Coombsov test je metoda laboratorijska istraživanja napravljen utjecajem na hemaglutinaciju. Temelji se na osjetljivosti protutijela na imunoglobuline i enzimske elemente, kao i na njihovoj sposobnosti aglutinacije eritrocita obloženih s C3 ili Lg.

Izravna dijagnoza Coombsa

Koristi se za otkrivanje protutijela ili komponenti komplementa postavljenih na vanjskoj strani stanica. Izravni Coombsov test provodi se prema sljedećim koracima.

Korištenje takvog testa

Izravna Coombsova dijagnoza koristi se u određenim slučajevima, kao što su:

• učinci transfuzije;
• autoimuna hemoliza;
• hemolitička anemija izazvana lijekovima.

Indirektni Coombsov test

Ovom dijagnostikom moguće je otkriti antitijela na stanice u serumu koji se inkubira u pravilu s eritrocitima donora tipa 0, a zatim se provodi izravni test. Primijenite neizravnu Coombsovu dijagnostiku u sljedećim slučajevima:

Kako se pripremiti za analizu

Postoje neka pravila za pripremu ankete.

1. Ako je pacijent novorođenče, roditelji trebaju znati da će testiranje pomoći u dijagnosticiranju HN (hemolitička bolest novorođenčeta).
2. Ako pacijent ima sumnje na hemolitičku anemiju, treba mu objasniti da će mu analiza omogućiti da otkrije je li uzrokovana zaštitnim poremećajima, lijekovima ili drugim čimbenicima.
3. Coombsov test, izravan i neizravan, ne postavlja nikakva prehrambena ograničenja ili ograničenja u prehrani.
4. Potrebno je obavijestiti pacijenta da će mu se uzeti krv iz vene za pretragu, te mu reći kada će se točno obaviti venepunkcija.
5. Također biste trebali biti upozoreni na vjerojatnost nelagode tijekom razdoblja previjanja ruke i samog postupka.
6. Lijekove koji mogu utjecati na rezultat uzorka treba prekinuti.

Ovi lijekovi uključuju:

• "Streptomicin";
• "Metildopa";
• "Prokainamid";
• sulfonamidi;
• "Melfalan";
• "Kinidin";
• "Rifampin";
• "Izoniazid";
• cefalosporini;
• "Hidralazin";
• "Klorpromazin";
• "Levodopa";
• "Tetraciklin";
• "Difenilhidantoin";
• "Etosuksimid";
• "Penicilin";
• mefenaminska kiselina.

Vađenje krvi vrši se ujutro natašte.

Kako se događaj održava

Coombsov test se provodi sljedećim redoslijedom:

1. Prilikom dijagnostike kod odraslog pacijenta, nakon venepunkcije uzima se krv u epruvete s EDTA (etilendiamintetraacetat).
2. Novorođenčetu se uzima krv iz pupkovine u čašu s EDTA.
3. Područje uboda se pritisne vatom dok ne prestane krvarenje.
4. Kada se na mjestu venepunkcije pojavi modrica, propisuju se topli oblozi.
5. Nakon vađenja krvi, pacijentu je dopušteno da se vrati na uzimanje lijekova za ustezanje.
6. Roditelje novorođenčeta treba upozoriti da može biti potrebna sekundarna analiza za praćenje dinamike anemije.

Prednosti Coombsovog testa

Takva studija ima neke prednosti, naime:

Nedostaci analize

Pozitivan Coombsov test prilično je naporna metoda ispitivanja, što ukazuje na karakterističnu točnost izvedbe. Pri korištenju se mogu susresti s određenim poteškoćama, posebice u vezi s tumačenjem slabo pozitivnih utjecaja.

Utvrđeno je da pogrešne negativne ili slabo pozitivne reakcije u proizvodnji Coombsovih uzoraka mogu biti posljedica nezadovoljavajućeg aktivnog pranja stanica, slabljenja antiglobulinskog reagensa serumskim ostacima, kao i spojeva nemasnog izgleda, na kojima antiglobulin može biti fiksiran, dok gubi svoju učinkovitost.

Coombsov test ima još jedan nedostatak - nisku stabilnost antiglobulinskog reagensa, čije dobivanje i skladištenje imaju individualne karakteristike, što također otežava numeričku procjenu učinka antiglobulinskog seruma na hemaglutinaciju.

Bolesti koje se mogu otkriti tijekom studije

Coombsova dijagnostika omogućuje otkrivanje određenih vrsta bolesti, kao što su:

• hemolitička bolest novorođenčadi;
• razne transfuzijske reakcije;
• autoimuna hemoliza;
• medicinska hemolitička anemija.

Do danas se Coombsov test smatra prilično popularnim sustavom za testiranje krvi i za odraslu osobu i za novorođenče. Omogućuje prepoznavanje mnogih različitih bolesti.

NA posljednjih godina među pacijentima različite dobi porastao je broj krvnih bolesti i koriste se razne metode i sredstva za njihovo dijagnosticiranje. Coombsov test je Kliničko ispitivanje krvi, a svrha njegovog provođenja je identificiranje određenih organizama koji predstavljaju prijetnju ljudskom zdravlju.

Antitijela se mogu pridržavati i rezultat može biti kršenje stanja imunološki sustav. Izravni Coombsov test je antiglobulinski test koji se izvodi za otkrivanje antitijela pričvršćenih na površinu crvenih krvnih stanica.

Obično stručnjaci pribjegavaju testu na antitijela u sljedećim situacijama:

• Potreba za transfuzijom krvi. Iz školskog tečaja anatomije poznato je da osoba može imati jednu od četiri krvne grupe. Provođenje antiglobulinskog testa omogućuje vam određivanje mogućnosti transfuzije krvi u drugi organizam. Može se reći da pacijent može postati darivatelj za transfuziju samo ako njegova krv odgovara tipu bolesnika, odnosno sadrži iste antigene. U slučaju da pacijent i darivatelj imaju razliku u antigenima, to može dovesti do uništenja transfuziranih stanica od strane imunološkog sustava. Posljedica toga može biti razvoj ozbiljnih bolesti i komplikacija, pa čak i smrt. Zbog toga se važna uloga pridaje pronalaženju prave vrste krvi kada je potrebno transfuzirati.
• Određivanje rizika od Rh senzibilizacije. moderna medicina definira Rh kao antigen, a njegova puna definicija je pojam "Rh faktor". Zahvaljujući Coombsovom testu, moguće je dijagnosticirati prisutnost antitijela na Rh faktor u krvi žena tijekom. U slučaju da buduća majka ima negativan Rh faktor, a otac je pozitivan, tada nerođeno dijete može naslijediti bilo koji od njih. Ako se kod nerođenog djeteta otkrije pozitivan Rh faktor, povećava se rizik od razvoja Rh senzibilizacije - to je proces miješanja krvi i majke tijekom trudnoće ili poroda.

U slučaju da postoji nekompatibilnost između skupine majke i djeteta, tada imunološki sustav žensko tijelo počinje percipirati fetus kao strano tijelo i vrši sve vrste napada na njega. Rezultat toga može biti razvoj teške patologije kod djeteta, koja se naziva eritroblastoza. U nekim slučajevima, u odsutnosti učinkovito liječenje fetalna smrt nastupa u maternici ili neposredno nakon rođenja.

U nekim slučajevima provodi se Coombsov test za otkrivanje autoimunih hemolitičkih bolesti.

Takva je bolest prilično rijetka i manifestira se stvaranjem eritrocitnih antigena vlastitog tijela.

Stručnjaci razlikuju dvije vrste Coombsovih uzoraka, od kojih se svaki koristi za određene svrhe.

Izravni test. Izravni test u medicinskoj praksi naziva se i izravni antiglobulinski test i uz njegovu pomoć moguće je dijagnosticirati antitijela pričvršćena na površinu. U nekim slučajevima, proizvodnja takvih antitijela u ljudskom tijelu javlja se kao rezultat progresije različitih ili uzimanja takvih lijekovi, kako:

• kinidin
• metildop
• Prokainamid

Opasnost od takvih antitijela leži u činjenici da mogu izazvati razvoj i imati destruktivan učinak na. Ponekad se pribjegava Coombsovom testu kada je potrebno utvrditi uzroke razvoja patologija kao što su anemija i.

Negativan Coombsov test smatra se normalnim.

Indirektni test. Često stručnjaci pribjegavaju provođenju neizravnog Coombsovog testa, koji ima drugo ime "indirektni antiglobulinski test". Glavna svrha ovoga je otkrivanje antitijela na crvena krvna zrnca koja su prisutna u krvnom serumu. Zahvaljujući ovom testu moguće je utvrditi odgovara li krv darivatelja krvi pacijenta ako ju je potrebno transfuzirati. Takva je analiza svojevrsni test kompatibilnosti, a zahvaljujući njegovoj provedbi moguće je izbjeći razvoj neželjene reakcije na krv davatelja.

Obično se takva studija preporučuje ženama tijekom. Neke majke mogu imati antitijela određene klase u tijelu koja mogu prijeći posteljicu u krv nerođenog djeteta. Rezultat takvog procesa može biti hemolitička bolest fetusa, kao i razvoj raznih tijekom trudnoće.

Priprema za postupak i njegovo provođenje

Zahvat obično ne zahtijeva nikakvu posebnu pripremu i može se obaviti u bilo kojem trenutku.

Priprema za dijagnostiku uključuje sljedeće točke:

• u slučaju da će se analiza provesti u novorođenčadi, roditeljima treba objasniti da će uz njegovu pomoć biti moguće dijagnosticirati hemolitičku bolest
• ako se kod bolesnika sumnja na razvoj hemolitička bolest treba objasniti da će takva analiza pomoći u utvrđivanju uzroka njegovog razvoja
• priprema za analizu ne zahtijeva nikakva ograničenja u hrani i prehrani
• prilikom provođenja analize u novorođenčadi, roditelje treba obavijestiti da će biti potrebno uzimanje krvi iz vene, kao i razjasniti vrijeme postupka
• potrebno je obavijestiti pacijenta da se tijekom stavljanja steza i uzimanja krvi može pojaviti nelagoda
• uzimanje lijekova može iskriviti rezultate Coombsovog testa, pa ih treba prekinuti neko vrijeme prije nego što se provede

Prilikom provođenja izravnog Coombsovog testa, krv se uzima iz vene pomoću štrcaljke. Prije početka postupka provodi se temeljita dezinfekcija mjesta uboda, a nakon uzimanja materijala za istraživanje namješta se vata ili sterilna gaza. U slučaju da se analiza provodi u novorođenčadi, tada se uzima krv iz pupkovine.

Kada se nakon vađenja krvi pojavi hematom, na mjesto uboda stavljaju se grijaći oblozi. Nakon postupka pacijent može nastaviti uzimati lijekove.

U laboratoriju se dobivena krv pročišćava i paralelno se vrši odvajanje crvenih krvnih zrnaca.

Uzorak pregledava specijalist koristeći različite serume i Coombsove reagense, za razliku od humanog globulina. U slučaju da se eritrociti ne drže zajedno i ne razvije se aglutinacija, tada možemo govoriti o pozitivnom rezultatu.

Tijekom postupka mogu se pojaviti sljedeće komplikacije:

• razvoj od mjesta uzimanja krvi tijekom studije
• glavobolja, vrtoglavica ili nesvjestica
• razvoj krvarenja ispod kože
• s lošom antimikrobnom obradom kože na mjestu ubrizgavanja povećava se rizik od ulaska infekcije u tijelo

Rezultati istraživanja

Dekodiranje - moguće bolesti

Na zdrava osoba u tijelu nema antitijela na, to jest, normalno ih ne bi trebalo biti. U slučaju da studija pokaže pozitivan test, to može ukazivati ​​na prisutnost antitijela na crvenim krvnim stanicama u tijelu.

Rezultat takvog patološkog stanja može biti uništavanje crvenih krvnih stanica, a obično se razvija:

• sa sustavnim
• s infekcijom mikoplazmom
• s infektivnom mononukleozom
• kod hemolitičke bolesti novorođenčadi
• s hemolitičkom anemijom izazvanom lijekovima
• s kroničnom limfocitnom leukemijom
• s autoimunom hemolitičkom anemijom
• s nekompatibilnošću krvi fetusa i majke

Izravni Coombsov test često se daje ženama tijekom trudnoće kako bi se utvrdila kompatibilnost krvi majke i fetusa. U slučaju da postoji nekompatibilnost majčinog tijela i nerođenog djeteta u pogledu agenasa eritrocita, tada se povećava rizik od razvoja hemolitičke bolesti novorođenčeta.

Rh-pozitivno dijete kod Rh-negativne žene uzrokuje razvoj Rh-sukoba.

Uz takvu patologiju, uništavanje eritrocita nerođenog djeteta događa se anti-rezusnim tijelima majčinog tijela. Nakon što uđu u žensko tijelo, fetalne crvene krvne stanice imaju stimulirajući učinak na majčin imunološki sustav, a rezultat je proizvodnja antitijela na dijete.

Korisni video - hemolitička anemija.

Nastanak takvih u majčinom organizmu dovodi do aglutinacijske tromboze kapilara i ishemijske nekroze fetalnih tkiva. Kao rezultat hemolize eritrocita i razgradnje hemoglobina, opaža se stvaranje toksičnih neizravnih u tijelu fetusa. Oštar pad sadržaja crvenih krvnih stanica u fetusu zbog njihove hemolize dovodi do razvoja bolesti kao što je anemija kod djeteta.

Niske razine i visoke koncentracije bilirubina značajno kompliciraju tijek bolesti. Tijekom trudnoće dijagnosticiraju se mnoge komplikacije, kao što su:

• opasnost od pobačaja
• razvoj krvarenja
• preeklampsija
• anemija
• prijevremeni trudovi

Anti-rezus tijela štite majku, ali u isto vrijeme predstavljaju ozbiljnu prijetnju fetus u razvoju. Zahvaljujući Coombsovom testu, moguće je na vrijeme dijagnosticirati takvo patološko stanje ženskog tijela i propisati pravodobno liječenje. Osim toga, takva analiza pomaže identificirati različite bolesti krvi, čija progresija može dovesti do smrti pacijenta.

Coombs, Morant, Reis predložili su 1945. godine antiglobulinski test namijenjen otkrivanju nepotpunih antieritrocitnih protutijela, a kasnije je nazvan Coombsov test. Suština ove metode leži u činjenici da antiglobulinski serum koji sadrži antitijela na humane imunoglobuline, kada reagira s eritrocitima senzibiliziranim nepotpunim antitijelima, dovodi do njihove aglutinacije.

Ovisno o tome jesu li protutijela fiksirana na površini crvenih krvnih stanica ili su slobodna u krvnoj plazmi, koristi se izravni ili neizravni Coombsov test.

Izravni Coombsov test provodi se u slučajevima kada postoji razlog za vjerovanje da su crvene krvne stanice koje se proučavaju već in vivo su senzibilizirani odgovarajućim antitijelima, tj. u tijelu se dogodila prva faza reakcije - fiksacija protutijela na površini eritrocita, a naknadni dodatak antiglobulinskog seruma uzrokuje aglutinaciju senzibiliziranih stanica.

Pomoću neizravnog Coombsovog testa otkrivaju se nepotpuna antitijela prisutna u testnom serumu. U ovom slučaju reakcija se odvija u dvije faze. Prva faza je inkubacija ispitivanih eritrocita s ispitivanim serumom, tijekom koje se antitijela sadržana u uzorku ispitivanog seruma fiksiraju na površini eritrocita. Druga faza je dodavanje antiglobulinskog seruma.

Do sada se Coombsov test naširoko koristio u laboratorijskoj praksi za dijagnosticiranje imunopatoloških stanja, posebice kod autoimunih hemolitičkih anemija, karakteriziranih razaranjem eritrocita zbog vezanja stanična membrana s protutijelima i (ili) komponentama sustava komplementa. Uz njegovu pomoć detektira se prisutnost Ig G (obično Ig G1 i Ig G3) na membrani eritrocita, koji može aktivirati komplement, a ponekad i komplement (C3d). Međutim, u akutno razdoblje bolesti zbog razaranja eritrocita, koji su bili fiksirani veliki broj antitijela, s hemolitičkom krizom, kao i s nedovoljnom količinom antitijela u kroničnom tijeku bolesti, može se primijetiti negativan direktni Coombsov test.

Mora se naglasiti da neizravni Coombsov test ostaje najbolja metoda individualni odabir medija za transfuziju, jer vam omogućuje da najtočnije odredite individualnu kompatibilnost davatelja i primatelja za antigene eritrocita.

U pregledu svih primatelja organa i tkiva u predtransplantacijskom razdoblju te primatelja krvotvornih matičnih stanica i nakon transplantacije preporučuje se dodatni izravni antiglobulinski test na prisutnost autoantitijela.

Osim u imunohematologiji i transfuziologiji, antiglobulinski testovi imaju široku primjenu u dijagnostici niza patoloških stanja: u hematološkim bolestima, uključujući limfoproliferativne, u sistemske bolesti vezivno tkivo, Sjögrenova bolest, kronična aktivni hepatitis i tako dalje.

Coombsovi testovi aktivno se koriste u medicinskoj genetici i forenzičkoj medicini za određivanje površinskih antigena eritrocita.

Coombsov test je prilično dugotrajna istraživačka metoda koja zahtijeva posebnu pažnju u provedbi. Kada se koristi, postoje neke poteškoće povezane, posebice, s tumačenjem slabo pozitivnih reakcija. Poznato je da lažne slabe pozitivne ili negativne reakcije pri provođenju Coombsovih testova mogu biti posljedica nedovoljno učinkovitog ispiranja eritrocita, neutralizacije antiglobulinskog reagensa tragovima seruma, kao i kontakta s neodmašćenom površinom na koju se može nanijeti antiglobulin. fiksiran, gubi svoju aktivnost. Drugi nedostatak Coombsovog testa je nestabilnost antiglobulinskog reagensa, čija priprema i skladištenje imaju određene značajke, što također otežava kvantifikaciju reakcije hemaglutinacije s antiglobulinskim serumom.

Osim toga, studije koje su proveli A. Holburn, D. Voak i sur. , pokazalo je da pretjerano mućkanje tijekom resuspendiranja suspenzije crvenih krvnih zrnaca može biti uzrok lažno negativnih rezultata. Pogrešni rezultati pri izvođenju antiglobulinskih testova također mogu biti posljedica prisutnosti primjesa antikomplementarnih protutijela u antiglobulinskom reagensu, posebice na komponente komplementa C3d, C3c, C4c i C4d, koje se tijekom inkubacije adsorbiraju na površini testnih eritrocita i stvaraju pojava pozitivnog rezultata.

Ovi se nedostaci mogu lako otkloniti temeljitim pranjem ispitnih uzoraka i kontrolom uvjeta reakcije.

U posljednjem desetljeću, izotonična fiziološka otopina niske ionske jakosti (LISS) korištena je za smanjenje vremena i osjetljivosti neizravnog Coombsovog testa.

Neosporna prednost antiglobulinskih testova, prema nizu autora, je njihova visoka osjetljivost, koja znatno premašuje rezoluciju alternativne metode testovi koji se koriste za otkrivanje neaglutinirajućih protutijela.

Usporedili smo rezoluciju metoda za ispitivanje krvnih seruma na prisutnost nepotpunih protutijela pomoću poliglucina, želatine i antiglobulinskog seruma. U tijeku istraživanja titri nekompletnih anti-D protutijela praćeni su u 140 uzoraka krvnog seruma izoimunih darivatelja želatinskim, poliglucinskim i indirektnim antiglobulinskim testovima. Izjava o ovim metodama provedena je u skladu s općeprihvaćenim metodama.

Utvrđeno je da su metode za otkrivanje senzibilizacije eritrocita anti-D protutijelima po rezoluciji raspoređene na sljedeći način: najosjetljiviji je neizravni Coombsov test, zatim želatinski test, a najmanje informativan je poliglucinski test. Rezultati dobiveni u ovoj seriji eksperimenata u potpunosti odgovaraju literaturnim podacima, što nam omogućuje da zaključimo da je osjetljivost Coombsovih testova dovoljno visoka, što omogućuje identificiranje prisutnosti antieritrocitnih protutijela s visokim stupnjem sigurnosti. u tijelu koje ne uzrokuju aglutinaciju crvenih krvnih stanica.

Međutim, u praksi Coombsovih testova postoje slučajevi kada se nekompletna protutijela ne detektiraju, iako klinička slika bolesti ili prethodna imunizacija upućuju na njihovu moguću prisutnost. U takvim slučajevima može se pretpostaviti da količina protutijela nije dovoljna da bi se taložila antiglobulinskim serumskim protutijelima.

Ovaj zaključak potvrdili smo i vlastitim pokusom, u kojem je metodom analitičke mikroelektroforeze stanica utvrđena prisutnost anti-D protutijela na ispitivanim eritrocitima, koja nisu bila detektirana indirektnim Coombsovim testom. U ovoj seriji eksperimenata antiglobulinski serum je dodan eritrocitima, prethodno inkubiranim sa serumima dobivenim iz krvi imuniziranih darivatelja, tijekom perioda nastanka antitijela u pokretu, tj. u razdoblju kada poznatim metodama, uključujući Coombsov test, u njima nisu otkrivena protutijela.

U provedenim studijama dokaz prisutnosti nekompletnih protutijela na površini eritrocita bila je statistički značajna promjena elektroforetske pokretljivosti senzibiliziranih crvenih krvnih stanica nakon dodatka antiglobulinskog seruma. Treba napomenuti da su naknadno u krvnom serumu svih imuniziranih darivatelja u neizravnom Coombsovom testu otkrivena anti-D protutijela.

Gillerand i sur. također je pokazalo da su antiglobulinski testovi karakterizirani određenim pragom osjetljivosti: pozitivan rezultat se bilježi samo kada je najmanje 500 molekula Ig G fiksirano na površini jednog eritrocita.

Osim toga, postoje dokazi u literaturi da mogući negativni Coombsov rezultat može biti posljedica niskog afiniteta protutijela koja senzibiliziraju crvene krvne stanice, zbog čega se one lako eluiraju s površine crvenih krvnih stanica tijekom procesa pranja .

S obzirom na navedeno, može se zaključiti da u nekim slučajevima negativan rezultat Coombsovog testa još nije dokaz nepostojanja antitijela fiksiranih na površini eritrocita.

Poznato je da su Coombsove reakcije vrlo specifične i omogućuju otkrivanje većine vrsta nepotpunih protutijela. Međutim, kako pokazuju neki eksperimentalni podaci, antiglobulinski testovi mogu biti pozitivni i u neimunološkim stanjima. E. Muirhead i sur. drugi dan nakon primjene fenilhidrazina, uočeno je da psi imaju pozitivan Coombsov test. Takva brza pojava pozitivne reakcije svjedoči protiv njezine imunološke prirode, već je povezana s nespecifičnom adsorpcijom proteina na površini eritrocita.

M. Williams i sur. otkrili su da klavulanska kiselina također može izazvati pozitivnu reakciju, koja je, prema autorima, povezana s nespecifičnom adsorpcijom proteina plazme na površini eritrocita. Sličan učinak zabilježen je i kod liječenja cefalosporinskim antibioticima.

Autori gore navedenih studija naglašavaju neimunološki karakter dobivenih pozitivnih rezultata Coombsovih testova i inzistiraju na tome da su te tvari sposobne izazvati modifikaciju membrana crvenih krvnih stanica, zbog čega eritrociti mogu adsorbirati proteine ​​(osobito, albumin), koji su normalno prisutni u krvnoj plazmi i nemaju svojstva antitijela. Osim toga, moguće je da upravo ksenobiotik, adsorbiran na površini stanice, služi kao veza između stanične membrane i proteina plazme.

Za ispravnu interpretaciju rezultata postavljanja antiglobulinskih testova treba uzeti u obzir i kvantitativni odnos mladih i zrelih eritrocita u perifernoj krvi. Utvrđeno je da se retikulociti izolirani iz tijela u razdoblju pojačane regeneracije eritrona mogu aglutinirati antiglobulinskim serumom.

Pozitivan rezultat izravnog antiglobulinskog testa javlja se i kod raznih patološka stanja popraćena poremećajima imunološkog sustava, upalni procesišto dovodi do nespecifične adsorpcije protutijela različite specifičnosti na membrane eritrocita. Ovo sugerira da molekule Ig G ne stupaju u interakciju sa specifičnim antigenima eritrocita, već su samo fiksirane na površini stanica koje se proučavaju.

Treba imati na umu da je kod postavljanja Coombsovog testa u slučajevima bolesti karakteriziranih razvojem disproteinemije ili pojavom paraproteina pozitivan rezultat posljedica prisutnosti proteina na površini eritrocita koji nemaju svojstva antitijela, što također ukazuje na nedovoljnu specifičnost antiglobulinskih testova s ​​obzirom na prirodu proteina detektiranog uz njihovu pomoć.

Dakle, kako su pokazala brojna istraživanja, pozitivni rezultati izravnih i neizravnih antiglobulinskih testova nisu apsolutni dokaz prisutnosti protutijela, budući da se pozitivne reakcije mogu uočiti i kod različitih patoloških stanja koja nisu povezana s izosenzibilizacijom ili autosenzibilizacijom organizma. Stoga samo usporedba rezultata nekoliko imunoseroloških metoda s kliničkom slikom bolesti omogućuje nam da u potpunosti prosudimo razvoj patološkog procesa.

Pozitivan neizravni antiglobulinski test s negativnim izravnim testom obično ukazuje na prisutnost slobodnih aloantitijela u ispitivanom serumu, povezanih s prethodnim transfuzijama krvi ili trudnoćama.

Coombsov test je često pozitivan tijekom egzacerbacije paroksizmalne noćne hemoglobinurije; pozitivan Coombsov test s anti-C3 i anti-C3dg je marker bolesti hladnog aglutinina.

U slučajevima kada postoji visok rizik od razvoja hemolitičke bolesti novorođenčeta, za postavljanje dijagnoze od velike su važnosti rezultati izravnih i neizravnih antiglobulinskih testova (najčešće tijekom trudnoće), a po potrebi i dinamičko praćenje izgleda i promjena u titru antitijela. Najčešće je hemolitička bolest novorođenčadi povezana s nekompatibilnošću majke i fetusa za antigen D, rjeđe za antigene AB0 sustava, a još rjeđe za druge antigene (C, c, K itd.). Dobivena antitijela la, budući da su u pravilu nepotpuna antitijela klase Ig G, jasno se otkrivaju u neizravnom antiglobulinskom testu. Kod ove bolesti od velike je važnosti pravilno utvrđen titar i specifičnost otkrivenih protutijela, budući da postoji određena korelacija između razine antieritrocitnih protutijela u krvi trudnice i moguća prognoza ozbiljnost hemolitičke bolesti.

Također je potreban neizravni Coombsov test klinička praksa kako bi se osigurala sigurna transfuzijska terapija. Njegova provedba obvezna je komponenta imunohematoloških studija davatelja i različitih kategorija primatelja, kao i rutinskih pregleda svih pacijenata medicinskih ustanova kojima je možda potrebna transfuzija krvi i njezinih komponenti.

Indirektni antiglobulinski test koristi se u sljedećim slučajevima:

Za točnije određivanje Rh pripadnosti (antigen D) s nejasnim rezultatima određivanja Rh faktora drugim metodama (poliglukin, želatina itd.);

Za otkrivanje slabih antigena eritrocita (sustavi Kell, Duffy, Kidd, Lewis itd.) i antitijela na te antigene;

Za detekciju i identifikaciju aloimunih antieritrocitnih protutijela, uključujući protutijela koja uzrokuju hemolitičke posttransfuzijske reakcije;

Utvrditi prisutnost imunoloških protutijela AB0 sustava u transfuzijskim hemolitičkim komplikacijama;

Kao test kompatibilnosti za individualni odabir transfuzirane krvi i njezinih komponenti.

Stoga je Coombsov test važna dijagnostička pretraga koja se koristi u raznim područjima medicine (hematologija, opstetricija, reumatologija, transfuziologija, klinička i laboratorijska dijagnostika itd.). Poznavanje karakteristika Coombsovog testa pomoći će u povećanju pouzdanosti rezultata i pridonijet će ispravnoj interpretaciji laboratorijskih podataka.

Književnost

1. Antitijela. Metode / ur. D. Cathy. — M.: Mir, 1991.

2. Bayramalibeyli I.E., Rahimov A.A., Gadžijev A.B.. // Transfuzijska terapija anemije: udžbenik. vodič za liječnike. - M.: Prakt. medicina, 2005. - S. 105-106.

3. Volkova O.Ya., Fregatova L.M., Levchenko L.B.// Transfuziologija. - 2006. - br. 2. - S. 39-62.

4. Donskov S.I.// Krvne grupe Rhesus sustava: teorija i praksa. - M.: VINITI RAN, 2005. - S. 180-186, 195.

5.Imunoserologija ( propisi) / komp. A.G. Bashlay, S.I. Donskov. — M.: VINITI RAN, 1998.

6.Istraživanje krvnog sustava u kliničkoj praksi / ur. G.I. Kozintsa, V.A. Makarov. — M.: Triada-X, 1997.

7. Levin V.I. O mehanizmu eritrodijereze i eritropoeze tijekom akutnog posthemoragijska anemija: autoref. dis. …kand. med. znanosti. - Minsk, 1968.

8. Rahimov A.A., Bairamalibeyli I.E.. // Osnove dijagnostike, prevencije i liječenja anemije. - M .: GOU VUNMTs Ministarstva zdravstva Ruske Federacije, 2002. - S. 204-209.

9. Chumakova E.D.. // Stvarni problemi hematologija i transfuziologija: materijali VI kongresa hematologa i transfuziologa Republike Bjelorusije, Minsk, 24.-25. svibnja 2007. / ur. A.I. Svirnovsky, M.P. Potapnjev. - Minsk: Republički znanstveni i praktični centar za hematologiju i transfuziologiju, 2007. - S. 50.

10. Coombs R., Mourant A., Race R. // Lancet. - 1945. - God. 2. - 15. str.

11. Freedman J. // J. Clin. Pathol. - 1979. - Vol. 32. - Str. 1014-1018.

12. Holburn A.M. kontrola kvalitete. Metode u hematologiji / ur. I. Cavill. - Edinburg: Churchill Livingstone, 1982. - Sv. 4. - Str. 34-50.

13. Khan S.// CMAJ. - 2006. - Vol. 175, br. 8. - 919. str.

14. Komatsu F.// Nippon Rinsho. - 2005. - Vol. 63 (dodatak 7). - Str. 719-721.

15. Komatsu F.// Nippon Rinsho. - 2005. - Vol. 63 (dodatak 7). - Str. 716-718.

16. Molthan L., Reidenberg M.M., Eihman M.F.// Novi engl. J. Med. —1976. — sv. 277. - Str. 123-125.

17. Muirhead E.E., GrovesM., Brian S. // J. Lab. Clin. Med. —1954. — sv. 44. - Str. 902-903.

18. Rosse W.F.//Hosp. Prac. - 1995. - N 105.

19. Voak D., Downie D., Mooreb. et al. //Biotestovi Bull. - 1986. - Vol. 1. - Str. 41-52.

20. Voak D., Haigh T., Downie D. et al. Strojevi za pranje stanica za antiglobulinske testove. Ponovljeno testiranje - nova metoda koja pokazuje neučinkovitost jednog naširoko korištenog stroja - Sorvall CW1-AF2: izvješće Tehničkom ogranku DHSS-a, veljača 1991.

21. Williams M.E., Thomas D., Harman C.P. et al. //Antimikrobna sredstva i kemoterapija. -1985. - Str. 125-127.

22. Zarandona J.M., Yazer M.H. // CMAJ. - 2006. - Vol. 174, br. 3. - Str. 305-307.

Medicinske vijesti. - 2008. - br. 3. - S. 33-36.

Pažnja! Članak je namijenjen medicinskim stručnjacima. Ponovno ispisivanje ovog članka ili njegovih fragmenata na internetu bez hiperveze na izvorni izvor smatra se kršenjem autorskih prava.

Normalno, u krvi nema antitijela na eritrocite.

Direktni Coombsov test je antiglobulinski test (gel aglutinacija, koji omogućuje detekciju kompletnih bivalentnih protutijela), kojim se na površini eritrocita određuju protutijela klase IgG i C3 komponenta komplementa. Tipično, protutijela otkrivena izravnim Coombsovim testom imaju široku specifičnost koja nije povezana s dobro utvrđenim antigenom. Pozitivan direktni Coombsov test jasno ukazuje na prisutnost hemolitičke anemije u bolesnika, iako nemaju svi bolesnici s pozitivnim izravnim antiglobulinskim testom ovu bolest. Otprilike 10% bolesnika s antitijelima ili komponentama komplementa na membrani eritrocita ne može se otkriti izravnim Coombsovim testom (negativan test), ali unatoč tome boluju od autoimune hemolitičke anemije. Da bi se razjasnila specifičnost protutijela u takvim slučajevima, koriste se testovi s njihovim ispiranjem. Izravni Coombsov test, pozitivan samo na komplement, obično je povezan s antitijelima IgM hladnog tipa. U tom slučaju IgM protutijela nisu prisutna na eritrocitima kada bazalna temperatura tijelo. Međutim, s obzirom na to da IgM protutijela aktivno fiksiraju komplement, a komplement ostaje na eritrocitima, kod ovog oblika autoimune hemolitičke anemije (bolest hladnog aglutinina) Coombsov test će biti pozitivan samo na komplement.

Izravni Coombsov test pozitivan je kod autoimune hemolitičke anemije uzrokovane toplim protutijelima, autoimune medikamentozne anemije (prilikom uzimanja metildope do 20% bolesnika ima pozitivnu reakciju), adsorpcijskog tipa hemolitičke anemije, imunokompleksnog tipa hemolitičke anemije ( test pozitivan samo na C3), s autoimunom hemolitičkom anemijom uzrokovanom hladnim protutijelima - bolest hladnih aglutinina (test je pozitivan samo na C3). Uz paroksizmalnu hladnu hemoglobinuriju, direktni Coombsov test je negativan.

Indirektni Coombsov test - neizravni antiglobulinski test (otkriva nepotpuna antitijela) omogućuje otkrivanje atipičnih antitijela u krvi, uključujući aloantitijela, na strane antigene eritrocita. Naziv (indirektan) dobio je po tome što se odvija u 2 faze. U početku bolesnikov krvni serum, koji sadrži nepotpuna antitijela, stupa u interakciju s dodanim korpuskularnim Ag dijagnostikumom bez vidljivih manifestacija. U drugoj fazi, uvedeni antiglobulinski serum stupa u interakciju s nepotpunim antitijelima adsorbiranim na antigene, uz pojavu vidljivog taloga. Transfuzija homolognih (alogenih) crvenih krvnih stanica ili trudnoća - većina uobičajeni uzroci stvaranje ovih antieritrocitnih protutijela. Kombinacija pozitivnog neizravnog Coombsovog testa s negativnim izravnim testom ne pomaže u postavljanju dijagnoze autoimune hemolitičke anemije. Pozitivan neizravni Coombsov test uzrokuje određene poteškoće u odabiru krvi za transfuziju i unakrsnom usklađivanju s krvlju iz banke, ali nema drugu dijagnostičku vrijednost.

Antitijela koji se nalazi na površini eritrocita, može biti u statičkom i slobodnom stanju krvna plazma. Ovisno o stanju protutijela provodi se izravna ili neizravna Coombsova reakcija. Ako postoji razlog za vjerovanje da su antitijela fiksirana na površini crvenih krvnih zrnaca, provodi se izravni Coombsov test. U ovom slučaju, test prolazi u jednoj fazi - dodaje se antiglobulinski serum. Ako su nepotpuna protutijela prisutna na površini crvenih krvnih stanica, aglutinacija eritrocita.

Neizravna reakcija

Neizravna Coombsova reakcija odvija se u 2 koraka. Prvo, potrebno je umjetno provesti senzibilizacija eritrocita. Da biste to učinili, eritrociti i krvni serum koji se proučavaju se inkubiraju, što uzrokuje fiksaciju antitijela na površini eritrocita. Nakon toga se provodi drugi stupanj Coombsovog testa - dodavanje antiglobulinskog seruma.

reakcija taloženja - RP (od lat. praecipilo taložiti) je stvaranje i taloženje kompleksa topljivog molekularnog antigena s protutijelima u obliku zamućenja, tzv. talog. Nastaje miješanjem antigena i antitijela u ekvivalentnim količinama, višak jednog od njih smanjuje razinu formiranja imunološkog kompleksa. Reakcija taloženja se stavlja u epruvete (reakcija prstenaste precipitacije), u gelove, hranjive podloge itd. Široko se koriste različite reakcije taloženja u polutekućem gelu agara ili agaroze, dvostruka imunodifuzija prema Ouchterlony, radijeva imunodifuzija, imunoelektroforeza i tako dalje.

HLA tipizacija- proučavanje glavnog histokompatibilnog kompleksa čovjeka - HLA kompleksa. Ova formacija uključuje regiju gena na kromosomu 6 koji kodiraju HLA antigene uključene u različite imunološke reakcije.

Zadaci na HLA tipizacija mogu biti vrlo različiti - biološka identifikacija (HLA tip se nasljeđuje zajedno s roditeljskim genima), određivanje predispozicije za razne bolesti, odabir donora za transplantaciju organa - u ovom slučaju se uspoređuju rezultati HLA tipizacije tkiva donora i primatelja. Uz pomoć HLA tipizacije utvrđuje se koliko su supružnici slični ili različiti po antigenima tkivne kompatibilnosti radi dijagnosticiranja slučajeva neplodnosti.

HLA tipizacija sugerira Analiza HLA polimorfizma a provodi se dvjema metodama – serološkom i molekularno genetičkom. Klasična serološka HLA tipizacija temelji se na mikrolimfocitotoksičnom testu, dok molekularna metoda koristi PCR (lančanu reakciju polimerazom).

Serološki HLA tipizacija izvedena na izoliranim staničnim populacijama. Antigene glavnog histokompatibilnog kompleksa nose uglavnom limfociti. Stoga se kao glavni nositelji antigena klase I koristi suspenzija limfocita T, a za određivanje antigena HLA klase II suspenzija limfocita B. Za izolaciju željenih staničnih populacija iz cijele krvi koristi se ili centrifugiranje ili imunomagnetsko odvajanje. Vjeruje se da prva metoda može dovesti do lažno pozitivnih podataka, jer neke od stanica u ovom slučaju umiru. Druga metoda je prepoznata kao specifičnija - dok više od 95% stanica ostaje održivo.

Ali osnova za postavljanje limfocitotoksičnog testa HLA tipizacija je specifični serum koji sadrži antitijela na različite alelne varijante HLA antigena I i II klase. Serološki test vam omogućuje određivanje tipa HLA ispitivanjem koji od seruma reagira s limfocitima, a koji ne.

Ako dođe do reakcije između stanica i seruma, na površini stanice nastaje kompleks antigen-antitijelo. Nakon dodatka otopine koja sadrži komplement dolazi do lize i smrti stanice. Serološki test HLA tipizacije procjenjuje se pomoću fluorescentne mikroskopije za procjenu pozitivnih (crvena fluorescencija) i negativnih (zelena fluorescencija) reakcija ili fazno kontrastne mikroskopije za bojenje jezgri mrtvih stanica. Rezultat HLA tipizacije izvodi se uzimajući u obzir specifičnost reagiranih seruma i unakrsno reagirajućih skupina antigena, intenzitet reakcije citotoksičnosti.

Nedostaci seroloških HLA tipizacija su prisutnost križnih reakcija, slab afinitet protutijela ili niska ekspresija HLA antigena, odsutnost proteinskih produkata u nizu HLA gena.

Suvremenije, molekularne metode HLA tipizacija koriste se već standardizirani sintetski uzorci koji ne reagiraju s antigenima na površini leukocita, već s DNA i izravno pokazuju koji su antigeni prisutni u uzorku. Molekularne metode ne zahtijevaju živa bijela krvna zrnca, može se proučavati bilo koja ljudska stanica, a za rad je dovoljno nekoliko mikrolitara krvi ili se možete ograničiti na struganje sa sluznice usne šupljine.

Molekularna genetika HLA tipizacija koristi PCR metodu, čiji je prvi korak dobivanje čiste genomske DNA (iz pune krvi, suspenzije leukocita, tkiva).

Uzorak DNK se zatim kopira - umnožava in vitro pomoću početnica (kratke jednolančane DNK) specifične za određeni HLA-lokus. Krajevi svakog para početnica moraju biti strogo komplementarni s jedinstvenom sekvencom koja odgovara određenom alelu, inače ne dolazi do pojačanja.

Nakon PCR-a, tijekom ponovljenog kopiranja, dobiva se veliki broj fragmenata DNA, koji se mogu vizualno procijeniti. Da bi se to postiglo, reakcijske smjese se podvrgavaju elektrolizi ili hibridizaciji, te se pomoću programa ili tablice utvrđuje je li došlo do specifičnog pojačanja. Rezultat HLA tipizacije prikazuje se u obliku iscrpnog izvješća na razini gena i alela. Zbog standardizacije korištenih uzoraka molekularna HLA tipizacija točnije serološki. Osim toga, pruža više informacija (više novih DNA alela) i višu razinu detalja, budući da vam omogućuje identifikaciju ne samo antigena, već i samih alela, koji određuju koji je antigen prisutan u stanici.

imunološka reakcija lize. Reakcija se temelji na sposobnosti specifičnih protutijela da stvaraju imunološke komplekse sa stanicama, uključujući eritrocite, bakterije, što dovodi do aktivacije sustava komplementa duž klasičnog puta i lize stanice. Od imunoloških reakcija lize najčešće se koristi reakcija hemolize, a rjeđe reakcija bakteriolize (uglavnom u diferencijaciji kolere i kolerolikih vibrija).

reakcija hemolize. Pod utjecajem reakcije s protutijelima u prisutnosti komplementa, zamućena suspenzija eritrocita pretvara se u svijetlo crvenu prozirnu tekućinu - "lakiranu krv" zbog oslobađanja hemoglobina. Kod postavljanja dijagnostičke reakcije fiksacije komplementa (RCC) reakcija hemolize se koristi kao pokazatelj: za ispitivanje prisutnosti ili odsutnosti (vezivanja) slobodnog komplementa.

Lokalna reakcija hemolize u gelu(Jerneova reakcija) jedna je od varijanti reakcije hemolize. Omogućuje određivanje broja stanica koje stvaraju antitijela. Broj stanica koje izlučuju protutijela - hemolizine, određen je brojem plakova hemolize koji se javljaju u agar gelu koji sadrži eritrocite, suspenziju stanica proučavanog limfoidnog tkiva i komplement.

Metoda imunofluorescencije

(RIF, reakcija imunofluorescencije) - metoda za detekciju specifičnog Ag (Ab) pomoću Ab (Ag) konjugiranog s fluorokromom. Ima visoku osjetljivost i specifičnost. Koristi se kod ekspresnih infekcija d-ki. bolesti (identifikacija uzročnika u istraživačkom materijalu), kao i za određivanje antitijela i površinskih receptora i markera leukocita (imunofenotipizacija) i dr. stanica. Izravni I. m. sastoji se u obradi dijela tkiva ili razmaza od patološkog materijala ili mikrobne to-ry sa-coy koji sadrži specifična antitijela konjugirana s fluorokromom; lijek se ispere kako bi se uklonila nevezana antitijela i pregleda pod fluorescentnim mikroskopom. U pozitivnim slučajevima, svjetleći imunološki kompleks pojavljuje se oko periferije objekta. Kontrola je neophodna kako bi se isključila nespecifična luminiscencija. Na neizravni. Ih. u prvoj fazi se isječak tkiva ili bris tretira nefluorescentnim specifičnim sredstvom, u drugoj fazi luminiscentnim sredstvom protiv -globulina te životinje koje je primijenjeno u prvoj fazi. U pozitivnom slučaju, formira se svjetleći kompleks koji se sastoji od Ar, At prema njemu i At prema At (sendvič metoda). Uz luminescentni mikroskop, da bi se objasnio RIF tijekom fenotipizacije stanice, laserski razvrstivač ćelija .

protočna citometrija- metoda optičkog mjerenja parametara stanice, njezinih organela i procesa koji se u njoj odvijaju.

Tehnika se sastoji u otkrivanju raspršenja svjetlosti laserske zrake kada stanica prolazi kroz nju u tekućem mlazu, a stupanj disperzije svjetlosti omogućuje vam da dobijete ideju o veličini i strukturi ćelije. Osim toga, analiza uzima u obzir razinu fluorescencije kemijskih spojeva koji čine stanicu (autofluorescencija) ili unesenih u uzorak prije protočne citometrije.

Suspenzija stanica, prethodno obilježena fluorescentnim monoklonskim antitijelima ili fluorescentnim bojama, ulazi u struju tekućine koja prolazi kroz protočnu ćeliju. Uvjeti su odabrani na način da se stanice redaju jedna za drugom zbog tzv. hidrodinamičko fokusiranje mlaza u mlazu. U trenutku kada stanica pređe lasersku zraku, detektori bilježe:

raspršenje svjetlosti pod malim kutovima (od 1° do 10°) ( ovu karakteristiku koristi se za određivanje veličine ćelije).

raspršenje svjetlosti pod kutom od 90 ° (omogućuje procjenu omjera jezgre / citoplazme, kao i heterogenosti i granularnosti stanica).

intenzitet fluorescencije u nekoliko fluorescentnih kanala (od 2 do 18-20) - omogućuje određivanje sastava subpopulacije stanične suspenzije itd.