardintus mechanizmus.

Ląstelės reakcija į citokinų poveikį priklauso nuo kelių veiksnių:

Nuo ląstelių tipo ir jų pradinio funkcinio aktyvumo;

Nuo vietinės citokino koncentracijos;

Nuo kitų tarpininkų molekulių buvimo.

Taigi, prodiuserinės ląstelės, citokinai ir jų specifiniai receptoriai tikslinėse ląstelėse sudaro vieną tarpininkų tinklą. Tai yra reguliuojančių peptidų rinkinys, o ne atskiri citokinai, lemiantys galutinį ląstelės atsaką. Šiuo metu citokinų sistema laikoma universalia viso organizmo lygmens reguliavimo sistema, užtikrinančia apsauginių reakcijų vystymąsi (pavyzdžiui, infekcijos metu).

Pastaraisiais metais kilo idėja apie citokinų sistemą, kuri jungia:

1) gamintojų ląstelės;

2) tirpūs citokinai ir jų antagonistai;

3) tikslinės ląstelės ir jų receptoriai (7.1 pav.).

Įvairių citokinų sistemos komponentų pažeidimai sukelia daugybės patologinių procesų vystymąsi, todėl šios reguliavimo sistemos defektų nustatymas yra svarbus teisingai diagnozei ir tinkamo gydymo paskyrimui.

Pirmiausia panagrinėkime pagrindinius citokinų sistemos komponentus.

Citokinus gaminančios ląstelės

I. Pagrindinė ląstelių grupė, gaminančių citokinus adaptaciniame imuniniame atsake, yra limfocitai. Ramybės ląstelės neišskiria citokinų. Atpažinus antigeną ir dalyvaujant receptorių sąveikai (CD28-CD80/86 – T-limfocitams ir CD40-CD40L – B-limfocitams), įvyksta ląstelių aktyvacija, dėl kurios vyksta citokinų genų transkripcija, transliacija ir glikozilintų peptidų sekrecija. į ekstraląstelinę erdvę.

Ryžiai. 7.1. Citokinų sistema

CD4 T pagalbininkus atstovauja subpopuliacijos: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, kurios viena nuo kitos skiriasi išskiriamų citokinų spektru, reaguodamos į įvairius antigenus.

Th0 gamina platų citokinų spektrą labai mažomis koncentracijomis.

Diferenciacijos kryptis Th0 lemia dviejų imuninio atsako formų vystymąsi, kai vyrauja humoraliniai arba ląsteliniai mechanizmai.

Antigeno prigimtis, jo koncentracija, lokalizacija ląstelėje, antigeną pateikiančių ląstelių tipas ir tam tikras citokinų rinkinys reguliuoja Th0 diferenciacijos kryptį.

Dendritinės ląstelės po antigeno surinkimo ir apdorojimo pateikia antigeninius peptidus Th0 ląstelėms ir gamina citokinus, kurie reguliuoja jų diferenciacijos į efektorines ląsteles kryptį. Atskirų citokinų vaidmuo šiame procese parodytas fig. 7.2. IL-12 indukuoja T-limfocitų ir ]ChGK IFNγ sintezę. IFNu suteikia Th1 diferenciaciją, kuri pradeda išskirti citokinus (IL-2, IFNu, IL-3, TNFa, limfotoksinus), kurie reguliuoja reakcijų į tarpląstelinius patogenus vystymąsi.

(uždelsto tipo padidėjęs jautrumas (DTH) ir įvairių tipų ląstelių citotoksiškumas).

IL-4 užtikrina Th0 diferenciaciją į Th2. Aktyvuotas Th2 gamina citokinus (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 ir kt.), kurie lemia B limfocitų dauginimąsi, tolesnę jų diferenciaciją į plazmines ląsteles ir antikūnų atsakų, daugiausia prieš ekstraląsteliniai patogenai.

IFNy neigiamai reguliuoja Th2 ląstelių funkciją ir, atvirkščiai, Th2 išskiriami IL-4, IL-10 slopina Th1 funkciją (7.3 pav.). Šio reguliavimo molekulinis mechanizmas yra susijęs su transkripcijos faktoriais. T-bet ir STAT4 ekspresija, nustatyta IFNy, nukreipia T-ląstelių diferenciaciją Th1 keliu ir slopina Th2 vystymąsi. IL-4 indukuoja GATA-3 ir STAT6 ekspresiją, kas atitinkamai užtikrina naivių Th0 pavertimą Th2 ląstelėmis (7.2 pav.).

Pastaraisiais metais buvo aprašyta atskira T pagalbinių ląstelių (Th17) subpopuliacija, gaminanti IL-17. IL-17 šeimos narius gali ekspresuoti aktyvuotos atminties ląstelės (CD4 CD45RO), y5T ląstelės, NKT ląstelės, neutrofilai, monocitai, veikiami IL-23, IL-6, TGFβ, kuriuos gamina makrofagai ir dendritinės ląstelės. ROR-C yra pagrindinis diferenciacijos faktorius žmonėms ir ROR-γ pelėms. l Pagrindinis IL-17 vaidmuo kuriant lėtinis uždegimas ir autoimuninė patologija (žr. 7.2 pav.).

Be to, T limfocitai užkrūčio liaukoje gali diferencijuotis į natūralias reguliuojančias ląsteles (Treg), ekspresuojančias CD4+ CD25+ paviršiaus žymenis ir FOXP3 transkripcijos faktorių. Šios ląstelės gali slopinti Th1 ir Th2 ląstelių sukeliamą imuninį atsaką per tiesioginį tarpląstelinį kontaktą ir TGFβ bei IL-10 sintezę.

Th0 klonų ir jų išskiriamų citokinų diferenciacijos schemos parodytos Fig. 7.2 ir 7.3 (taip pat žr. spalvų intarpą).

T-citotoksinės ląstelės (CD8+), natūralūs žudikai – silpni citokinų, tokių kaip interferonai, TNFa ir limfotoksinai, gamintojai.

Per didelis vienos iš Th subpopuliacijų aktyvavimas gali lemti vieno iš imuninio atsako variantų išsivystymą. Lėtinis Th aktyvacijos disbalansas gali sukelti imunopatologinių būklių, susijusių su apraiškomis

mi alergijos, autoimuninė patologija, lėtiniai uždegiminiai procesai ir kt.

Ryžiai. 7.2.Įvairios T-limfocitų subpopuliacijos, gaminančios citokinus

II. Įgimtoje imuninėje sistemoje pagrindiniai citokinų gamintojai yra mieloidinės ląstelės. Naudodami į Toll panašius receptorius (TLR), jie atpažįsta panašias įvairių patogenų molekulines struktūras, vadinamuosius su patogenais susijusius molekulinius modelius (PAMP), pvz., pasikartojimus ir kt.

Ši sąveika su TLR sukelia tarpląstelinį signalo perdavimo kaskadą, vedančią prie dviejų pagrindinių citokinų grupių genų ekspresijos: priešuždegiminio ir 1 tipo IFN (7.4 pav., taip pat žr. spalvotą intarpą). Dažniausiai šie citokinai (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, chemokinai ir kt.) skatina uždegimų vystymąsi ir yra susiję su organizmo apsauga nuo bakterinių ir virusinių infekcijų.

Ryžiai. 7.3. Th1 ir Th12 ląstelių išskiriamų citokinų spektras

III. Ląstelės, kurios nėra imuninės sistemos dalis (jungiamojo audinio, epitelio, endotelio ląstelės), konstitutyviai išskiria autokrininius augimo faktorius (GGF, EGF, TGFr ir kt.). ir citokinai, palaikantys hematopoetinių ląstelių dauginimąsi.

Citokinai ir jų antagonistai yra išsamiai aprašytos daugelyje monografijų (Kovalchuk L.V. ir kt., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Ryžiai. 7.4. TLR sukelta citokinų gamybos indukcija, kurią sukelia įgimtos imuninės ląstelės

Pernelyg didelė citokinų ekspresija yra nesaugi organizmui ir gali sukelti pernelyg didelę uždegiminę reakciją, ūminės fazės atsaką. Įvairūs inhibitoriai dalyvauja reguliuojant uždegimą skatinančių citokinų gamybą. Taigi buvo aprašyta nemažai medžiagų, kurios nespecifiškai suriša citokiną IL-1 ir neleidžia pasireikšti jo biologiniam poveikiui (a2-makroglobulinas, komplemento C3-komponentas, uromodulinas). Specifiniai IL-1 inhibitoriai gali būti tirpūs jauko receptoriai, antikūnai ir IL-1 receptorių antagonistai (IL-1RA). Vystantis uždegimui, didėja IL-1RA geno ekspresija. Tačiau net ir paprastai šio antagonisto kraujyje yra didelė koncentracija (iki 1 ng / ml ar daugiau), blokuodamas endogeninio IL-1 veikimą.

tikslinės ląstelės

Citokinai veikia tikslines ląsteles per specifinius receptorius, kurie labai dideliu afinitetu jungiasi su citokinais, o atskiri citokinai gali naudoti

bendrieji receptorių subvienetai. Kiekvienas citokinas jungiasi prie savo specifinio receptoriaus.

Citokinų receptoriai yra transmembraniniai baltymai ir skirstomi į 5 pagrindinius tipus. Labiausiai paplitę yra vadinamieji hematopoetinio tipo receptoriai, turintys du tarpląstelinius domenus, iš kurių viena turi bendrą aminorūgščių liekanų seką iš dviejų triptofano ir serino pasikartojimų, atskirtų bet kuria aminorūgštimi (WSXWS motyvas). Antrojo tipo receptoriai gali turėti du tarpląstelinius domenus su daugybe konservuotų cisteinų. Tai yra IL-10 ir IFN šeimos receptoriai. Trečiasis tipas yra citokinų receptoriai, priklausantys TNF grupei. Ketvirtasis citokinų receptorių tipas priklauso imunoglobulino receptorių šeimai, kurios ekstraląsteliniai domenai yra panašūs į imunoglobulino molekulių struktūrą. Penktasis receptorių tipas, jungiantis chemokinų šeimos molekules, yra transmembraniniai baltymai, kurie kerta ląstelės membraną 7 vietose. Citokinų receptoriai gali egzistuoti tirpios formos, išlaikant gebėjimą surišti ligandus (Ketlinsky S.A. ir kt., 2008).

Citokinai gali paveikti tikslinių ląstelių proliferaciją, diferenciaciją, funkcinį aktyvumą ir apoptozę (žr. 7.1 pav.). Biologinio citokinų aktyvumo pasireiškimas tikslinėse ląstelėse priklauso nuo įvairių tarpląstelinių sistemų dalyvavimo perduodant signalą iš receptoriaus, kuris yra susijęs su tikslinių ląstelių savybėmis. Apoptozės signalas, be kita ko, perduodamas tam tikros TNF receptorių šeimos srities, vadinamosios „mirties“ srities, pagalba (7.5 pav., žr. spalvotą intarpą). Diferenciacijos ir aktyvacijos signalai perduodami per intraląstelinius Jak-STAT baltymus – signalų keitiklius ir transkripcijos aktyvatorius (7.6 pav., žr. spalvų intarpą). G baltymai dalyvauja perduodant signalą iš chemokinų, o tai padidina ląstelių migraciją ir adheziją.

Sudėtinga citokinų sistemos analizė apima šiuos dalykus.

I. Gamintojų ląstelių įvertinimas.

1. Išraiškos apibrėžimas:

Receptoriai, atpažįstantys patogeną arba TCR antigeną, TLR) genų ir baltymų molekulių lygyje (PGR, srauto citometrijos metodas);

Adapterio molekulės, vedančios signalą, kuris sukelia citokinų genų transkripciją (PGR ir kt.);

Ryžiai. 7.5. Signalo perdavimas iš TNF receptoriaus

Ryžiai. 7.6. Jak-STAT – 1 tipo citokinų receptorių signalizacijos kelias

Citokinų genai (PGR); citokinų baltymų molekulės (žmogaus mononuklearinių ląstelių citokinų sintezės funkcijos įvertinimas).

2. Ląstelių subpopuliacijų, turinčių tam tikrus citokinus, kiekybinis nustatymas: Th1, Th2 Th17 (citokinų intracelulinio dažymo metodas); ląstelių, išskiriančių tam tikrus citokinus, skaičiaus nustatymas (ELISPOT metodas, žr. 4 skyrių).

II. Citokinų ir jų antagonistų įvertinimas biologinėse organizmo terpėse.

1. Biologinio citokinų aktyvumo tyrimas.

2. Kiekybinis citokinų nustatymas ELISA metodu.

3. Imunohistocheminis citokinų dažymas audiniuose.

4. Priešingų citokinų (pro- ir priešuždegiminių), citokinų ir citokinų receptorių antagonistų santykio nustatymas.

III. Tikslinės ląstelės įvertinimas.

1. Citokinų receptorių raiškos genų ir baltymų molekulių lygiu nustatymas (PGR, srauto citometrijos metodas).

2. Signalinių molekulių nustatymas viduląsteliniame turinyje.

3. Tikslinių ląstelių funkcinio aktyvumo nustatymas.

Buvo sukurta daugybė citokinų sistemos vertinimo metodų, skirtų įvairiai informacijai gauti. Tarp jų išskiriami:

1) molekuliniai biologiniai metodai;

2) kiekybinio citokinų nustatymo imunologinio tyrimo metodais;

3) citokinų biologinio aktyvumo tyrimas;

4) intracelulinis citokinų dažymas;

5) ELISPOT metodas, leidžiantis aptikti citokinus aplink vieną citokinus gaminančią ląstelę;

6) imunofluorescencija.

Pristatome Trumpas aprašymasšiuos metodus.

Naudojant molekuliniai biologiniai metodai galima tirti citokinų genų raišką, jų receptorius, signalines molekules, tirti šių genų polimorfizmą. Pastaraisiais metais buvo atlikta daugybė tyrimų, kurie atskleidė ryšį tarp citokinų sistemos molekulių genų alelių variantų ir polinkio.

daugeliui ligų. Citokinų genų alelinių variantų tyrimas gali suteikti informacijos apie genetiškai užprogramuotą konkretaus citokino gamybą. Jautriausia yra realaus laiko polimerazės grandininė reakcija – PGR-RT (žr. 6 sk.). hibridizacijos metodas savo vietoje leidžia išsiaiškinti citokinų genų ekspresijos lokalizaciją audiniuose ir ląstelėse.

Kiekybinį citokinų nustatymą biologiniuose skysčiuose ir periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių kultūrose ELISA metodu galima apibūdinti taip. Kadangi citokinai yra vietiniai tarpininkai, tikslingiau matuoti jų kiekį atitinkamuose audiniuose po audinių baltymų ekstrahavimo arba natūraliuose skysčiuose, tokiuose kaip ašaros, burnos plovimas, šlapimas, amniono skystis, smegenų skystis ir kt. Citokinų kiekis serume ar kituose kūno skysčiuose atspindi esamą imuninės sistemos būklę, t.y. kūno ląstelių citokinų sintezė in vivo.

Citokinų gamybos lygio nustatymas periferinio kraujo mononuklearinėse ląstelėse (PBMC) parodo funkcinę ląstelių būklę. Spontaniška MNC citokinų gamyba kultūroje rodo, kad ląstelės jau aktyvuotos. in vivo. Citokinų sintezė, kurią sukelia įvairūs stimuliatoriai, mitogenai, atspindi potencialų, rezervinį ląstelių gebėjimą reaguoti į antigeninį dirgiklį (ypač į veikimą). vaistai). Sumažėjusi citokinų gamyba gali būti vienas iš imunodeficito būklės požymių. Citokinai nėra specifiniai konkrečiam antigenui. Todėl specifinė infekcinių, autoimuninių ir alerginės ligos naudojant tam tikrų citokinų lygio nustatymą neįmanoma. Tuo pačiu metu citokinų kiekio įvertinimas leidžia gauti duomenis apie uždegiminio proceso sunkumą, jo perėjimą į sisteminį lygį ir prognozę, imuninės sistemos ląstelių funkcinį aktyvumą, Th1 ir Th2 ląstelių santykį. kuri yra labai svarbi daugelio infekcinių ir imunopatologinių procesų diferencinei diagnostikai.

Biologinėje terpėje citokinus galima kiekybiškai įvertinti naudojant įvairius imunologinio tyrimo metodai, naudojant polikloninius ir monokloninius antikūnus (žr. 4 skyrių). ELISA leidžia sužinoti, kokios yra tikslios citokinų koncentracijos bio-

loginiai kūno skysčiai. ELISA citokinų aptikimas turi nemažai pranašumų prieš kitus metodus (didelis jautrumas, specifiškumas, nepriklausomumas nuo antagonistų buvimo, tikslios automatizuotos apskaitos galimybė, apskaitos standartizavimas). Tačiau šis metodas taip pat turi savo apribojimų: ELISA neapibūdina biologinio citokinų aktyvumo ir gali duoti klaidingus rezultatus dėl kryžminės reakcijos epitopų.

biologinis tyrimas atliekami remiantis žiniomis apie pagrindines citokinų savybes, jų poveikį tikslinėms ląstelėms. Biologinio citokinų poveikio tyrimas leido sukurti keturių tipų citokinų tyrimus:

1) indukuojant tikslinių ląstelių proliferaciją;

2) citotoksiniu poveikiu;

3) skatinant kaulų čiulpų pirmtakų diferenciaciją;

4) antivirusiniu poveikiu.

IL-1 nustatomas pagal stimuliuojantį poveikį pelių timocitų, aktyvuotų mitogeno, proliferacijai. in vitro; IL-2 – pagal gebėjimą stimuliuoti limfoblastų proliferacinį aktyvumą; dėl citotoksinio poveikio pelių fibroblastams (L929), tiriami TNFa ir limfotoksinai. Kolonijas stimuliuojantys faktoriai vertinami pagal jų gebėjimą palaikyti kaulų čiulpų pirmtakų augimą kaip kolonijas ant agaro. Antivirusinis IFN aktyvumas nustatomas slopinant citopatinį virusų poveikį diploidinių žmogaus fibroblastų kultūroje ir pelių fibroblastų L-929 navikų linijoje.

Buvo sukurtos ląstelių linijos, kurių augimas priklauso nuo tam tikrų citokinų buvimo. Lentelėje. 7.1 yra citokinų tyrimams naudojamų ląstelių linijų sąrašas. Pagal gebėjimą paskatinti jautrių tikslinių ląstelių dauginimąsi, atliekami IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 ir kt., Tačiau šie tyrimo metodai. nėra labai jautrūs ir informatyvūs. Inhibitorių ir antagonistų molekulės gali užmaskuoti biologinį citokinų aktyvumą. Kai kurie citokinai pasižymi bendru biologiniu aktyvumu. Nepaisant to, šie metodai idealiai tinka specifiniam rekombinantinių citokinų aktyvumui tirti.

7.1 lentelė. Ląstelių linijos, naudojamos citokinų biologiniam aktyvumui patikrinti

Lentelės pabaiga. 7.1

7-1 laboratorija

IL-1 biologinio aktyvumo nustatymas pagal jo komitogeninį poveikį pelių timocitų proliferacijai

IL-1 biologinio tyrimo metodas pagrįstas citokino gebėjimu stimuliuoti pelių timocitų proliferaciją.

IL-1 galima nustatyti LPS stimuliuojamų monocitų kultūroje, taip pat bet kuriame kūno skystyje. Būtina atkreipti dėmesį į daugybę smulkmenų.

1. Tyrimams naudojami C3H/HeJ pelių timocitai, stimuliuojami daugintis mitogenais (konkanavalinu A – ConA ir fitohemagliutininu – PHA). C3H/HeJ timocitai pasirinkti neatsitiktinai: šios inbred linijos pelės nereaguoja į LPS, kurios gali būti tiriamojoje medžiagoje ir sukelti IL-1 gamybą.

2. Timocitai reaguoja į IL-2 ir mitogenus, todėl IL-1 tirtuose preparatuose taip pat reikia nustatyti IL-2 ir mitogenų buvimą.

Veikimo procedūra

1. Paimkite 12×10 6 /ml terpės RPMI 1640 koncentracijos timocitų suspensiją, kurioje yra 10 % vaisiaus karvių serumo ir 2-merkaptoetanolio (5×10 -5 M).

2. Paruošiama iš eilės eksperimentinių (kūno skysčių) ir kontrolinių mėginių dvigubų skiedimų serija. Kaip kontrolė naudojami biologiniai skysčiai, turintys IL-1, arba mėginiai, gauti inkubuojant mononuklearines ląsteles be LPS, ir laboratorinis standartinis preparatas, turintis IL-1. 96 šulinėlių apvaliadugnėse plokštelėse po 50 µl kiekvieno skiedimo perpilama į 6 šulinėlius.

3. Į tris kiekvieno skiedimo duobutes įpilkite 50 µl išgryninto PHA (Wellcome), ištirpinto pilnoje terpėje, kurios koncentracija yra 3 µg/ml, ir 50 µl terpės į kitas 3 duobutes.

4. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 µl timocitų suspensijos ir inkubuokite 48 valandas 37°C temperatūroje.

6. Prieš baigiant auginimą, į šulinėlius įpilama 50 μl [" 3 H]-timidino tirpalo (1 μCi / ml) ir inkubuojama dar 20 valandų.

7. Radioaktyvumo lygiui nustatyti kultūros ląstelės perkeliamos ant filtravimo popieriaus naudojant automatinį ląstelių rinktuvą, filtrai išdžiovinami ir etiketės įtraukimas nustatomas skysčių scintiliacijos skaitikliu.

8. Rezultatai išreiškiami stimuliacijos koeficientu.

kur m cp yra vidutinis impulsų skaičius 3 skylėse.

Jei timocitai reaguoja į stimuliavimą standartiniu IL-1, tada tiriamojo mėginio stimuliacijos indeksas, viršijantis 3, patikimai rodo IL-1 aktyvumą.

Biologinis tyrimas yra vienintelis metodas citokinų funkcijai įvertinti, tačiau šis metodas turėtų būti papildytas skirtingi tipai tinkama specifiškumo kontrolė naudojant monokloninius antikūnus. Tam tikrų monokloninių antikūnų pridėjimas prie citokinų kultūroje blokuoja citokino biologinį aktyvumą, o tai įrodo, kad ląstelių linijos proliferacijos signalas yra nustatytas citokinas.

Naudojant biologinį tyrimą interferonui nustatyti. IFN biologinio aktyvumo vertinimo principas grindžiamas jo antivirusiniu poveikiu, kuris nustatomas pagal tiriamojo viruso dauginimosi slopinimo laipsnį ląstelių kultūroje.

Darbe gali būti naudojamos ląstelės, jautrios IFN veikimui: iš pradžių tripsinuotos vištienos ir žmogaus embrioninės fibroblastų ląstelės, persodintos žmogaus diploidinių fibroblastų ląstelės ir pelės ląstelių kultūra (L929).

Vertinant antivirusinį IFN poveikį, patartina naudoti trumpo dauginimosi ciklo, didelio jautrumo IFN veikimui virusus: pelių encefalomielito virusą, pelių vezikulinį stomatitą ir kt.

7-2 laboratorija

Interferono aktyvumo nustatymas

1. Diploidinių žmogaus vaisiaus fibroblastų suspensija terpėje su 10 % galvijų embrionų serumo (ląstelių koncentracija - 15-20×10 6 /ml) pilama į sterilias 96 šulinėlių plokščiadugnes lėkštes, po 100 μl į duobutę ir dedama. CO 2 -inkubatoriuje 37 °C temperatūroje.

2. Susidarius pilnam monosluoksniui, auginimo terpė pašalinama iš šulinėlių ir į kiekvieną šulinėlį įpilama 100 µl palaikomosios terpės.

3. IFN aktyvumas tiriamuosiuose mėginiuose titruojamas naudojant dvigubo praskiedimo metodą viename fibroblastų sluoksnyje.

Kartu su mėginiais į duobutes įvedamas pelių encefalomielito virusas (MEM), kurio dozė 48 valandas po užsikrėtimo sukelia 100 % ląstelių pažeidimą.

4. Šuliniai su nepažeistomis (neapdorotomis) virusu užkrėstomis ląstelėmis naudojami kaip kontroliniai mėginiai.

Kiekviename tyrime kaip etaloniniai preparatai naudojami žinomo aktyvumo etaloniniai IFN mėginiai.

5. Mėginio skiedimo plokštelės inkubuojamos 24 valandas 37°C temperatūroje 5 % CO 2 atmosferoje.

6. IFN aktyvumo lygis nustatomas pagal tiriamojo mėginio maksimalaus praskiedimo abipusę vertę, dėl kurios viruso citopatinis poveikis atitolinamas 50 %, ir išreiškiamas aktyvumo vienetais 1 ml.

7. Norint nustatyti IFN tipą, į sistemą pridedamas antiserumas prieš IFNα, IFNβ arba IFNγ. Antiserumas panaikina atitinkamo citokino veikimą, todėl galima nustatyti IFN tipą.

Slopinamojo faktoriaus migracijos biologinio aktyvumo nustatymas.Šiuo metu susiformavusios visiškai naujos idėjos apie MITO prigimtį ir savybes, atrastas praėjusio amžiaus 60-aisiais kaip ląstelinio imuniteto tarpininkas ir daugelį metų paliktas be deramo dėmesio (Bloom B.R., Bennet B., 1966; David J.R. , 1966). Tik per pastaruosius 10–15 metų paaiškėjo, kad MITAS yra vienas svarbiausių biologinių tarpininkų organizme, atliekantis įvairias biologines citokino, hormono ir fermento funkcijas. MIF poveikis tikslinėms ląstelėms realizuojamas per CD74 receptorių arba per neklasikinį endocitozės kelią.

MITAS matomas kaip svarbus tarpininkas uždegimą, aktyvinantį makrofagų funkciją (citokinų gamybą, fagocitozę, citotoksiškumą ir kt.), taip pat endogeninį imunoreguliacinį hormoną, moduliuojantį gliukokortikoidų aktyvumą.

Sukaupiama vis daugiau informacijos apie MITO vaidmenį daugelio uždegiminių ligų, įskaitant sepsį, reumatoidinį artritą (RA), glomerulonefritą ir kt., patogenezėje. Sergant RA, MITO koncentracija pažeistų sąnarių skystyje žymiai padidėja. , kuris koreliuoja su ligos sunkumu. MIF įtakoje didėja priešuždegiminių citokinų gamyba tiek makrofagų, tiek sinovijų ląstelėse.

Yra įvairių MIF aktyvumo tyrimo metodų, kai migruojančios ląstelės (MIF tikslinės ląstelės) dedamos į stiklinį kapiliarą (kapiliarinis testas), į agarozės lašą arba į agarozės šulinį.

Pateikiame gana paprastą atrankos metodą, pagrįstą ląstelių mikrokultūrų (leukocitų arba makrofagų) formavimu standartiniu plotu ir ląstelių skaičiumi 96 šulinėlių plokščiadugnės plokštelės šulinių apačioje, po to jų kultivavimu maistinėje terpėje. ir šių mikrokultūrų ploto pokyčio nustatymas veikiant MIF (Suslov A.P., 1989).

7-3 laboratorija

MITO veiklos apibrėžimas

MIF biologinio aktyvumo nustatymas atliekamas naudojant ląstelių mikrokultūrų formavimo prietaisą (7.7 pav.) - MIGROSCRIN (Rusijos medicinos mokslų akademijos N. F. Gamaleya pavadintas epidemiologijos ir mikrobiologijos tyrimų institutas).

1. Į 96 šulinėlių plokštelės šulinukus (Flow, UK ar panašiai) įpilkite 100 µl mėginio, praskiesto auginimo terpėje, kuriame nustatomas MIF aktyvumas (kiekvienas skiedimas 4 lygiagrečiais, eksperimentiniai mėginiai). Auginimo terpėje yra RPMI 1640, 2 mM L-glutamino, 5% galvijų vaisiaus serumo, 40 μg/ml gentamicino.

2. Į kontrolinius šulinėlius įpilkite auginimo terpės (4 lygiagrečiai) 100 µl.

3. Paruošiama pilvaplėvės makrofagų ląstelių suspensija, kuriai 2 hibridinėms pelėms (CBAxC57B1 / 6) F1 į pilvaplėvės ertmę įšvirkščiama 10 ml Hanko tirpalo su heparinu (10 V/ml), pilvas švelniai masažuojamas 2-3 min. . Tada gyvūnas skerdžiamas nupjaunant galvą, kirkšnies srityje atsargiai praduriama pilvo siena, o eksudatas švirkštu įsiurbiamas per adatą. Pilvaplėvės eksudato ląstelės du kartus plaunamos Hanko tirpalu, centrifuguojant jas 10-15 minučių 200 g greičiu. Tada paruošiama ląstelių suspensija, kurios koncentracija yra 10±1 mln./ml terpės RPMI 1640. Skaičiavimas atliekamas Gorjajevo kameroje.

4. Surenkama MIGROSCRIN sistema, kuri yra stovas, skirtas kryptiniam ir standartiniam antgalių fiksavimui su ląstelių kultūromis griežtai vertikali padėtis tam tikrame aukštyje virš 96 šulinėlių kultūros plokštelės šulinėlio centro, taip pat yra 92 antgaliai automatinei pipetei iš Costar, JAV (7.7 pav.).

Įkiškite trikojo kojeles į plokštės kampinius šulinius. Ląstelių suspensija surenkama automatine pipete į antgalius – po 5 μl, nuplaunama nuo ląstelių pertekliaus vieną kartą panardinant į terpę ir vertikaliai įkišama į sistemos stovo lizdus. Užpildytas stovas su antgaliais laikomas kambario temperatūroje 1 valandą ant griežtai horizontalaus paviršiaus. Per šį laiką suspensijos ląstelės nusėda šulinėlių dugne, kur susidaro standartinės ląstelių mikrokultūros.

5. Atsargiai nuimkite antgalių laikiklį nuo plokštės. Plokštelė su ląstelių mikrokultūra dedama griežtai horizontalioje padėtyje CO 2 inkubatoriuje, kur kultivuojama 20 val.. Auginimo metu ląstelės migruoja šulinėlio dugnu.

6. Rezultatų kiekybinis įvertinimas po inkubacijos atliekamas naudojant žiūroninę lupą, vizualiai įvertinant kolonijos dydį okuliaro viduje esančioje skalėje. Mikrokultūros yra apskritimo formos. Tada tyrėjai nustato vidutinį kolonijos skersmenį pagal kolonijų matavimus 4 eksperimentiniuose arba kontroliniuose šuliniuose. Matavimo paklaida yra ±1 mm.

Migracijos indeksas (MI) apskaičiuojamas pagal formulę:

Mėginys turi MITO aktyvumą, jei MI reikšmės yra lygios

Sutartiniam MYTH aktyvumo vienetui (U) atvirkštinė vertė yra lygi didžiausio mėginio (ėminio) praskiedimo vertei, kai migracijos indeksas yra 0,6 ± 0,2.

Biologinis PEO aktyvumasα yra įvertintas pagal jo citotoksinį poveikį transformuotų fibroblastų L-929 linijai. Rekombinantinis TNFa naudojamas kaip teigiama kontrolė, o ląstelės auginimo terpėje naudojamos kaip neigiama kontrolė.

Citotoksinis indeksas (PI) apskaičiuojamas:

kur a- gyvų ląstelių skaičius kontrolėje; b- gyvų ląstelių skaičius eksperimente.

Ryžiai. 7.7. Schema MIGROSCRIN - prietaisai, skirti kiekybiniam ląstelių kultūrų migracijos įvertinimui

Ląstelės nudažomos dažais (metileno mėlynuoju), kuris yra įtrauktas tik į negyvas ląsteles.

Įprastam TNF aktyvumo vienetui imama atvirkštinio mėginio praskiedimo vertė, kuri būtina norint gauti 50 % ląstelių citotoksiškumo. Specifinis mėginio aktyvumas yra aktyvumo savavališkais vienetais 1 ml ir mėginyje esančio baltymo koncentracijos santykis.

Intraląstelinis citokinų dažymas. Ląstelių, gaminančių įvairius citokinus, santykio pokytis gali atspindėti ligos patogenezę ir būti ligos prognozės bei gydymo vertinimo kriterijus.

Intraląstelinio dažymo metodas nustato citokino ekspresiją vienos ląstelės lygyje. Srauto citometrija leidžia suskaičiuoti ląstelių, ekspresuojančių tam tikrą citokiną, skaičių.

Išvardykime pagrindinius tarpląstelinių citokinų nustatymo etapus.

Nestimuliuojamos ląstelės gamina nedidelį kiekį citokinų, kurie, kaip taisyklė, nenusėda, todėl svarbus žingsnis vertinant tarpląstelinius citokinus yra limfocitų stimuliavimas ir šių produktų išsiskyrimo iš ląstelių blokavimas.

Baltymų kinazės C aktyvatorius forbol-12-miristato-13-acetatas (PMA) kartu su kalcio jonoforo jonomicinu (IN) dažniausiai naudojamas kaip citokinų induktorius. Tokio derinio naudojimas sukelia sintezę Didelis pasirinkimas citokinai: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. FMA-IN naudojimo trūkumas yra CD4 molekulių aptikimo limfocitų paviršiuje problema po tokio aktyvavimo. Be to, T-limfocitų citokinų gamyba skatinama naudojant mitogenus (PHA). B ląstelės ir monocitai stimuliuoja

Vienabranduolinės ląstelės inkubuojamos su citokinų gamybos induktoriais ir jų intracelulinio transportavimo blokatoriumi – brefeldinu A arba monenzinu, 2-6 valandas.

Tada ląstelės resuspenduojamos buferiniame tirpale. Fiksavimui pridėti 2% formaldehido, inkubuoti 10-15 min kambario temperatūroje.

Tada ląstelės apdorojamos saponinu, kuris padidina pralaidumą ląstelės membrana, ir nudažyti monokloniniais antikūnais, būdingais nustatytinams citokinams. Preliminarus paviršiaus žymenų (CD4, CD8) dažymas padidina gaunamos informacijos apie ląstelę kiekį ir leidžia tiksliau nustatyti jos populiacijos priklausomybę.

Aukščiau aprašytų metodų taikymas turi tam tikrų apribojimų. Taigi jų pagalba neįmanoma išanalizuoti vienos ląstelės citokinų sintezės, neįmanoma nustatyti citokinus gaminančių ląstelių skaičiaus subpopuliacijoje, neįmanoma nustatyti, ar citokinus gaminančios ląstelės išreiškia unikalius žymenis, ar skirtingus citokinus sintetina skirtingos ląstelės arba tos pačios. Atsakymas į šiuos klausimus gaunamas naudojant kitus tyrimo metodus. Norint nustatyti citokinus gaminančių ląstelių dažnį populiacijoje, naudojamas ribinio praskiedimo metodas ir su fermentais susieto imunosorbento tyrimo ELISPOT variantas (žr. 4 skyrių).

In situ hibridizacijos metodas. Metodas apima:

2) fiksavimas paraformaldehidu;

3) mRNR aptikimas naudojant pažymėtą cDNR. Kai kuriais atvejais citokinų mRNR yra nustatoma pjūviuose naudojant radioizotopų PGR.

Imunofluorescencija. Metodas apima:

1) organo užšaldymas ir kriostato sekcijų paruošimas;

2) fiksavimas;

3) pjūvių apdorojimas fluoresceinu pažymėtais anti-citokinų antikūnais;

4) vizualinis fluorescencijos stebėjimas.

Šie metodai (hibridizacija savo vietoje ir imunofluorescencija) yra greiti ir nepriklauso nuo išskiriamo produkto slenkstinės koncentracijos. Tačiau jie nenustato išskiriamo citokino kiekio ir gali būti techniškai sudėtingi. Būtina įvairiai atidžiai stebėti nespecifines reakcijas.

Taikant pateiktus citokinų vertinimo metodus, nustatyti patologiniai procesai, susiję su įvairių lygių citokinų sistemos sutrikimais.

Taigi citokinų sistemos įvertinimas itin svarbus apibūdinant organizmo imuninės sistemos būklę. Skirtingų citokinų sistemos lygių tyrimas leidžia gauti informacijos apie skirtingų tipų imunokompetentingų ląstelių funkcinį aktyvumą, uždegiminio proceso sunkumą, jo perėjimą į sisteminį lygmenį, ligos prognozę.

Klausimai ir užduotys

1. Išvardykite bendrąsias citokinų savybes.

2. Pateikite citokinų klasifikaciją.

3. Išvardykite pagrindinius citokinų sistemos komponentus.

4. Išvardykite citokinus gaminančias ląsteles.

5. Apibūdinkite citokinų receptorių šeimas.

6. Kokie yra citokinų tinklo veikimo mechanizmai?

7. Papasakokite apie citokinų gamybą įgimtoje imuninėje sistemoje.

8. Kokie pagrindiniai metodai kompleksiniam citokinų sistemos įvertinimui?

9. Kokie yra kūno skysčių citokinų tyrimo metodai?

10. Kokie yra citokinų sistemos defektai sergant įvairiomis patologijomis?

11. Kokie yra pagrindiniai IL-1, IFN, MIF, TNFa biologinio tyrimo metodai biologiniuose skysčiuose?

12. Apibūdinkite citokinų tarpląstelinio kiekio nustatymo procesą.

13. Apibūdinkite vienos ląstelės išskiriamų citokinų nustatymo procesą.

14. Apibūdinkite metodų, naudojamų nustatant defektą citokinų receptoriaus lygyje, seką.

15. Apibūdinkite metodų, naudojamų defektui nustatyti citokinus gaminančių ląstelių lygyje, seką.

16. Kokią informaciją galima gauti tiriant citokinų gamybą mononuklearinių ląstelių kultūroje, kraujo serume?